Con ovuli<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Come<em&gt; In vivo</em&gt; Modello di elminti-indotta infiammazione polmonare

Riepilogo

Schistosoma mansoni uova sono potenti stimolatori del T helper di tipo 2 (Th2) risposta immunitaria, caratteristica di infezioni parassitarie, asma e infiammazione allergica. Questo protocollo utilizza S. mansoni uovo iniezione per generare un CD4 Th2 citochine indotta da risposta infiammatoria nel polmone, caratterizzata dalla formazione di granulomi intorno al polmone l'uovo, eosinofilia e l'attivazione dei macrofagi alternative.

Abstract

Parassiti Schistosoma sono trematodi del sangue che infettano circa 200 milioni di persone in tutto il mondo ^1. In infezione cronica con Schistosoma, la patologia grave, inclusa la fibrosi epatica e splenomegalia, è causata dalla risposta immunitaria alle uova di parassiti piuttosto che il parassita stesso ^2. Uova Parasite indurre una risposta Th2 caratterizzata dalla produzione di IL-4, IL-5 e IL-13, l'attivazione dei macrofagi alternativa e il reclutamento di eosinofili. Qui, descriviamo l'iniezione di uova di Schistosoma mansoni come un modello per esaminare parassita risposte specifiche citochine Th2 nei polmoni e dei linfonodi drenanti, la formazione di granulomi polmonari che circondano l'uovo e l'infiammazione delle vie aeree.

Dopo sensibilizzazione intraperitoneale e sfida endovenosa, S. mansoni uova vengono trasportati al polmone attraverso le arterie polmonari in cui sono intrappolati all'interno del parenchima polmonareda granulomi composti da linfociti, eosinofili e macrofagi attivati ​​alternativamente ^3-6. Associata alla formazione di granulomi, infiammazione nelle bronco-alveolari spazi, l'espansione dei linfonodi drenanti e l'attivazione delle cellule T CD4 si può osservare. Qui dettaglio il protocollo per isolare le uova Schistosoma mansoni da fegati infettati (modificato da ^7), la sensibilizzazione e sfidando i topi, e il recupero degli organi (lavaggio bronco-alveolare (BAL), del polmone e linfonodi drenanti) per l'analisi. Abbiamo anche istologico dati rappresentativi e immunologici e suggerimenti per l'analisi immunologica aggiuntivo.

In generale, questo metodo fornisce un modello in vivo per indagare elminti indotte risposte immunologiche nel polmone, che è ampiamente applicabile allo studio di Th2 malattie infiammatorie comprese le infezioni elminti, malattie fibrotiche, infiammazione allergica e asma. I vantaggi di questo modello per lo studio del tip2 e infiammazione nel polmone includono la riproducibilità di una potente risposta infiammatoria Th2 nei polmoni e linfonodi drenanti, la facilità di valutazione di infiammazione mediante esame istologico dei granulomi circondano l'uovo, e il potenziale di conservazione a lungo termine del parassita uova.

