Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Özet

Schistosoma mansoni yumurta T hücre tip 2 (Th2) immün yanıt, parazit enfeksiyonu karakteristik, astım ve allerjik inflamasyonun güçlü uyarıcılar vardır. Bu protokol S. kullanır CD4 Th2 sitokin bağlı inflamatuar yumurtanın etrafında akciğer granülom oluşumu ile karakterize, akciğerin yanıt, eozinofili ve makrofaj aktivasyonu alternatif oluşturmak için mansoni yumurta enjeksiyon.

Özet

Schistosoma parazitleri dünyada tahminen 200 milyon kişi ¹ enfekte kan kurtları vardır. Schistosoma, karaciğer fibroz ve splenomegali de dahil olmak üzere ciddi patoloji, kronik enfeksiyon oldukça parazitin kendisini ² den parazit yumurtaları için bağışıklık yanıtı kaynaklanır. Parazit yumurtaları, IL-4 üretimini, IL-5, IL-13, makrofaj alternatif aktivasyonu ve eozinofillerin alımı ile karakterize edilen, Th2 tepkisinin uyarılmasından. Burada, parazit özgü akciğer Th2 sitokin yanıtları ve lenf düğümleri, yumurta çevreleyen pulmoner granuloma oluşumu ve hava yolu inflamasyonu incelemek için bir model olarak Schistosoma mansoni yumurta enjeksiyonu açıklar.

Intraperitoneal hassasiyete ve intravenöz meydan, S. ardından mansoni yumurta onlar akciğer parankimi içinde sıkışıp kalırlar pulmoner arterler yoluyla akciğere taşınırlenfositler, eozinofiller ve alternatif aktive makrofajlar ^3-6 oluşan granülomlarlakarakterize. Bronko-alveolar alanlarda granülom oluşumu, inflamasyon ile ilişkili, lenf düğümleri ve CD4 genişleme T hücre aktivasyonu görülebilir. Burada ayrıntı, enfekte ciğeri ⁽⁷ değiştirilerek) den Schistosoma mansoni yumurta tecrit fareler hassasiyet ve zorlu ve analizi için organların (bronko-alveolar lavaj (BAL), akciğer ve lenf düğümleri) kurtarmak için protokol. Biz de temsilcisi histolojik ve ek immünolojik analizi için immünolojik veriler ve öneriler içerir.

Genel olarak, bu yöntem, in vivo modelde, bir parazit enfeksiyonu, fibrotik hastalıkları, alerjik enflamasyon ve astım da dahil olmak üzere Th2 enflamatuar hastalıkların çalışması için genel olarak uygulanabilir olan, akciğer parazit kaynaklı immünolojik yanıtları araştırmak için sağlamaktadır. Tipik bir çalışma için, bu modelde avantajlarıAkciğer e 2 iltihabı akciğer güçlü bir Th2 inflamatuvar yanıt tekrarlanabilirlik ve lenf düğümleri, yumurta çevreleyen granülomların histolojik inceleme ile inflamasyonun değerlendirilmesi kolaylığı ve parazit uzun süreli depolama için potansiyel bulunmaktadır yumurta.

