Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

Summary

אנו מתארים assay איכותי לפקח תחרות חיידקים מתווכת על ידי Aeruginosa Pseudomonas מערכת הפרשת הסוג שישי (T6SS). הבדיקה מסתמכת על ההישרדות / הרג של תאי מטרת coli Escherichia נושאים LacZ-כתב. טכניקה זו היא מתכווננת כדי להעריך את הפעילות / bacteriostasis bactericidal של מיקרואורגניזמים T6SS-מיומנים.

Abstract

מערכות הפרשת VI סוג ב '(T6SSs) הן נאנומכונות המולקולרית המאפשרת לחיידקים גראם שליליים, להובלה ולהזריק חלבונים לתוך מגוון רחב של ^1,2 תאי המטרה. T6SS מורכב של 13 רכיבי ליבה ומציגה דמיון מבני עם זנב הצינור של bacteriophages ^3. Phage משתמש צינור ומכשיר ניקוב לחדור את מעטפת התא של חיידקי היעד ולהזריק DNA. מוצע כי T6SS הוא מכשיר bacteriophage הפוך יצירת נתיב ספציפי במעטפת תא החיידק לנהוג effectors ורעלים אל פני השטח. התהליך יכול לקחת עוד יותר ומכשיר T6SS יכול לנקב תאים אחרים שבה החיידק נמצא במגע, ולכן הזרקת effectors ליעדים אלה. צינור הזנב וחלקי מכשיר התיקתוק של T6SS הם עשו עם חלבוני VgrG HCP ו, בהתאמה ^4,5.

הרבגוניות של T6SS הודגמה דרך היםtudies באמצעות חיידקים פתוגנים שונים. את T6SS cholerae Vibrio יכול לשפץ את cytoskeleton של תאי מארח האיקריוטים ידי הזרקת VgrG "התפתח" נושא C-מסוף יקטין cross-linking תחום ^6,7. עוד דוגמה בולטת תועדה לאחרונה באמצעות aeruginosa Pseudomonas שתוכל למקד ולהרוג חיידקים באופן T6SS תלוי, ולכן מקדם את הקמתה של חיידקים מיקרוביאליים בנישות ספציפיות וסביבה התחרותית ^8,9,10.

במקרה האחרון, שלוש T6SS-מופרשים חלבונים, כלומר Tse1, Tse2 וTse3 זוהו כרעלים המוזרקים בחיידקי היעד (איור 1). התא התורם מוגן מפני השפעה המזיקה של effectors אלה דרך מנגנון אנטי רעל, בתיווך Tsi1, Tsi2 וTsi3 חלבוני החסינות ^8,9,10. פעילות מיקרוביאלית זה יכול להיות במעקב כאשר חיידקי T6SS-מיומנים הם שיתוף טפח על היםolid משטחים בתחרות עם מיני חיידקים אחרים או עם חיידקי T6SS-לא פעילים מאותו המין ^8,11,12,13.

הנתונים הזמינים הדגישו גישה מספרית לבדיקת תחרות חיידקים, כוללים ספירת CFU זמן רבה שתלויה במידה רבה על מקבלים אנטיביוטיים. במקרה של זנים עמידים בפני אנטיביוטיקות כמו פ aeruginosa, שיטות אלה יכולים להיות בלתי הולמים. יתר על כן, עם זיהוי של כ 200 לוקוסים T6SS שונים בלמעלה מ 100 הגנום של חיידקים ^14, כלי מיון נוחים רצויים מאוד. פתחנו assay כי הוא קל לשימוש ואינו דורש חומרי מעבדה סטנדרטיים וחומרים כימיים. השיטה מציעה טכניקה מהירה ואיכותית כדי לפקח על פעילות T6SS התלוי bactericidal / bacteriostasis באמצעות לחץ כתב כטרף (במקרה זה חיידקי Escherichia DH5α) המאפשר-complementation של גן lacZ. בסך הכל, בשיטה זו היא ללפותיק ומאפשר זיהוי מהיר של פנוטיפים T6SS הקשורות בצלחות אגרו. פרוטוקול ניסוי, זה יכול להיות מותאם לזנים אחרים או מיני חיידקים תוך התחשבות בתנאים מסוימים, כגון תקשורת צמיחה, טמפרטורה או זמן של קשר.

