T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Özet

Biz aracılık bakteriyel rekabet izlemek için kalitatif bir testtir tarif Pseudomonas aeruginosa Tip VI salgı sistemi (T6SS). Deneyi taşıyan Escherichia coli hedef hücrelerin hayatta kalma / öldürme dayanır LacZ-Muhabiri. Bu teknik T6SS-yetkin mikroorganizmaların bakterisidal / bacteriostasis aktiviteyi değerlendirmek için ayarlanabilir.

Özet

Tip VI salgılama sistemleri (T6SSs) Gram-negatif bakteriler hedef hücrelerin ^1,2 içine çeşitli proteinlerin taşınması ve enjekte izin veren moleküler nanomakineler vardır. T6SS 13 temel bileşenden oluşur ve bakteriyofajlar ³ kuyruk tüp ile yapısal benzerlikler sergilemektedir. Faj bir tüp ve hedef bakterilerin hücre zarfı nüfuz ve DNA enjekte etmek için bir delici aleti kullanır. Bu T6SS yüzeye etkileyiciler ve toksinler sürücü bakteriyel hücre zarf içinde belirli bir yol oluşturarak ters bakteriyofaj cihaz önerilmiştir. Bu süreç ayrıca alınabilir ve T6SS cihaz böylece bu hedeflerin içine enjekte etkileyiciler, bakteri temas halinde olan diğer hücreler ile delebilir olabilir. Kuyruk tüp ve T6SS ve delme cihazı parçaları sırasıyla ^4,5, Hcp ve VgrG proteinler ile yapılır.

T6SS çok yönlülüğü ler ile kanıtlanmıştırçeşitli bakteriyel patojenler kullanarak tudies. Vibrio cholerae T6SS bir C-terminal aktin çapraz-bağlayıcı etki ^6,7 taşıyan bir "gelişmiş" VgrG enjekte ökaryotik konak hücrelerin, hücre iskeleti şeklini olabilir. Bir başka çarpıcı örnek son zamanlarda bu nedenle spesifik mikrobiyal nişler ve rekabetçi bir ortamda ^8,9,10 bakteri kurulması teşvik, bir T6SS-bağımlı bir şekilde bakterileri hedef ve öldürmek mümkün Pseudomonas aeruginosa ile belgelenmiştir.

İkinci durumda, yani üç T6SS-salgılanan proteinler, Tse1, Tse2 ve Tse3 hedef bakteri (Şekil 1) enjekte toksinler gibi tespit edilmiştir. Donör hücre Tsi1, Tsi2 ve Tsi3 bağışıklık proteinleri ^8,9,10 aracılığı ile bir anti-toksin mekanizması yoluyla bu efektörlerinin zararlı etkisi korunmaktadır. T6SS-yetkin bakteriler s co-yetiştirilmektedir Bu antimikrobiyal aktivite izlenebilirDiğer bakteri türleri ile veya aynı türün ^8,11,12,13 arasında T6SS-inaktif bakteri ile rekabet içinde Olid yüzeyler.

Mevcut veriler antibiyotik üreticileri büyük ölçüde bağlıdır zaman alıcı CFU sayma dahil, bakteriyel rekabet tahlil için sayısal bir yaklaşım geliştirilebileceğini vurguladı. P. gibi bir antibiyotiğe dirençli suşların halinde aeruginosa, bu yöntemlerin uygun olabilir. Ayrıca, 100'den fazla bakteriyel genom ¹⁴ yaklaşık 200 farklı T6SS loci kimlik ile, uygun bir tarama aracı son derece arzu edilen bir durumdur. Biz kullanımı kolaydır ve standart laboratuar malzeme ve reaktifler gerektirir bir test geliştirdi. Yöntem lacZ geninin bir tümleme-izin veren bir yem (Bu durumda, Escherichia coli DH5α) gibi bir raportör suşu kullanılarak T6SS-bağımlı bakteri öldürücü / bacteriostasis aktivitesini izlemek için bir hızlı ve nicel teknik sunmaktadır. Genel olarak, bu yöntem bir grapHIC ve agar plaklarına T6SS ilgili fenotipleri hızla tanınmasına olanak sağlar. Bu deneysel protokol dikkate bu gibi büyüme ortamı, sıcaklık ya da temas süresi olarak belirli koşullar alma diğer bakteriler ya da bakteri türleri için adapte edilebilir.