Protokol

1. Schistosoma mansoni Yumurta Arındırıcı

1. Schistosoma yaşam döngüsü ⁸ bulaşıcı aşamasıdır şiştozom cercariae ile İsviçre-Webster fareler bulaştırmak. Alternatif olarak, NIAID Schistosomiasis Kaynak Merkezi (gelen şiştozom bulaşmış farelerde elde http://www.schisto-resource.org/~~V ). Olduğu zaman noktası tarafından, yumurta karaciğer mevcut olan ve aşağıda açıklandığı gibi (bakınız Şek. 1) elde edilebilir, enfeksiyon sonrası 6-7 hafta boyunca fareler bırakın.
2. CO ₂ fareler Euthanize, ve% 70 etanol ile ıslatın. Arka fare yerleştirin. Deri ve altındaki periton kesip künt forseps ve makas kullanın. Göğüs kafesi ve diyafram altında yer alan Özel Tüketim karaciğer,.
3. Ince karaciğerler kıyma ve kolajenaz / dispase (0.5 mg / mL), penisilin (100 U / ml) ve PBS içinde streptomisin (100 ug / ml) oluşan sindirim karışımının karaciğer başına 20 mL, ekleyin. Mikst koyun50 ml Falcon tüp ure ve 37 ° C shaker'da gece inkübe edin.
4. 400 xg / 3 dakika / 20 ° C'de karışım santrifüjleyin Nazikçe aşırı sıvı kapalı dökün ve PBS ile tüp doldurun. Tekrar santrifüj ve PBS yıkama tekrarlayın. Pastör pipetiyle pelet 25 ml PBS içinde, son santrifüj ardından.
5. Ince bir elekten (ince elekten karışımı itmek için 10 ml şırınga kullanmak yoluyla karışımı geçirerek takip standart bir mutfak metalik süzgeç (bir cam behere aracılığıyla lapa karaciğer parçaları için 50 ml şırınga pistonu kullanın) aracılığıyla yeniden süspanse pelet Gerinim İkinci bir cam behere).
6. 50 ml Falcon tüp içinde gergin karışımı koyun. 400 xg / 5 at Santrifüj min / 20 ° C Pelet kaybetmeden süpernatant dikkatlice dökmek. 3 ml PBS içinde Pastör pipetiyle pelet.
7. Bindirme% 20 Percoll üzerine nazikçe karıştırarak, 8 mL Percoll ve 32 mL 0.25M sukroz (FW = 342,3 böylece 8,56 g sucrose/100 mL H ₂ 0), 40 mL gradyanı.
8. 10 dakika / 800 xg / 20 ° C Santrifüj Bir off Pipetid karaciğer hücrelerinin jelatinimsi üst kat atın. Bir transfer pipetle altındaki yumurta pelet çıkarın ve 15 ml Falcon tüp içine yerleştirilmiş.
9. 10 ml PBS / 1 mM EDTA / 1 mM EGTA kullanılarak santrifüj ayarlarda yıkama pelet 3X: 3 dakika / xg 30/20 ° C. 500 uL PBS içinde süspanse edin.
10. 10 dakika / 800 xg / 20 ° C: yeni bir% 25 Percoll, santrifüj ayarları kullanarak 10 ml degrade (2.5 mL Percoll ve 7.5 mL 0.25M sakkaroz) üzerinde Yerleşimi mix
11. Santrifüj ayarları kullanarak 10 ml PBS içinde 3X yıkayın: 3 dak / 30 xg / 20 ° C
12. Son 10 ml yıkama olarak, yumurta saymak için 100 uL kaldırın. Yumurta hızlı bir şekilde çözmek, Falcon tüp örnek çıkarmadan önce iyice karıştırılmalıdır yüzden. 900 uL PBS ile 100 uL örnek sulandırınız. Karışımı 100 uL bir diseksiyon mikroskobu (1:10 seyreltme) kullanarak bir mikroskop lamı üzerine damlacıklar olarak sayılmalıdır. Geniş çaplı iğne ucu kullanılmalıdır.
13. 50.000 yumurta / mL PBS içinde yumurta süspanse edin. Yumurta -80 ° C'de birkaç ay depolanır ve bir veya TWIC çözülmüş olabilirkullanımı için e. Kullanmadan önce, yumurta (bkz. Şekil 1). Hala sağlam olduğundan emin olmak için mikroskop altında incelemek.

2. S. ile intraperitoneal Duyarlılık mansoni Yumurta: Günlük 0

1. 5 ml snapcap tüp içinde 5,000 eggs/100 uL PBS yumurta hazırlayın. Enjeksiyon için gerekli% 50 daha fazla yumurta tahmin ediyoruz.
2. Bir 23 gauge ^3/4inch iğne ve fare başına yumurta süspansiyon 100 mcL ile 1 ml şırınga yükleyin. Yumurta kullanımdan hemen önce yumurta ile, bu nedenle yük iğne yerleşirler.
3. Önce her enjeksiyon için yumurtayı karıştırın ve fare başına süspansiyon intraperitoneal 100 uL enjekte etmek için ileri geri Kaya şırınga.

3. S. ile retroorbital İntravenöz Mücadelesi mansoni Yumurta: 14. Gün

1. 5000 eggs/100 uL itibariyle yukarıda yumurta hazırlayın.
2. Ksilazin (10 mg / kg) ve ketamin (120 mg / kg) ile (% 4) izofluran veya intraperitonal olarak uzman odacık içinde farelerin uyuşturmak. Anest Derinliğihesia ayak yastığı çimdirilmesine ve herhangi bir fiziksel tepki sağlanması ile belirlenir.
3. Yumurta ile 1 ml şırınga ve 23 gauge ^3/4inch iğne yüklemesini takiben, açı içine aşağı bakacak şekilde konik ile 90 ° açı ile iğne bükmek için forseps kullanabilir. Hiçbir kabarcıkları olduğundan emin olun.
4. Bir tarafta fare yerleştirin. Göz çıkıntı ve burun 45 ° açıyla gözün arkasındaki damarların içine 100 uL enjekte böylece cildin geri çekin.
5. Iğneyi çıkartınız ve kanama kontrolü için hafif basınç uygulayın.

