שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

Summary

Schistosoma ביצים mansoni הם לגירוי חזק מסוג T helper 2 (Th2) בתגובה החיסונית, מאפיין של דלקת טפיל, אסטמה ודלקת אלרגית. פרוטוקול זה מנצל ס mansoni ביצה הזרקת ליצור CD4 תגובה ציטוקינים Th2-Induced דלקת בריאה, המאופיינת היווצרות גרנולומה ריאות סביב הביצה, eosinophilia והפעלה מקרופאג חלופי.

Abstract

טפילים Schistosoma הם תולעים דם להדביק כ 200 מיליון אנשים ברחבי העולם ^1. זיהום כרוני עם Schistosoma, פתולוגיה חמורה, לרבות סיסטיק הכבד splenomegaly, נגרמת על ידי התגובה החיסונית את הביצים טפיל ולא הטפיל עצמו ^2. ביצי הטפיל לגרום תגובה Th2 מאופיינת בייצור IL-4, IL-5 ו-IL-13, הפעלה חלופית של מקרופאגים ועל גיוס של אאוזינופילים. כאן אנו מתארים זריקת ביצים Schistosoma mansoni כמודל לבחון טפיל ספציפיים תגובות ציטוקינים Th2 בריאה ובלוטות לימפה וניקוז, היווצרות של גרנולומות ריאתי המקיפים את הביצה, ודלקות בדרכי הנשימה.

בעקבות רגישות intraperitoneal ואתגר תוך ורידי, ש ' ביצים mansoni מועברים אל הריאות באמצעות עורקי הריאה שם הם כלואים בתוך parenchyma ריאותגרנולומות על ידי המורכבות של לימפוציטים, אאוזינופילים ומקרופגים מופעל לחילופין ^3-6. קשורה להיווצרות דלקת, גרנולומה של broncho-מכתשיים מקומות, הרחבת קשרי הלימפה מסוג CD4 ו מרוקנים הפעלת תא T ניתן לצפות. כאן בפירוט את הפרוטוקול לבידוד Schistosoma ביצים mansoni מ כבדי נגועים (שונה מ ^7), רגישות ומאתגרת עכברים, לשחזר את אברי (broncho-מכתשיים שטיפה (BAL), ריאות ובלוטות לימפה וניקוז) לניתוח. אנו גם נציג היסטולוגית ונתונים חיסוניות והצעות חיסוניות ניתוח נוסף.

באופן כללי, שיטה זו מספקת במודל vivo לחקור helminth המושרה תגובות חיסוניות בריאה, שהוא החלים רחב המחקר של מחלות דלקתיות, כולל דלקת Th2 helminth, מחלות fibrotic, דלקת אלרגית ואסטמה. היתרונות של מודל זה לחקר typה 2 דלקת ריאות כוללים שחזור של תגובה דלקתית חזקה Th2 בריאה ובלוטות לימפה וניקוז, להקל על הערכה של דלקת בבדיקה היסטולוגית של גרנולומות המקיפים את הביצה, והוא חסר יכולת אחסון לטווח ארוך של הטפיל ביצים.