Protokol

1. Bakteriyel Suşlarının ve Kültürleri

1. (Standart _CaCI2 tedavi veya elektroporasyon kullanarak) ¹⁵ E. dönüştürerek bir Escherichia coli alıcı hücre (Prey, P) Mühendisi lacZ geni (Tablo 1) a-tümleme izin veren bir plasmid ile DH5α coli hücreleri. Levha Luria-Bertani agar plakaları üzerinde dönüştürülmüş hücreler (LBA,% 1.5 agar) ihtiva eden 5-bromo-4-kloro-indolil-β-D-galactopyranoside (X-gal) 40 mg / ml nihai konsantrasyon ve uygun antibiyotik. ° C gecede ve ertesi sabah (§ 1.3) mavi transformantlar için seçin 37 inkübe edin.
2. T6SS-aktif Pseudomonas aeruginosa donör hücreleri büyümek (D ⁺⁾ veya T6SS-inaktif (D-) (Tablo 1) gecede LBA üzerine 37 ° C'de Örneğimizde, bir P. ikinci Burada sunulan aeruginosa RETS sahip zorlanmayapısal olarak aktif bir H1-T6SS ¹⁶ ve H1-T6SS gen kümesinin (Tablo 1) ve bir silme ile bir izogenik mutant.
3. Ertesi gün, E. arasında parlak mavi klon inokülasyon ile gazlı balona bir gecede sıvı kültür hazırlamak plakadan coli Transformantlar, (P) uygun bir antibiyotik ilave triptik soya suyu (TSB) içinde 5 ml, § 1.1 'de tanımlanmıştır. 37 ajitasyon altında büyümek ° C. § 1.2 'de tarif edilen plaka ^- (D) (D ⁺⁾ ve tek bir koloni ile aynı şekilde devam edin.

2. Rekabet Testi

1. Bir sonraki gün plakalar deney için LBA hazırlayın. Bu levhaların düzgün (Bunsen beki yakın veya laminar flow kabin ya) kurutulur emin olun. (D _-) suşları (D ^+), bir "Assay-girdi" (A-Girişi) plaka hazırlayın ve (P ). Bir "Assay-çıkış" (A-çıkışı) suşlarında plakası hazırlayın (D ^- + P) ve (D ^{+ +} P). Bölme ve buna bağlı olarak levhalar etiket.
2. Gecede büyüme sonra (§ 1.3), girişi bakteri kültürü (D ^- D ⁺ ve P) ve optik yoğunluk (OD _600Nm) ölçmek ve her bir suş 1 birim OD _600Nm bir hücre yoğunluğu eşdeğeri elde etmek için gerekli hacim hesaplamak . Her bir "giriş" hücre kültürü (D ^- D ⁺ ve P) başlangıçta steril 1.5 ml'lik Eppendorf tüplerine alınır.
3. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 rpm'de santrifüjlenir bakteri örnekleri ve süpernatan atılır.
4. D pelet yeniden süspanse edin ^-, D ⁺ ve P yumuşak pipetleme tarafından taze TSB 100 ul kültürleri ve her korelas 10 ml inoküle"A-girdi" plaka (§ 2.1 hazırlanmıştır) tek bir nokta olarak gerilme frekansı arayarak.
5. "A-çıkış" plaka (§ 2.1 'de hazırlanmış) inoküle. Daha doğrusu, 30 ul (P) ve 30 ul ile (D ⁺⁾ ve yavaşça 30 ul karıştırın (D ^-) iki ayrı Eppendorf tüpleri (kullanılan kültürler § 2.4 'te açıklanan olanlardır unutmayın) 30 ml (P) . Karışımları (D ⁺ / P) 20 ul inoküle ve (D ^- / P) "A-çıkış" plaka üzerinde tek tek noktalar gibi. Noktalar Yakın bir Bunsen beki kuru ve bakteri öldürme gerçekleşiyor sırasında zaman uygun bir süre için 37 ° C'de bir inkübatör plaka yerleştirmek için izin ver. P. halinde aeruginosa, etkin bir bakteri öldürme 5 saat inkübasyon sonrasında T6SS kusurlu zorlanma ile aktif bir T6SS karşılaştırırken görülmektedir.

