Расширение цитотоксических Т-лимфоцитов из пуповинной крови, что целевая цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр Вирус, и аденовирус

Резюме

Здесь мы опишем первый надлежащей производственной практики (GMP)-совместимый способ получения вирус-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) из пуповинной крови, источником преимущественно наивных Т-клеток.

Аннотация

Вирус инфекции после трансплантации стволовых клеток являются одними из самых распространенных причин смерти, особенно после пуповинной крови (CB) Трансплантация (CBT), где ЦБ не содержит заметное количество вируса опытный Т-клеток, который может защитить получателя от инфекции ^{1. - 4} Мы и другие показали, что вирус-специфических CTL, полученные от инфицированных доноров и настаивают, чтобы получатель являются безопасными и защитные. ^5-8 Однако, до недавнего времени вирус-специфических Т-клеток, не могли быть получены из пуповинной крови, вероятно, связано с Отсутствие вирус-специфических Т-клеток памяти.

В попытке лучше имитировать в естественных условиях грунтовки наивных Т-клеток, мы создали метод, который использовал CB-дендритных клеток (ДК) трансдуцированных аденовирусные вектора (Ad5f35pp65), содержащих антиген CMV иммунодоминантные РР65, следовательно, вождение Т клеточную специфичность к ЦМВ и аденовирус. ⁹ На инициацию, мы используем эти мазахваченного ДК, а также CB-производных Т-клеток в присутствии цитокинов IL-7, IL-12 и IL-15. ¹⁰ На второй стимуляции мы использовали EBV-трансформированных клеток, или EBV-LCL, которые выражают как скрытых и литические антигены ВЭБ. Ad5f35pp65-трансдуцированных EBV-LCL используются для стимуляции Т-клеток в присутствии ИЛ-15 на второй стимуляции. После стимуляции использовать Ad5f35pp65-трансдуцированных EBV-LCL и ИЛ-2.

Из 50x10 ⁶ CB мононуклеаров мы способны генерировать свыше 150 х 10 ⁶ вирус-специфических Т-клеток, что лизировать антиген-импульсной цели и освобождение цитокинов в ответ на антигенную стимуляцию ^11. Эти клетки были изготовлены в GMP-совместимый способом, используя только 20% доля фракционированного блок пуповинной крови и были переведены для клинического использования.

протокол

1. Мононуклеарные изолятор (день 0)

1. Вставьте всплеск женской Luer адаптер к розетке порта 20% долей единицы пуповинной крови, приложить шприц и удалить кровь. Передача талой крови до 20 мл RPMI нагревают в 50 мл центрифужные пробирки. Промойте мешок пуповинной крови с 5 мл RPMI и трансфер в той же трубке центрифуги.
2. Центрифуга клетки в течение 10 минут при 400 х г. Супернатант.
3. Ресуспендируют клеток в 20 мл теплой RPMI. Слой клеток на 15 мл Lymphoprep в 50 мл центрифужные пробирки. Центрифуга 40 минут при 400 х г.
4. Урожай интерфейс, содержащий мононуклеаров и мыть в 20 мл RPMI. Центрифуга в течение 10 минут при 450 х г.
5. Супернатант и мыть в 20 мл RPMI. Граф клеток и вращаться в течение 5 минут при 400 х г.
6. Супернатант и ресуспендирования клеток в 5 х 10 ⁶ мононуклеарных клеток / мл Cellgenix DC СМИ (без сыворотки). Удалить 1 мл для EBV-LCL поколения и введен в 15 мл сеntrifuge трубку.

2. Дендритные поколения Cell (начиная со дня 0)

1. Plate 2 мл клеток (уже на 5 х 10 ⁶ клеток / мл DC СМИ) на лунку в 6-луночный планшет. Оставить в инкубаторе в течение 1-2 часов.
2. Через 1-2 часа смыть не соблюдают клеток стиральных 3-4 раза с PBS. Сбор не соблюдают клетки и заморозить. Добавить 2 мл / лунку DC средах, содержащих 1000 U / мл IL-4 и 800 ЕД / мл GM-CSF.
3. 3-4 дней после начала постоянного тока, пополнить IL-4 и GM-CSF, добавив 100 мкл / лунку средах, содержащих конечной концентрации 1000U/mL IL-4 и 800 ЕД / мл GM-CSF.
4. В день 5-6, урожай DC, очищая также с передачей пипетки. Граф большие клетки и центрифуги в течение 5 минут при 400 х г. Аспирата СМИ и ресуспендируют постоянного тока на 2х10 ⁶ клеток / мл DC СМИ. Добавить 0,5 мл / лунку в 24-луночный планшет.
5. Преобразовывать постоянный ток использованием Ad5f35pp65 вектора в клетки МВД в инфекционное из 10 единиц. Добавить Vectoг в каждую лунку в 24-луночный планшет. Инкубировать клетки в течение 1,5 часов. Через 1,5 часа, добавить 1,5 мл / лунку DC средах, содержащих: 1000 Ед / мл IL-4, 800 Ед / мл GM-CSF, 10 нг / мл TNF-альфа, 1 мкг / мл PGE-1, 100 нг / мл IL-6, и 10 нг / мл IL-1b. Эти цитокины созревания ДК.