Tüm bu prosedürlerde dikkatli yapılmalıdır ve bunlar anestezi kurtarmak kadar farelerin izlenmesi gerekir. Bu protokoller Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

4. Deneysel Hasat: 22 Gün

1. CO ₂ ile fareler Euthanize.
2. Arka% 70 etanol ve yerine ıslak fare.
3. Künt Forc kullanmaeps, fare karın kavramak ve deride küçük bir kesi yapmak. Dikkatle makasla cilt kaldırmak ve göğüs kafesi ve karın zarı ortaya.
4. Periton açın kesin. Bir Pasteur pipeti ile kan kurtarmak için abdominal aort kesin. Buz üzerinde saklayın.
5. Diyafram maruz karaciğer aşağı hareket ettirin. Diyafram kesmek için ince makas kullanın. Dikkatle akciğer dokusunun açığa göğüs kafesinin açık kesti.
6. Ince forseps ile akciğer drenaj parathymic lenf düğümleri kurtarın. Bunlar timus ⁹ her iki tarafında, göğüs kafesinin altında sıkışmış vardır. 1mL steril ortam içinde buz üzerinde deposu (DMEM Invitrogen tüm% 10 ısı-inaktive edilmiş fetal buzağı serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-merkaptoetanol, takviye).
7. BAL kurtarmak ve histolojik analiz için akciğerlerini şişirmek için, zor entübasyon yapılmalıdır. Tarafına tükürük bezlerinin hareket ettirerek trakea Açığa ve placitrakea altında ng ince forseps. Ince makas kullanarak, trakeanın ortasında bir delik ve ciğerlerine tüp yerleştirin. Cerrahi iplik ile bağlayarak boru sabitleyin.
8. Boru için PBS dolu 1 ml şırınga takın ve 1 mL PBS ile akciğerlerini şişirmek. Dikkatle şırınga ile BAL yıkama almak. Buz üzerinde saklayın.
9. Boru için PBS dolu 1 ml şırınga içinde% 4 paraformaldehit (PFA) takın ve akciğerleri şişirmek.
10. Tüp çıkarın ve PFA sızmasını önlemek için cerrahi iplik sıkın.
11. Dikkatle 5 ml% 4 PFA ile 50 ml Falcon tüp akciğer dokusu ve yerde dışarı incelemek.

5.. Kurtarılan Dokular hazırlanması

1. Serum: Kan pıhtılaşma için 30 dakika için 2 saat süreyle buz üzerinde aşağıdaki depolama, serumu (13000 x g / dak 10/4 ° C) santrifüjle kandan geri kazanılır. Serum -20 ° C'de muhafaza edilir ve sitokin ELISA'lar ya S. için kullanılabilir mansoni yumurta antijen spesifik IgG izotip ELISA'larla ^{6, 10.}
2. Lenf düğümleri: Tek hücre süspansiyonları hazırlandı ve hücre sayımı, bağışıklık cevabı büyüklüğü değerlendirmek için kullanılmıştır. Th2'nin kutuplaşma incelemek için, hücrelerin S. ile tekrar uyarılır 72 saat mansoni yumurta antijen. Intracellar sitokin boyama akış sitometresi ile incelendi edilebilir, ve süpernatanlar Th2 sitokinlerin ELISA (IL-4, IL-5, IL-13) ⁶ kurtarılmış ve -20 ° C'de saklanabilir.
3. BAL: Hücreler (400 xg / 5 dak / 4 ° C) pelet vardır. BAL sıvısı ELISA ile Th2 sitokin analizi için iyileşti ve -20 ° C'de saklanır. BAL hücre sayımı hava yolu iltihabı için bir gösterge olarak kullanılır. 10,000-100,000 hücreleri (500 devir / dk 5/4 ° C) arasında Cytocentrifuge preparatlar, Diffquik boyama takiben inflamatuar sayımı ^{4, 6} infiltrasyonu izin verir. Alternatif olarak, BAL hücreler flow sitometri ⁶ tarafından muayene edilebilir.
4. Akciğer dokusunun: Akciğer dokusunun stor olduğunu4 'de bir gece ed ° C. Sabit doku parafine gömülü, kesitli ve histolojik ve immünfloresan analiz için kızaklar üzerinde monte edilebilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bu protokol detayları (i) in vivo kullanımı için Schistosoma mansoni yumurta (Şekil 1), (ii) duyarlı ve bu yumurta ile farelerin meydan saflaştırılmış ve (iii) akciğer inflamatuar yanıtın incelenmesi için organlarını kurtarmak hazırlamak için gerekli tüm adımları. Bu in vivo modelde tekrarlanabilir güçlü bir Th2 akciğer enflamatuvar yanıt yönlendirir. Bu gibi BAL hücre sayımı ve cytocentrifuge preparatları (Şekil 2) görselleştirilmiş hava yolu inflamasyonu ve eozinofili ile gösterilir. H & E boyalı akciğer bölümleri yumurta bağlı granülomlar (Şekil 3a) için muayene ve akciğer bölümlerinin immünofloresan boyama alternatif aktive makrofajlar ve bu tür dirençler gibi Th2 sitokin kaynaklı genlerin görselleştirme sağlar edilebilirkalay gibi molekülü (AHLAK) α (Şekil 3b). Antijene spesifik CD4 Th2 sitokin yanıtı, IL-5 ELISA'lar tarafından incelenmiştir, IL-4 ve antijen-uyarılmış parathymic lenf düğümü hücreleri IL-13 (Şekil 4). Edilir