Protocollo

1. Purificante Schistosoma mansoni Eggs

1. Infect svizzero-Webster topi con cercariae schistosoma, che è lo stadio infettivo del ciclo di vita Schistosoma ^8. In alternativa, ottenere schistosoma topi infettati dal Resource Center NIAID schistosomiasi ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). Lasciare topi di 6-7 settimane dopo l'infezione, per cui il tempo-punto, le uova sono presenti nel fegato e può essere recuperato come descritto di seguito (vedi Fig. 1).
2. Euthanize topi con CO _2, e bagnare con il 70% di etanolo. Posizionare il mouse sul retro. Utilizzare pinze smussate e forbici per tagliare via la pelle e del peritoneo sottostante. Excise il fegato, che si trova sotto la gabbia toracica e del diaframma.
3. Finemente macinata fegati e aggiungere 20 ml per fegato di miscela di digestione, composta di collagenasi / dispasi (0,5 mg / ml), penicillina (100 U / ml) e streptomicina (100 ug / ml) in PBS. Mettere MIXTure in una provetta da 50 ml Falcon ed incubare una notte a 37 ° C shaker.
4. Centrifugare miscela a 400 xg / 3 min / 20 ° C. Delicatamente versare il liquido in eccesso e riempire tubo con PBS. Centrifugare e ripetere lavaggio PBS. Dopo l'ultima centrifugazione, Risospendere il pellet in 25 ml di PBS.
5. Filtrare il sedimento risospeso attraverso un filtro metallico standard di cucina (usare una siringa da 50 ml stantuffo per schiacciare i pezzi di fegato attraverso in un bicchiere di vetro), seguita da passare la miscela attraverso un setaccio fine (utilizzare siringa da 10 ml per spingere miscela attraverso il setaccio fine in un bicchiere di vetro secondo).
6. Mettere impasto strained in una provetta da 50 ml Falcon. Centrifugare a 400 xg / 5 min / 20 ° C. Versare con cautela out surnatante senza perdere pellet. Risospendere il pellet in 3 ml di PBS.
7. Overlay mescolare delicatamente su un Percoll 20%, 40 mL di gradiente Percoll 8 ml e 32 ml di saccarosio 0,25 M (FW = 342,3 così 8,56 g sucrose/100 mL H ₂ 0).
8. Centrifugare 10 min / 800 xg / 20 ° C. Pipettare fuori unod scartare gelatinoso strato superiore delle cellule epatiche. Rimuovere uovo pellet in basso con una pipetta di trasferimento e messo in una provetta da 15 ml Falcon.
9. Wash 3X pellet in 10 ml di PBS / EDTA 1 mM / 1 mm impostazioni centrifuga EGTA utilizzando: 3 min / 30 xg / 20 ° C. Risospendere in 500 pl PBS.
10. Mix Overlay su una nuova Percoll 25%, 10 mL gradiente (2,5 ml di Percoll e 7,5 mL saccarosio 0,25 M) utilizzando le impostazioni centrifuga: 10 min / 800 xg / 20 ° C.
11. Lavare 3 volte in 10 ml di PBS utilizzando le impostazioni di centrifuga: 3 min / 30 xg / 20 ° C.
12. Negli ultimi 10 mL di lavaggio, rimuovere 100 ul per contare le uova. Uova risolvere rapidamente, in modo che il tubo Falcon devono essere miscelati bene prima di rimuovere campione. Diluire il campione da 100 ml con 900 microlitri di PBS. 100 microlitri della miscela dovrebbe essere considerato come gocce su un vetrino da microscopio utilizzando un microscopio da dissezione (diluizione 1:10). Wide-foro puntali devono essere utilizzati.
13. Risospendere uova a 50.000 uova / ml in PBS. Le uova possono essere conservati per alcuni mesi a -80 ° C e scongelato una o TWICe per l'uso. Prima dell'uso, ispezionare sotto un microscopio per garantire che le uova sono ancora intatte (vedi fig. 1).

2. Sensibilizzazione intraperitoneale con S. Uova mansoni: Giorno 0

1. Preparare le uova a 5.000 pl eggs/100 PBS in una provetta da 5 mL snapcap. Per l'iniezione, stimano uova 50% più del necessario.
2. Caricare un ago da 23 gauge ^3/4inch e una siringa da 1 ml con 100 microlitri di sospensione uovo al mouse. Uova risolvere, in modo da aghi di carico con le uova immediatamente prima dell'utilizzazione.
3. Roccia siringa avanti e indietro per mescolare le uova prima di ogni iniezione, e iniettare per via intraperitoneale 100 microlitri di sospensione per mouse.

3. Retro-orbitale sfida endovenosa con S. Uova mansoni: Giorno 14

1. Preparare le uova di cui sopra a 5.000 eggs/100 pl.
2. Anestetizzare topi in camera specializzata con isofluorano (4%), o intraperitoneale con xilazina (10 mg / kg) e ketamina (120 mg / kg). Profondità di Anesthesia è determinato dal pizzicamento della zampa e garantendo l'assenza di risposta fisica.
3. Dopo il caricamento della siringa da 1 ml e 23 gauge ^3/4inch con uova, utilizzare forcipe per piegare l'ago con un angolo di 90 ° con la smussatura rivolta verso il basso l'angolo. Assicurarsi che non siano presenti bolle.
4. Posizionare il mouse su un lato. Ritrarre la pelle in modo da sporgere occhio, e iniettare 100 microlitri nei vasi dietro il bulbo oculare in un angolo di 45 ° al naso.
5. Ritirare l'ago ed applicare una leggera pressione per controllare l'emorragia.