3. Генерация EBV-LCL (начиная со дня 0)

1. Центрифуга пробирку, содержащую 5 х 10 ⁶ мононуклеаров. Добавить 200 мкл концентрированного EBV B95.8 супернатант и 1,8 мл полной среды (RPMI + 10% FBS + 2 мМ L-глутамина), содержащие циклоспорин (1 мкг / мл).
2. Алиготе 100 мкл клеток в 10 скважинах из 96-луночный планшет и 200 мкл на 5 скважинах. Добавить 100 мкл полной циклоспорина СМИ + в лунки, содержащие только 100 мкл клеток. Заполните оставшиеся лунки стерильной водой.
3. Поток LCL еженедельно и расширяться от 96-луночный планшет с 24-луночный планшет после ~ 2 недели. Еще через неделю, трансфер в колбе T25 и в последующей передачей неделюT75 колбу. На этом этапе рекомендуется заморозить аликвоты LCL. Это обычно занимает 1 месяц генерировать достаточное количество LCL.

4. CTL Начало - 7 дней после начала РС

1. Урожай ДК и облучают в дозе 30 Гр. Промойте 4 х и кол. Ресуспендируют DC в Т-клеточных средах, содержащих сыворотки крови человека (45% RPMI, 45% CLICK, 10% человеческой сыворотки, 2 мМ L-глутамина) @ 1 х 10 ⁵ РС / мл.
2. Оттепель не соблюдают клеток, начиная с шага 2.2. Вымойте клетки, и считать. Ресуспендируют на 2 х 10 ⁶ неадгезивные клеток / мл в Т-клеточных средах, содержащих сыворотки крови человека. Добавить 10 нг / мл IL-7 и ИЛ-12, и 5 нг / мл IL-15. Добавить 1 мл клеток на лунку в 24-луночный планшет. Добавить 1 мл DC на лунку. Заполнить пустые лунки 24-луночный планшет с стерильной водой.
3. 7 дней после начала Т-клеток, кормов и / или разделение клеток с Т СМИ ячейку, содержащую сыворотки крови человека.
4. 9-12 дней после начала Т-клеток, замораживать Т-клеток до LCL готовы.
5. Oсть LCL расширили и пассировать в T75 колбы, преобразовывать LCL путем центрифугирования в течение 5 минут при 400 х г. Добавить вектора осадок клеток в МВД из 100 инфекционных единиц на клетку. Выдержите в течение 1,5 часов. Через 1,5 часа, ресуспендируют в полной среде при 5 х 10 ⁵ LCL / мл и добавляют 2 мл на лунку в 24-луночный планшет ^12.
6. Через 2 дня собрать LCL и облучают при 40 Гр. Промойте 4 х и кол. Ресуспендируют LCL в Т-клеточных средах, содержащих сыворотки крови человека на уровне 2,5 х 10 ⁵ клеток / мл. Добавить 1 мл LCL на лунку в 24-луночный планшет. Кроме того, добавьте 5 х 10 ⁶ LCL к Grex40 устройств культуры, а также 5 нг / мл IL-15 ^13.
7. Урожай Т-клеток. Центрифуга в течение 5 минут при 400 мкг, аспирации супернатант и ресуспендируют в Т-клеточных средах, содержащих сыворотки крови человека на 1 х 10 ⁶ Т-клеток / мл. Добавить 5 нг / мл IL-15 и добавить 1 мл / и Т-клеток (всего 1 х 10 ⁶ клеток T) в LCL, которые уже в 24-луночный планшет. В Grex40, принесиобщего объема средств массовой информации до 30 мл.
8. В день 3-4 после стимуляции, если клетки сливающийся затем разделить их (в пластине) 1:1 и добавляют свежую среду, содержащую 50 Ед / мл IL-2. Если они не вырожденная, то просто аспирации ½ средствах массовой информации и заменить со средствами массовой информации, содержащего 50 ЕД / мл IL-2. В Grex40, аспирации половины средств массовой информации, заменить свежей информации, и добавить 50 Ед / мл IL-2.
9. На 7 день повторять, как в шаге 4,6, но использовать Ил-2 в день стимуляции, а не IL-15.