Protocol

1. טיהור Schistosoma mansoni ביצים

1. להדביק שוויצרי-Webster עכברים עם cercariae schistosome, המהווה את הבמה זיהומיות במחזור החיים Schistosoma ^8. לחלופין, לקבל schistosome נגועים עכברים ממשאב NIAID Schistosomiasis מרכז ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). השאירו עכברים 6-7 שבועות לאחר ההדבקה, ועד אז נקודות, ביצים נמצאים בכבד ניתן לשחזר כמפורט להלן (ראו איור 1).
2. להרדים עכברים עם CO _2, להרטיב עם אתנול 70%. מניחים על גבי העכבר. השתמש מלקחיים קהים ומספריים לחתוך העור הצפק הבסיסית. הכבד בלו, הממוקמת מתחת בית החזה והסרעפת.
3. בשר טחון דק כבדי ולהוסיף 20 מ"ל לכל הכבד של תערובת העיכול, המורכבת collagenase / dispase (0.5 מ"ג / מ"ל), פניצילין (100 U / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS. שים mixtיור ב צינור פלקון 50 מ"ל ו דגירה לילה 37 ° C שאכר.
4. סרכזת התערובת ב 400 דקות XG / 3/20 ° C. בעדינות יוצקים את הנוזל העודף למלא צינורית עם PBS. סרכזת שוב לחזור לשטוף PBS. לאחר צנטריפוגה האחרון, resuspend גלולה ב 25 מ"ל PBS.
5. מסננים את גלולה resuspended דרך המטבח הסטנדרטי מתכתי מסננת (שימוש 50 מ"ל במזרק הבוכנה לכתוש את חתיכות כבד אל תוך כוס זכוכית), ולאחר מכן להעביר את התערובת דרך מסננת דקה (להשתמש במזרק 10 מ"ל לדחוף את התערובת דרך מסננת את הקנס לתוך כוס זכוכית 2).
6. לשים תערובת מתוחה של צינור פלקון 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 XG / 5 דקות / 20 ° C. בזהירות לשפוך את supernatant מבלי לאבד גלולה. Resuspend גלולה ב 3 מ"ל PBS.
7. מערבבים בעדינות על שכבת Percoll 20%, 40 מ"ל של צבע 8 מ"ל Percoll ו 32 מ"ל 0.25M סוכרוז (FW = 342.3 אז 8.56 גרם sucrose/100 מ"ל H ₂ 0).
8. סרכזת 10 דקות / XG 800/20 ° C. פיפטה אתד לבטל את השכבה העליונה של דביקות בתאי הכבד. הסר ביצה גלולה בתחתית עם טפטפת העברת להכניס צינור פלקון 15 מ"ל.
9. לשטוף גלולה 3X ב 10 מ"ל PBS / 1 mM EDTA / 1 מ"מ EGTA הגדרות באמצעות צנטריפוגות: 3 דקות / 30 XG / 20 ° C. Resuspend ב 500 PBS μL.
10. שכבת תערובת על Percoll 25% חדש, 10 מ"ל שיפוע (2.5 מ"ל Percoll ו -7.5 מ"ל 0.25M סוכרוז) באמצעות הגדרות צנטריפוגות: 10 דק '/ 800 XG / 20 ° C.
11. לשטוף 3X ב 10 מ"ל PBS באמצעות הגדרות צנטריפוגות: 3 דקות / 30 XG / 20 ° C.
12. בשנת לשטוף האחרון 10 מ"ל, 100 μL להסיר לספור ביצים. ביצים ליישב במהירות, כך צינור פלקון חייב להיות מעורב גם לפני הוצאת המדגם. לדלל את מדגם 100 μL עם 900 PBS μL. 100 μL של תערובת יש לספור טיפות על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ לנתח (01:10 דילול). רחב נשא טיפים פיפטה יש להשתמש.
13. Resuspend ביצים על 50,000 ביצים / מ"ל ​​PBS. ביצים ניתן לאחסן במשך מספר חודשים ב -80 ° C, מופשר פעם או twicדואר לשימוש. לפני השימוש, לבדוק תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי ביצים הם עדיין שלם (ראה איור. 1).

2. רגישות Intraperitoneal עם ס ' mansoni ביצים: יום: 0

1. להכין ביצים על 5000 eggs/100 PBS μL בצינור מ"ל 5 snapcap. להזרקה, מעריכים ביצים 50% יותר ממה שנחוץ.
2. טען מחט מד ^3/4inch 23 ו מזרק 1 מ"ל עם μL 100 ההשעיה ביצה לכל עכבר. ביצים להתיישב, אז המחט עומס עם ביצים בסמוך לפני השימוש.
3. רוק מזרק הלוך ושוב לערבב ביצים לפני כל הזרקה, ולא להזריק 100 intraperitoneally μL של השעיה לכל עכבר.

3. רטרו מסלולית אתגר תוך ורידי עם ס ' mansoni ביצים: יום 14

1. להכין ביצים לעיל על μL eggs/100 5000.
2. להרדים עכברים בתא מיוחד עם isoflurane (4%), או intraperitoneally עם xylazine (10 מ"ג / ק"ג) קטמין (120 מ"ג / ק"ג). עומק anesthesia נקבע על ידי צביטה של ​​שודד דרכים ולהבטיח שום תגובה פיזית.
3. לאחר הטעינה של מזרק 1 מ"ל ו - 23 מחט מד ^3/4inch עם ביצים, להשתמש במלקחיים כדי לכופף את המחט בזווית של 90 ° עם שיפוע כלפי מטה לתוך זווית. להבטיח כי בועות לא נוכחים.
4. למקם העכבר בצד אחד. לחזור בו העור ולכן העין לא לבלוט, וכן להזרים 100 μL לתוך כלי מאחורי גלגל העין ב 45 מעלות זווית לאף.
5. לסגת המחט להפעיל לחץ קל לשלוט בדימום.

כל התהליכים האלה חייבת להיעשות בזהירות ועכברים חייב להיות במעקב עד שהם להתאושש מן ההרדמה. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​פנסילבניה בעלי חיים טיפול מוסדי ועדת שימוש (IACUC).