Tutte queste procedure deve essere eseguita con cura, e topi deve essere monitorata fino recupero dall'anestesia. Questi protocolli sono stati approvati dalla University of Pennsylvania Institutional Animal Care e del Comitato uso (IACUC).

4. Sperimentale Vendemmia: Day 22

1. Euthanize topi con CO _2.
2. Bagnare con il mouse etanolo al 70%, e il luogo sul retro.
3. Utilizzando blunt forceps, afferrare l'addome del mouse e fare una piccola incisione nella pelle. Rimuovere con cura la pelle con le forbici ed esporre la gabbia toracica e del peritoneo.
4. Tagliare il peritoneo. Tagliare il aorta addominale di recuperare il sangue con una pipetta Pasteur. Conservare su ghiaccio.
5. Spostare il fegato giù per esporre il diaframma. Usare le forbici per tagliare sottili il diaframma. Tagliare con cautela aperta la gabbia toracica per esporre il tessuto polmonare.
6. Recuperare i linfonodi che drenano parathymic il polmone con una pinza fine. Questi sono infilato sotto la gabbia toracica, su entrambi i lati del timo ^9. Conservare il ghiaccio in 1mL mezzi sterili (DMEM supplementato con 10% inattivato al calore siero di vitello fetale, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 2 mM L-glutammina, 50 pM 2-mercaptoetanolo, tutti disponibili da Invitrogen).
7. Per recuperare il BAL, e gonfiare i polmoni per l'analisi istologica, l'intubazione endotracheale deve essere eseguita. Esporre la trachea spostando le ghiandole salivari di lato, e placing pinza sottile sotto la trachea. Utilizzando forbici sottili, tagliare un foro al centro della trachea, e inserire tubi nei polmoni. Fissare tubi legando con filo chirurgico.
8. Fissare PBS-riempita siringa da 1 ml al tubo e gonfiare i polmoni con 1 ml di PBS. Lavare accuratamente recuperare BAL con la siringa. Conservare su ghiaccio.
9. Attaccare 4% paraformaldeide (PFA) in PBS-riempita siringa da 1 ml per il tubo e gonfiare i polmoni.
10. Rimuovere il tubo, e serrare il filo chirurgico per prevenire le infiltrazioni della PFA.
11. Analizzare attentamente le tessuto polmonare e posto in una provetta Falcon 50 ml con 5 ml 4% PFA.

5. Preparazione dei tessuti recuperati

1. Siero: memorizzazione seguito su ghiaccio per 30 minuti a 2 ore alla coagulazione del sangue, siero viene recuperato dal sangue mediante centrifugazione (13000 xg / 10 min / 4 ° C). Il siero è conservato a -20 ° C e può essere utilizzato per l'ELISA citochine o S. mansoni uovo antigene-specifica isotipo IgG ELISA ^{6, 10.}
2. Linfonodi: sospensioni di cellule singole sono preparati e conta delle cellule utilizzate per valutare l'entità della risposta immunitaria. Per esaminare la polarizzazione delle cellule Th2, le cellule vengono ri-stimolate con S. mansoni antigene uovo per 72 ore. Colorazione Intracellar citochina può essere esaminata mediante citometria di flusso, e supernatanti può essere recuperato e conservato a -20 ° C per ELISA di citochine Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) ^6.
3. BAL: Le cellule sono pellettizzato (400 xg / 5 min / 4 ° C). BAL viene recuperato e conservato a -20 ° C per l'analisi di citochine Th2 mediante ELISA. BAL conteggi celle vengono utilizzate come un visualizzatore per infiammazione delle vie aeree. Preparazioni di citocentrifuga 10,000-100,000 cellule (500 giri / min 5/4 ° C), seguita da colorazione Diffquik consentirà enumerazione di infiltrato infiammatorio ^{4, 6.} In alternativa, le cellule BAL può essere esaminata mediante citometria di flusso ^6.
4. Tessuto polmonare: il tessuto polmonare è stored notte a 4 ° C. Tessuto fissato è incluso in paraffina, sezionati e montati su vetrini per l'analisi istologica ed immunofluorescenza.