5. Представитель Результаты

Схема GMP-совместимый FDA утвержденных производственных протокола изображено на рисунке 1. Этот процесс занимает около 50 дней. Типичные методы генерации вирус-специфических Т-клеток, расширить уже существующие ячейки памяти T, однако пуповинной крови не хватает вируса опытный Т-клеток и, следовательно, мы должны наивным премьер-T бывших естественных условиях клетки. Для этого мы используем дендритных клеток, а также цитокинов IL-7, IL-12 и IL-15,необходимые для создания вирусного специфику.

После 3 раздражений, доходность должна быть более 100х10 ⁶ клеток. Если достаточное клетки отсутствуют, дополнительных стимуляций может быть выполнено до нужного количества ЦТЛ имеются. Большинство из этих клеток должна быть CD3 + смесью CD4 + и CD8 + Т-клеток. Там должно быть не менее 15% NK клеток (CD3-/CD56 +) и менее 1% CD19 +-клетки (рис. 2).

Расширенный CTL следует признать антигена РР65 от ЦМВ, Hexon и Пентон от аденовируса, а также многочисленных антигенов EBV, которые выражаются в EBV-LCL. При испытании в анализе ELISPOT, CTL должны выделять больше ИФН-? В ответ на эти антигены, чем никакого отношения антигенов (рис. 3).

CTL также должны лизировать вирусных пептид-импульсной целей, таких взрывов PHA. В ^{51-анализе} выпуска Cr, CTL должны лизировать LCL, CMVpp65-импульсного и аденовирус Hexon и /или Пентон-импульсной цели, но не целевые импульсный, не относящимися к пептидов (рис. 4).

Рисунок 1. Поколение мульти-вирус-специфических CTL из пуповинной крови. Схема, показывающая весь процесс CTL производства из пуповинной крови. Первый пуповинной крови мононуклеаров изолированы от 20% долей фракционированного единица пуповинной крови пуповины. За исключением 5x10 ⁶ клеток, которые сохраняются для поколения LCL, все клетки, которые затем помещают в дендритные клетки средствах массовой информации в течение 1-2 часов, после чего не соблюдают клетки собирали и замораживали. DC затем подаются DC средах, содержащих IL-4 и GM-CSF. После 5 дней культуры, постоянного тока созрел и трансдуцированных аденовирусной вектора, содержащего иммунодоминантные антигена ЦМВ РР65. При инициации, эти постоянного тока в сочетании с не соблюдают клеток, а также цитокинов IL-7, IL-12,и IL-15. На последующих раздражений, то же аденовирусный вектор используется для трансдукции EBV-LCL, которые используются в качестве антиген-представляющие клетки. IL-15 используется на второй стимуляции и IL-2 в дальнейшем.

Рисунок 2. Фенотип в результате Т-клеток. Показан процент живых клеток, включенных в лимфоцитами ворот. CTL являются CD3 + и CD4 + и CD8 +, но в основном CD3-/CD56- и CD19-.

Рисунок 3. Т-клеточной функции. T клеточную специфичность была проверена IFN-γELISPOT. T клетки импульсно перекрывающихся пептидов, охватывающих весь белка Hexon, Пентон, РР65, и не имеет значения антиген IE-1. CTL одно это указывает на СМИ в одиночку. Аутологичные LCL облучали и добавил в 1x10 ⁵ / а. Показана средняя месте формирования Cell CДобавить систему из трех экземплярах скважин.

Рисунок 4. Цитолитическую активность CTL. Способность результате CTL для лизиса целей выражения вирусных антигенов была испытана в ^{51-анализа} Кр. ⁵¹ Cr-меченных аутологичных взрывов PHA были импульсные с перекрывающихся пептидов, охватывающих весь антигена или ⁵¹ Cr-меченных аутологичных LCL были cocultured с CTL. Через 4 часа, гамма-релизе было рассчитывать на гамма-счетчике.

Обсуждение

Данной стратегии, направленные на борьбу с вирусными инфекциями после ТОС могут быть эффективными, но они связаны со значительными токсичности, стоят дорого, и не придают долгосрочную защиту против инфекции позже. На самом деле, использование некоторых противовирусных препаратов ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
RPMI 1640	Invitrogen	21870-076
DC СМИ	CellGenix	20801-0500
EHAA (Medium Нажмите на)	Ирвин Научные	9195
Сыворотке крови человека	Близнецы Био продукты	100-110
Газопроницаемых Cultureware 18	Wilson-Wolf	80040S
IL-2	Хирон (TCH аптека)
Ил-12	NCI / CTEP
IL-15	CellGenix	1013-050
IL-7	R & D	AFL207
IL-1b	R & D	AFL201
IL-6	ЯчейкаGenix	1004-050
GM-CSF	TCH аптеки
IL-4	R & D	AFL204
ФНО-альфа	R & D	AFL210
Ad5f35pp65	BCM CAGT векторного Производственные мощности
Плазменные передачу, с женской Luer адаптер	Устав Медицинский	89-550-66j
Lymphoprep	Nycomed	1114550