4. קציר הניסוי: 22 יום

1. להרדים עכברים עם CO _2.
2. העכבר רטוב עם אתנול 70%, ואת המקום על הגב.
3. שימוש בוטה forcEPS, לתפוס את הבטן העכבר ולעשות חתך קטן בעור. מוציאים בזהירות את העור עם מספריים ולחשוף את בית החזה ואת הצפק.
4. חותכים לפתוח את הצפק. חותכים את אבי העורקים בבטן לשחזר את הדם עם פיפטה פסטר. אחסן על הקרח.
5. להעביר את הכבד עד לחשוף את הסרעפת. שימוש במספריים עדינים לחתוך את הסרעפת. בזהירות לחתוך את בית החזה כדי לחשוף את רקמת הריאות.
6. שחזור בלוטות הלימפה parathymic המנקזים ריאות עם מלקחיים עדינים. אלה תחוב תחת כלוב הצלעות, משני צדי התימוס ^9. חנות על הקרח בתקשורת סטריליים 1mL (DMEM השלימו עם 10% חום מומת סרום עגלים עוברית, 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, כולם זמינים Invitrogen).
7. כדי לשחזר את BAL, ו לנפח את הריאות לניתוח היסטולוגית, אינטובציה intratracheal יש לבצע. לחשוף את קנה הנשימה על ידי העברת בלוטות הרוק בצד, ואת placiמלקחיים עדינים נג תחת קנה הנשימה. שימוש במספריים עדינים, לחתוך חור באמצע קנה הנשימה, והכנס צינור לריאות. לאבטח את צינורות על ידי קשירת חוט כירורגית.
8. צרף PBS-מלא 1 מ"ל במזרק כדי צינורות ו לנפח את הריאות עם 1 מ"ל PBS. בזהירות לאחזר לשטוף BAL עם מזרק. אחסן על הקרח.
9. צרף paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS מזרק 1 מ"ל כדי למלא צינורות ו לנפח את הריאות.
10. הסר את צינורות, ולהדק את החוט כירורגית, כדי למנוע דליפה של PFA.
11. בזהירות לנתח את רקמת הריאות ומכניסים 50 מ"ל פלקון צינורית עם 5 מ"ל PFA 4%.

5. אופן ההכנה של רקמות ששוחזרו

1. סרום: אחסון הבאה על קרח שעות 30 דקות ל 2 עבור לקרישת הדם, סרום הוא התאושש מן הדם על ידי צנטריפוגה (13,000 XG / 10 דקות / 4 ° C). סרום מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש ELISAs ציטוקינים או ס mansoni ביצה אנטיגן ספציפי IgG isotype ELISAs ^{6, 10.}
2. בלוטות הלימפה: המתלים תא בודד מוכנים וספירת התאים השתמשו כדי להעריך את עוצמת התגובה החיסונית. כדי לבחון את הקיטוב תא Th2, התאים מחדש מגורה עם ס ' mansoni אנטיגן הביצה במשך 72 שעות. מכתים ציטוקינים Intracellar ניתן לבדוק על ידי cytometry הזרימה, supernatants ניתן לשחזר ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס במשך ELISA של ציטוקינים Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) ^6.
3. BAL: תאים הם pelleted (400 XG / 5 דקות / 4 ° C). נוזל BAL הוא התאושש ומאוחסנים ב -20 ° C לניתוח של ציטוקינים Th2 ידי ELISA. של באל ספירת תאים משמשים readout לדלקת דרכי הנשימה. ההכנות Cytocentrifuge של 10,000-100,000 תאים (500 סל"ד / 5 דקות / 4 ° C), ואחריו מכתים Diffquik תאפשר ספירה של דלקת לחדור ^{4, 6.} לחילופין, תאים של באל ניתן לבדוק על ידי cytometry זרימה ^6.
4. רקמת הריאה: רקמת הריאה היא storאד בן לילה ב 4 ° C. רקמות קבוע הוא פרפין, מוטבע, מחולק רכוב על שקופיות לניתוח היסטולוגית ו immunofluorescence.