6. Risultati rappresentativi

Questo protocollo dettagli tutti i passaggi necessari per (i) la preparazione purificata Schistosoma mansoni uova per uso in vivo (Fig. 1), (ii) sensibilizzare e sfidare i topi con queste uova e (iii) recuperare gli organi per l'esame della risposta infiammatoria del polmone. Questo modello in vivo guida riproducibile una potente risposta infiammatoria polmonare Th2. Ciò è dimostrato da infiammazione delle vie aeree e come eosinofilia visualizzati tramite conta delle cellule del BAL e preparati citocentrifuga (Fig. 2). H & E-colorate sezioni polmonari possono essere esaminati per l'egg-indotta granulomi (Fig. 3a), e la colorazione di immunofluorescenza delle sezioni polmonari permette la visualizzazione di macrofagi attivati ​​alternativamente e Th2 citochine indotte geni come resistenzatin-come molecola (RELM) α (Fig. 3b). L'antigene-specifica risposta citochina Th2 CD4 viene esaminata da ELISA per IL-5, IL-4 e IL-13-antigene di cellule stimolate parathymic linfonodi (Fig. 4).

Figura 1 Schistosoma mansoni modello iniezione di uova foto rappresentativi di fegato granulomatose, caratteristiche di alta S.mansoni-uovo oneri, e di uova S.mansoni sono mostrati -.. Dimensione media (L) 120 micron (da W) 50 pm.

Figura 2. S. mansoni iniezione di uova guida infiammazione delle vie aeree. A. Numero di cellule BAL (x10 ⁵⁾ da naïve (N) o S.mansoni (Sm) uovo iniettato nei topi. * P <0,05. B. citocentrifuga preparazione di cellule BAL. Mac, macrofagi; Eos, eosinofili, LINFA, linfociti. Bar, 10 micron.

Figura 3. Visualizzazione di granulomi polmonari e macrofagi attivati ​​alternativamente che circondano l'uovo S.mansoni. A. Granuloma polmonare che circonda l'uovo Sm (freccia nera) è stata visualizzata in H & E-colorate sezioni polmonari. B. colorazione per immunofluorescenza RELMα (verde), recettore del mannosio (rosso) e DAPI (blu) rivela in alternativa macrofagi attivati ​​(freccia bianca) nel granuloma che circonda la autofluorescente Sm uovo (freccia nera). Bar, 50 pm.

Figura 4. S.mansoni uovo antigene-specifica risposta delle citochine Th2. Drenante parathymic cellule linfonodi di topi naïve (N) o uova Sm-iniettata sono state stimolate con Sm </ Em> antigene uovo per 72 ore, seguita da ELISA di supernatanti per IL-4, IL-5 e IL-13. Scala, ng / mL. * P <0,05.

Discussione

Qui, un modello che impiega le uova Schistosoma mansoni di indurre l'infiammazione polmonare di tipo 2 viene descritto. Tratti caratteristici di questo modello includono il potente risposta immunitaria Th2, infiammazione delle vie aeree e la formazione di granuloma polmonare. Dal momento che questi parametri dipendono le risposte delle cellule CD4 Th2 ^11, questo è un modello utile per studiare gli effetti delle cancellazioni proteine ​​specifiche o lineage-specifica sulle risposte delle cell...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Dimensione / Descrizione	Azienda	Catalogo #
Collagenasi / dispasi	500 mg	Roche Applied Science	11 097 113 001
Diff Quik Hema 3 Stain	Imballare	Fisher Scientific Co. LLC	122-911
DMEM	Liquido	Gibco	11965
Falcon 50mL	Imballare	Falco	352070
Intramedic PE Tubi	0,58 millimetri	Becton Dickinson and Co.	427410
Isoflurano	250 mL	Abate Animal Health	52600405
Ketamina	100 mg / mL	Fort Dodge, la salute degli animali	N / A
Recettore anticorpo mannosio	Biotina	ABD Serotec	MCA2235B
Metallic Filtro	Cucina filtro standard	Obiettivo	Laurentiis
Paraformaldeide	16%	Electron Microsc. Scienze	15710
Penicillina / streptomicina	100x	Gibco	15070
Percoll	1 litro	GE Healthcare Biosciences	17 01 0891
Anticorpi RELMα	50 ug	Peprotech	500-P214
Filo chirurgico	2,0 USP 100 yds	Surgical Specialties Corp.	SP118
Siringa con ago	23G, 3/4 di pollice	BD Vacutainer Lab. Med.	305143
USA Standard Testing Sieve	150 pm, 0.0059 "	WS Tyler, Inc.	ASTME-11, Spec. No. 100
Xilazina	20 mg / mL	Maggiordomo	N / A