Protocol

1. זני חיידקים ותרבויות

1. להנדס תא נמען Escherichia coli (Prey, P) על ידי ההפיכה (באמצעות ₂ CaCl טיפול הסטנדרטי או electroporation) ¹⁵ E. coli תאי DH5α עם פלסמיד המאפשר-complementation של גן lacZ (טבלה 1). פלייט התאים הפכו על צלחות אגרו וריא-Bertani (LBA, אגר 1.5%) המכילים 5-bromo-4-כלורו-β-indolyl-D-galactopyranoside (X-גל) במינון 40 מ"ג / מיליליטר ריכוז סופי ואנטיביוטי מתאימים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולמחרת בבוקר בחר לtransformants הכחול (ראה § 1.3).
2. לגדל את תאי תורם aeruginosa Pseudomonas הT6SS פעילים (ד ⁺⁾ או T6SS-פעיל (D-) (טבלה 1) בלילה בLBA 37 ° C. בדוגמא מובאת כאן השתמשנו פ retS aeruginosa להתאמץ בעלH1-T6SS constitutively פעיל ¹⁶ ומוטציה isogenic עם מחיקה של אשכול גני H1-T6SS (טבלה 1).
3. למחרת, להכין תרבות נוזלית לילה בבקבוק סודה על ידי inoculating שיבוט כחול בהיר בין א ' transformants coli (P) מהצלחת מתוארת ב§ 1.1, ב5 מ"ל של מרק הסויה tryptic (TSB) בתוספת עם האנטיביוטיקה המתאימה. לגדול תחת תסיסה ב 37 מעלות צלזיוס המשך באותה מידה עם מושבה יחידה של (D ⁺⁾ ושל (ד ^-) מהצלחת המתוארת ב§ 1.2.

2. Assay תחרות

1. הכן את צלחות LBA לניסוי למחרת. ודא צלחות אלו יובשו כראוי (או ליד המבער בונזן או בקבינט זרימה שכבתית). הכן "Assay-קלט" (קלט) צלחת לזנים (D ^+), (ד _-), ו (P ). הכן צלחת לזנים "Assay פלט" (פלט) (ד ^- + P) ו( D ^{+ +} P). פרד ולתייג את הצלחות בהתאם.
2. לאחר צמיחה בין הלילה (ראה § 1.3), למדוד את הצפיפות האופטית (OD _600nm) של תרבות חיידקי הקלט (ד ^'-, D ⁺ ו-P) ולחשב את הנפח הנדרש להשגת צפיפות תאים שווי ערך ליחידת OD _600nm 1 של כל זן . לכל תרבות תא "קלט" (ד ^-, D ⁺ ו-P) בתחילה נאסף בצינורות של 1.5 מיליליטר Eppendorf סטריליים.
3. צנטריפוגה את דגימות חיידקים ב13000 סל"ד במהלך דקות 1 בטמפרטורת חדר ולזרוק את supernatant.
4. Resuspend את הכדורים של D ^-, D ⁺ תרבויות, וP, ב100 μl של TSB הטרי על ידי pipetting העדין ולחסן 10 מ"ל של כל אחד Corresponding מתח כנקודה אחת על "הקלט" הצלחת (שהוכן ב§ 2.1).
5. לחסן "הפלט" צלחת (שהוכן ב§ 2.1). לייתר דיוק, לערבב בעדינות 30 μl של ⁽⁺ D) עם 30 μl (P) ו30 μl של (ד ^-) עם 30 מ"ל (P) בשני צינורות Eppendorf נפרדים (שים לב שהתרבויות משמשות הן אלה המתוארים ב§ 2.4) . לחסן 20 μl של התערובות (D ⁺ / P) ו( ד ^- / P) כמו כתמים בודדים על "הפלט" צלחת. אפשר לייבש את הנקודות סמוך מבער בונזן ולמקם את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך תקופה מתאימה של זמן שבמהלך הרג החיידקים מתרחש. במקרה של פ aeruginosa, הרג חיידקים יעיל נצפה לאחר דגירת 5 שעות כאשר משווים לT6SS פעיל עם זן פגום T6SS.