6. נציג תוצאות

בפרוטוקול זה פרטים את כל הצעדים הדרושים כדי (א) להכין מטוהרים Schistosoma ביצים mansoni בשימוש עבור vivo (איור 1), (ii) לרגש ולאתגר עכברים עם ביצים אלה (iii) לשחזר איברים לבדיקה של תגובה דלקתית ריאות. זה במודל vivo reproducibly מניע תגובה דלקתית חזקה ריאות Th2. זה מוצג על ידי דלקת דרכי הנשימה ואת eosinophilia כמו דמיינו ידי ספירת תאים של באל ותכשירים cytocentrifuge (איור 2). H & E-מוכתמים סעיפים הריאות ניתן לבדוק את הביצה הנגרמת גרנולומות (איור 3 א), וכן צביעה של חלקים immunofluorescent ריאה מאפשר הדמיה של מקרופאגים מופעל לחילופין ו Th2 ציטוקינים המושרה גנים כגון Resisכמו פח (RELM) מולקולה α (איור 3 ב). אנטיגן ספציפי CD4 בתגובה ציטוקינים Th2 נבדק על ידי ELISAs של IL-5, IL-4 ו IL-13 של אנטיגן, גירוי התאים הצומת parathymic הלימפה (איור 4).

איור 1 Schistosoma mansoni מודל הביצה הזרקת נציג תמונות של כבדי granulomatous, האופייניים S.mansoni, ביצה הנטל גבוהות, של ביצים S.mansoni מוצגים -.. הגודל הממוצע (L) 120 מיקרומטר ידי (W) 50 מיקרומטר.

איור 2. ס הזרקת mansoni ביצה מניע דלקת דרכי הנשימה. א מספרים סלולריים של באל (X10 ⁵⁾ מתוך נאיביות (N) או S.mansoni (SM) ביצה הזריק לעכברים. * P <0.05. ב 'הכנה Cytocentrifuge של תאים ראש. מק, מקרופגים, איוs, eosinophil; הלימפה, הלימפוציטים. בר, 10 מיקרומטר.

איור 3. ויזואליזציה של גרנולומות ריאתי ומקרופגים מופעל לחילופין המקיפים את הביצה S.mansoni. א גרנולומה ריאתי סביב הביצה Sm (שחור חץ) היה דמיינו H & E-מוכתמים סעיפים ריאה. ב 'מכתים immunofluorescence עבור RELMα (ירוק), הקולטן מנוז (אדום) DAPI (כחול) מגלה לחילופין מקרופאגים משופעלים (חץ לבן) גרנולומה סביב autofluorescent Sm ביצה (חץ שחור). בר, 50 מיקרומטר.

איור 4. S.mansoni אנטיגן ספציפי ביצה ציטוקינים בתגובה Th2. ניקוז parathymic קשרי הלימפה תאים בעכברים תמימים (N) או SM ביצים מוזרק היו מגורה עם Sm </ Em> אנטיגן הביצה במשך 72 שעות, ואחריו ELISA של supernatants של IL-4, IL-5 ו-IL-13. קנה מידה, ng / mL. * P <0.05.

Discussion

כאן, מודל העסקת Schistosoma ביצים mansoni לגרום לדלקת ריאות מסוג 2 מתואר. התכונות האופייניות של הדגם הזה כוללות את התגובה החיסונית חזקה Th2, דלקת דרכי הנשימה היווצרות גרנולומה ריאתי. מאז פרמטרים אלה נשענים על תגובות מסוג CD4 סלולריים Th2 ^11, זהו מודל שימושי כדי לחקור ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	גודל / תיאור	חברה	קטלוג #
Collagenase / Dispase	500 מ"ג	רוש ומדע יישומי	11 097 113 001
הבדל במרכול המה 3 כתמים	לארוז	פישר סיינטיפיק ושות LLC	122-911
DMEM	נוזל	Gibco	11965
פלקון 50 מ"ל	לארוז	בז	352070
Intramedic Tubing PE	0.58 מ"מ	בקטון דיקינסון ושות'	427410
Isoflurane	250 מ"ל	אבוט לבריאות בעלי חיים	52600405
קטמין	100 מ"ג / מ"ל	Fort Dodge, לבריאות בעלי חיים	N / A
הקולטן נוגדנים מנוז	ביוטין	עבד Serotec	MCA2235B
מסננת מתכת	מטבח רגיל מסננת	יעד	לורנטיס
Paraformaldehyde	16%	אלקטרונים Microsc. מדעי	15710
פניצילין / סטרפטומיצין	100x	Gibco	15070
Percoll	1 ליטר	GE Healthcare Biosciences	0891 17 01
RELMα נוגדן	50 מיקרוגרם	Peprotech	500-P214
כירורגי נושא	2.0 USP 100 yds	כירורגי Specialties קורפ	SP118
מחט המזרק	23g, 3/4 אינץ'	BD Vacutainer מעבדה. מד.	305143
ארה"ב תקני בדיקה Sieve	150 מיקרומטר, 0.0059 "	WS טיילר, Inc	ASTME-11, Spec. מס '100
Xylazine	20 מ"ג / מ"ל	שר המשקים	N / A