Şekil 1 Schistosoma mansoni yumurta enjeksiyon modeli Temsilcisi yüksek S.mansoni-yumurta yüklerin karakteristik granülomatöz karaciğerinin resim, ve S.mansoni yumurta gösterilir -.. Ortalama büyüklüğü (L) (W) 50 mikron ile 120 mikron.

Şekil 2. S. mansoni yumurta enjeksiyon hava yolu inflamasyonu sürücüler. A. Naif (N) veya S.mansoni (Sm) yumurta enjekte edilen farelerin BAL hücre sayıları (x10 ^5). * P <0.05. BAL hücrelerinin B. Cytocentrifuge hazırlanması. Mac, MAKROFAJ; Eos, eozinofil; LENF, lenfosit. Bar, 10 mikron.

Şekil 3. Pulmoner granülomlar ve S.mansoni yumurta çevresindeki alternatif aktive makrofajların görselleştirilmesi. A. Sm yumurta (siyah ok) çevreleyen Pulmoner granülom H & E boyalı akciğer bölümlerde görüntülendi. RELMα B. immünofloresan boyaması (yeşil), mannoz reseptörü (kırmızı) ve DAPI (mavi) autofluorescent Sm yumurta (siyah ok) çevreleyen granüloma alternatif aktive makrofajlar (beyaz ok) açığa çıkarır. Bar, 50 mikron.

Şekil 4. S.mansoni yumurta antijen spesifik Th2 sitokin yanıtı. Yumurta enjekte naif (N) veya Sm farelerden parathymic lenf hücrelerinin boşaltılması Sm ile uyarıldı </ Em IL-4, IL-5, IL-13 için süpernatan ELISA ardından 72 saat boyunca> yumurta antijeni,. Ölçek, ng / ml. * P <0.05.

Tartışmalar

Burada, tip 2 akciğer iltihabı teşvik için Schistosoma mansoni yumurta kullanan bir model açıklanmıştır. Bu modelin karakteristik özellikleri güçlü Th2 immün yanıt, hava yolu inflamasyonu ve pulmoner granülom oluşumu vardır. Bu parametreler CD4 Th2 hücre yanıtlarının ¹¹ bağımlı olmaları nedeniyle, bu Th2 hücre yanıtları protein özgü veya soy-spesifik delesyonlar etkilerini araştırmak için yararlı bir modeldir. Burada okuma antijen spesifik Th2 sitokinlerin ölçüm?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif	Boyutu / Açıklama	Şirket	# Kataloğa
Kollajenaz / Dispase	500 mg	Roche Applied Science	11 097 113 001
Diff Quik Hema 3 Leke	Paketlemek	Fisher Scientific Co LLC	122-911
DMEM	Sıvı	Gibco	11965
Falcon 50mL	Paketlemek	Şahin	352070
Intramedic PE Boru	0.58 mm	Becton Dickinson and Co	427410
Izofluran	250 mL	Abbot Hayvan Sağlığı	52600405
Ketamin	100 mg / mL	Fort Dodge, Hayvan Sağlığı	N / A
Manoz alıcı antikorunu	Biotin	AbD Serotec	MCA2235B
Metalik Süzgeç	Standart mutfak süzgeci	Hedef	Laurentiis
Paraformaldehyde	% 16	Elektron Microsc. Bilimler	15710
Penisilin / streptomisin	100x	Gibco	15070
Percoll	1 Litre	GE Healthcare Biosciences	17 01 0891
RELMα antikoru	50 mcg	Peprotech	500-P214
Cerrahi Konu	2.0 USP 100 yds	Cerrahi Uzmanlıkları Corp	SP118
Şırınga İğnesi	23g, 3/4 inç	BD Vacutainer Lab. Med.	305143
ABD Standart Test Elek	150 um, 0,0059 "	WS Tyler, Inc	ASTME-11, Spec. 100 sayılı
Ksilazin	20 mg / ml	Baş uşak	N / A