3. תצפית איכותית של tהוא הורג את החיידקים

1. הכן את צלחות LBA המכילים 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​X-gal לreadout של assay. הצלחות תיקראנה "קלט readout" או "R-קלט" כדי לזהות חיידקים מבודדים או "פלט readout" או "R-פלט" לזהות תרבויות חיידקים מעורבות ובכך לקרוא את ביצועי הרג. צלחות אלו צריכים גם להיות מיובשים כהלכה. חלוק את הצלחת בארבעה חלקים שווים על הגב ותסמן חלקים אלה 0, 10 ^-1, 10 ^-2 ו10 ^-3, מייעד את הדילולים של תרבות חיידקים למקום על הצלחות אגרו (ראה § 3.3). הדילול יאפשר הערכה חצי כמותית של יחס חיידקים הכחול / לבן באותה הנקודה.
2. לאסוף עם לולאת סטרילי נקודתי החיידקים הבודדות מהצלחת "קלט" (ראה § 2.4) ו" פלט "צלחת (ראה § 2.5) וresuspend כל מקום בצינורות 1.5 מ"ל Eppendorf שונים המכילים 1 מ"ל של TSB. הנח באפנדורף ייקר בלוק במהלך 30 דקות לresuspend יעילותחיידקים.
3. הכן סדרה של 5 3 פעמי צינורות Eppendorf המכילים 900 μl של TSB ולהמשיך לכל מקום resuspended לעשרה דילולים סידוריים קיפול עד 10 ^-3. הקפד להחליף טיפי פיפטה ולמערבולת 5 שניות בין כל שלב דילול.
4. המשך אל התצפית של הדילולים חיידקיים הוכנו ב§ 3.3 על צלחות שיובשו היטב LBA המכילים 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​X-gal על ידי מתחיל עם מדולל ביותר להשעיה המרוכזת, מה שהופך את "R-הקלט" צלחות אלה ל" "כתמים ואת" קלט הפלט "R-צלחות עבור"-פלט הכתמים "(איור 2). מערבולת בקצרה כל צינור לפני שימשיך לתצפית לשמור השעית חיידקים הומוגנית. לשחזור של התוצאות, 20 μl נקודה בשלושה עותקים בתוך ריבוע (איור 2). היובש היחסי של הצלחת שלך הוא חשוב בשלב זה שכן את הכתמים צריכים להישאר בנפרד מופרד בצלחת ולא לגלוש לכיוון זה.
   כימות של assay התחרות אפשרית גם בשלב זה של הניסוי. בעקבות הצעד 3.3, התפשט 100 μl של 10 ^-3 הדילול על צלחות המכילות 40 מיקרוגרם LBA / מ"ל X-gal. לשחזור של התוצאות, המשך לציפוי בשלושה עותקים לכל נקודה מ" הפלט "צלחת. מקם את צלחות הדילול בלילה 37 (מקבילים לדגירת שעות 16) מעלות צלזיוס חממה. המשך לספירת המושבות הכחולות (תאי P שנותרו בחיים). תוצאות אופייניות שהתקבלו לאחר 5 שעות של תחרות מוצגות באיור 3.
5. השאר את הצלחת הפתוחה (ללא מכסה) בתוך שטח סטרילי כדי לאפשר את ספיגת הנוזלים עודפים בתוך כל מקום.
6. מכניס את צלחת 37 מעלות צלזיוס חממה בן לילה. במהלך זמן דגירה זה, ההרג עדיין מתרחש בתמהיל (D ⁺ / P) מאז שני הזנים עדיין במגע.
7. קח תמונהאו לסרוק את הצלחות שלך לניתוח הפלט (איור 2). איפה הנקודות נשארו ברובם כחולות הוא מציין כי א coli לא נהרג על ידי פ ' aeruginosa. זה מה שקורה כאשר א coli מעורבב עם פ T6SS-פגום מתח aeruginosa (D-) (איור 2, צלחת בפינה הימנית התחתונה).

תוצאות

תוצאות אופייניות מוצגות באיור 1 עם הזנים וריאגנטים המתוארים בטבלה 1. הצלחות שמוצגות בתרשים זה נסרקו לאחר דגירת לילה. את "readout-הקלט" לוחיות להראות דפוס דילול סדרתי לזנים המשמשים בבדיקה זו. כצפוי, ה חיידק טורף נקודות (P) overexpressing גן lacZ מופיעים כחול על תקשורת בתוספת עם X-גל, ואילו התורם פ זני aeruginosa (D ^+, T6SS פעיל) ו( ד ^-, פעיל T6SS) נותר לבן. את "readout-הפלט" צלחות שבתמהיל בין הטרף ומתח פעיל T6SS (D ⁺ / P) נצפה להראות את היעלמותו של הכחול ובכך הטרף המצביעות על זה כבר נהרג. זה מדגים את יכולתו של התורם לoutcompete הטרף. ההתמדה של הצבע הכחול על (ד ^- / P) צלחת מדגימה את חוסר היכולת של תורם T6SS פעיל להרוג טרף הכחול.

איור 1. הריגתו של א coli ידי פ T6SS-בקיא aeruginosa. פ aeruginosa מזריק רעלים לE. coli תא המטרה באופן T6SS תלוי (המוצג על ידי החץ הלבן). שני רעלים Tse1 וTse3 (כתום ועיגול אדום) מוזרקים לתוך E. periplasm coli ולבזות ⁹ peptidoglycan. רעל Tse2 (העיגול צהוב) מוזרק לתוך E. coli ציטופלסמה ויש לו פעילות bacteriostatic ^8,10. הפעולה המשולבת של הרעלים הורגת את תאי המטרה (ברק הגולגולת). ההישרדות של תאי המטרה יכולה להיות מזוהית על ידי ניטור הפעילות של β-גלקטוזידאז הפיק (ראה גם איור 2). פeruginosa מוגן מפני פעילותם של רעלנים על ידי חלבוני חסינות Tsi1, Tsi2 וTsi3 (כתום, ריבועים צהובים ואדומים, בהתאמה) ^8,9,10.

איור 2. assay הצלחת אגר לפקח הרג חיידקי T6SS תלוי בדמות זו מוצגת בחלק העליון את "readout-הקלט" הצלחות המורכבות מהדילולים הסידוריים של D ^-., D ^+, ותאי קלט P. תאי קלט P הם כחולים בשל α-complementation של גן lacZ והפיקו עד β-גלקטוזידאז שדבק X-gal. בחלק התחתון מוצגת את "readout-הפלט" צלחות בהיקף של דילולים סידוריים של התמהיל בין החיידקים הפעילים (D ⁺ / P) , או לא פעיל (ד ^- / P), T6SS התורם פ מתח aeruginosa עם E. coli טרף. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. כימות של ההרג של E. coli על ידי פ aeruginosa לאחר דגירת 5 שעות. הגרף מציג ספירת CFU של E. coli שמתואר בשלב 3.4. התוצאות מוצגות כאן מראים את הבדל בין 3-לקפל T6SS + וT6SS-הזנים, המצביעות על כך שרוב ההרג מתרחש במהלך 5 השעות הראשונות של קשר.

Discussion

השיטה שהוצגה במאמר זה מאפשרת תצפית חזותית של פעילות / bacteriostasis T6SS בתיווך bactericidal. הבדיקה מבוצעת על פני השטח של צלחת אגרה. זה כבר הראה בעבר כי assay ההרג T6SS תלוי הופיע עם תרבות חיידקי נוזל המעורבת הוא לא יעיל, סביר להניח בגלל חוסר קשר יציב בין שני החיידקים ^8. T6SS הוא האמין פעולה עם מנגנון דומה לזו ששמשה את bacteriophages להזריק דנ"א לתוך תאי המטרה ^17. בתרבות של נוזל, המבנה דמוי צינור של T6SS עלול להישבר בקלות רבה יותר, קשר בין החיידקים יכול ללכת לאיבוד, ואת הרעלים לא יעיל מועברים.

במונחים של זמני דגירה, 5 השעות הראשונות של קשר שאנו מתארים בין המתח התורם והטרף מספיקות כדי להתבונן הרג חיידקים בין פ aeruginosa וא coli, כמוצג באיור 3 . עם זאת, רצוי להתאים את זמן הדגירה על ידי ביצוע קינטית על מנת לייעל את תנאי הניסוי.

מאחר ושיטה זו היא טכניקת צבע מבוססת, תוצאות הפלט יכולים להיות בסכנה על ידי פיגמנטציה של זן התורם. לדוגמה, במקרה של פ aeruginosa, זנים מסוימים לייצר רמות גבוהות של פיגמנטים צבעוניים כגון pyocyanin וpyoverdine, אשר יכול להפריע לreadout assay, מה שהופך את ההבחנה מהטרף קשה יחסית. מצעים אחרים chromogenic β-גלקטוזידאז, כמו מגנט גל או גל אדום, יכולים לשמש במקום X-gal (טבלה 1).

Assay התחרות יכול לעשות שימוש בגנים מדווחים אחרים להודעה. לדוגמה, בדיקה דומה גם בוצעה באמצעות ¹² פושט חלבון פלואורסצנטי ירוק שכותרתו.

הבדיקה שלנו, ואילו לא כמותית, נותנת אינדיקציה טובהפעילות T6SS מאחר שהוא מבוסס על ההישרדות או ההרג של טרף כתב. טכניקה זו מציגה את היתרון של להיות קל ונוח להערכת הפעילות / bacteriostasis bactericidal של T6SSs מכל מיני חיידקים. עד כה, הפעילות של T6SS הוכחה כנגד חיידקים גראם שליליים, ואין דוגמה מובהקת לחיידקי T6SS רגישים גראם חיוביים כבר דווח עדיין ^12. זה גם ברור שאי התאמה בתרבות של מיני חיידקים השונים לבדיקה (למשל צמיחת טמפרטורה, חמצון, תקשורת הספציפית) היא להילקח בחשבון.

הבדיקה שלנו יכולה לשמש גם כדי להעריך איזה ממרכיבי T6SS הם חיוניים משום שגם עקבות של רעל מופרש עשויות להיות מספיק כדי להרוג את הטרף. גם פעילות חלשה של T6SS יכולה אז ברורה להיות מזוהית על ידי הבדיקה שלנו, בהשוואה להפרשה סטנדרטית הליך בדיקת T6SS תלוית תרבות באמצעות כתם supernatant והמערביניתוח. עם זאת, יחידת ספירה נכונה מושבת יוצרים (CFU) עדיין נדרשה לכימות מדויק של פעילות T6SS זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
aeruginosa פ PAKΔ retS (D +) (T6SS הפעיל)	זן מעבדה		תאר בעיון 16
פ aeruginosa PAKΔ retS Δ H1-T6SS (ד -) (T6SS לא פעיל)	מחקר זה		אשכול H1-T6SS (הכולל את גני PA0070 לPA0095) נמחק על ידי חילופי allelic ביצוע הנוהל המתואר בעיון 18. הבר המוטטורי נוצר עם הסט הבא של primers: בפריימרים הבר עד: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 ', ו 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 ". את פריימרים הבר מטה: 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 ', 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 '
E.coli DH5α	Invitrogen	18258-012	ה-F-φ80 lac ZΔM15 Δ (Lac ZYA-arg F) U169 rec A1 סוף A1 HSD R17 (r - k, מ 'יא +) Pho sup E44-λ thi -1 gyr A96 rel A1
pBluescript השני SK (+)	Agilent	212205	וקטור זה מבטא את הפפטיד של α β-גלקטוזידאז משמש לα-complementation.
X-gal	Invitrogen	15520-018	השתמש ב 40 מיקרוגרם / מ"ל
אגר וריא Bertani	Merck-כימיקלים	1.10283.0500
TSB (קזאין סויה מרק)	Oxoid	CM109
גאון ורטקס ייקר 3	איקא	3340000
סורק	Epson	V700
ספקטרופוטומטר	WPA Biowave	מד צפיפות תאים CO8000
מגנט גל	Bioworld	30350001-1 (715241)
גל אדום	מחקר אורגני	1364c
			טבלת 1. זנים, חומר ומגיב פלסמיד בשימוש.