3. T Nitel GözlemO Bakteriyel Öldürme

1. 40 ug / ml testin okuması için X-gal içeren LBA tabak hazırlayın. Plakaları "Okuma girişi" veya izole bakteri veya "Okuma çıkış" veya "R-çıkış" karışık bakteri kültürleri nokta ve böylece öldürme performans okumak için nokta "R-girdi" adı verilecek. Bu plakalar düzgün kurulanmalıdır da gerekir. Sırtında dört eşit parçaya plaka bölün ve 0, 10 ^-1, 10 ^-2 10 ^-3 bu parçalar açıklama, (§ 3.3) agar plaklarına nokta bakteriyel kültür dilüsyonları tayin. Seyreltme aynı nokta içinde mavi / beyaz bakteri oranı yarı-kantitatif değerlendirme sağlayacaktır.
2. "A-girişi" plaka (§ 2.4 bakınız) steril bir döngü bireysel bakteriyel noktalar ve "A-çıkış" plaka (§ 2.5) ile toplayın ve TSB 1 ml içeren ayrı ayrı 1.5 ml Eppendorf tüpleri her yerinde tekrar süspansiyon haline getirin. Verimli bir şekilde tekrar süspansiyon 30 dakika boyunca bir Eppendorf çalkalayıcı blok yerleştirinbakteriler.
3. TSB 900 ul içeren 5 kez 3 Eppendorf tüpler bir dizi hazırlayın ve 10 ^-3 ila on kat seri dilüsyonları kadar her yeniden süspanse nokta için devam edin. Pipet uçları değiştirmek ve her seyreltme adım arasında girdap 5 saniye için emin olun.
4. , Sulandırılmamış süspansiyon en seyreltilmiş başlayarak 40 mikrogram / ml X-gal içeren iyi kurutulmuş LBA plakaları § 3.3 'de hazırladığınız bakteriyel dilüsyonlarının lekelenme "A bu" R-girdi "plakaları yapmaya devam edin -girdi "lekeleri ve" A-çıkış "noktalar (Şekil 2) R-çıkış" için plakaları ". Homojen bir bakteri süspansiyonu tutmak lekelenme geçmeden önce kısaca Vorteks her tüp. Bir çeyrek içinde sonuçları, üç nüsha spot 20 ul (Şekil 2) tekrarlanabilirlik için. Noktalar tek tek plaka üzerinde ayrı kalır ve birbirlerine karşı kayma değil gerekir çünkü plaka göreli kuruluk bu aşamada önemlidir.
   Rekabet tahlil bir miktarının deney, bu aşamada da mümkündür. Adım 3.3 takiben, 40 mg / ml X-gal içeren LBA plakalar üzerinde seyreltme 10 ^-3 100 ul yayıldı. Sonuçların tekrarlanabilirliği için, "A-çıkış" plağı üzerindeki her nokta için üç nüsha halinde bir kaplama geçin. ° C inkübatör gece boyunca (16 saat inkübasyon karşı gelen) bir 37 sulandırma tabakları yerleştirin. Mavi koloniler (canlı kalmıştır P hücreleri) sayma işlemine geçin. Rekabet 5 saat sonra elde edilen Tipik sonuçlar, Şekil 3'te gösterilmiştir.
5. Her bir nokta içinde fazla sıvı emme izin vermek için, steril bir bölge içinde plaka açık (hiçbir kapak) bırakın.
6. Bir gece boyunca 37 ° C inkübatör içinde plaka yerleştirin. Bu inkübasyon süresi boyunca, öldürülmesi hala iki suşları hala temasta olduğundan (D ⁺ / P) karışımı gerçekleşiyor.
7. Fotoğraf çekmekya çıktı analizi (Şekil 2) için plakalar tarayın. Lekeler çoğunlukla mavi kalır Nerede gösterir E. coli P. tarafından öldürüldü olmamıştır aeruginosa. Bu durum böyle olduğunda, E. coli bir T6SS kusurlu P. ile karıştırılır aeruginosa suşu (D-) (Şekil 2, sağ alt plakası).

Sonuçlar

Tipik sonuçlar Tablo 1 'de tarif edilen suş ve reaktifleri ile Şekil 1' de gösterilmiştir. Bu şekilde gösterilen plakaları bir gece boyunca inkübasyondan sonra tarandı. "Okuma-Input" plakaları bu deneyde kullanılan suşlar için bir seri seyreltme desen göstermektedir. Beklendiği gibi, E. coli ise donör P., eksprese lacZ geni X-gal ile takviye medya üzerinde mavi görünür lekeler (P) av aeruginosa suşları (D ^+, T6SS aktif) ve (D ^- T6SS inaktif) beyaz kalır. Av ve T6SS aktif gerinim (D ⁺ / P) arasındaki karışımı mavi kaybolması göstermek tespit edilmiştir hangi "Okuma-çıkış" plakalar böylece öldürüldüğünü gösteren av. Bu av outcompete için vericinin becerisini göstermektedir. (Üzerinde mavi renk kalıcılığıD ^- / P) plaka mavi avlarını öldürmek için bir inaktif T6SS donör yetersizlik göstermektedir.

Şekil 1. E. Öldürme T6SS-yetkin P. coli aeruginosa. P. aeruginosa E. içine toksinler enjekte bir T6SS bağımlı bir şekilde coli hedef hücreye (beyaz ok ile gösterilmiştir). İki toksinler Tse1 ve Tse3 (turuncu ve kırmızı daireler) E. içine enjekte edilir coli periplazmaya ve peptidoglikan ⁹ aşağılamak. Tse2 toksin (sarı daire) E. enjekte edilir coli sitoplazma ve bakteriyostatik aktivite ^8,10 sahiptir. Toksinlerin kombine eylem hedef hücreler (yıldırım ve kafatası flaş) öldürür. Hedef hücrelerin hayatta kalma (Şekil 2 de bakınız) üretilmiş β-galaktosidaz faaliyeti takip edilerek tespit edilebilir. S. Bireruginosa bağışıklık proteinleri Tsi1, Tsi2 ve Tsi3 (sırasıyla turuncu, sarı ve kırmızı kareler) ^8,9,10 tarafından toksinlerin etkinliğe karşı korunmaktadır.

Şekil 2. Agar plaka deneyinde T6SS-bağımlı bakteri öldürme izlemek için bu resimde üst kısmı D seri dilüsyonları oluşan "Okuma-Input" plakalar üzerinde gösterilir ^-., D ⁺ ve P giriş hücreleri. P giriş hücreler lacZ geninin α-tümleme dolayı mavi ve bu şekilde üretilen β-galaktosidaz keser ki X-gal. Alt kısımda, bir aktif (D ⁺ / P) arasında bakteri karışımı seri dilüsyonları oluşan "Okuma-çıkış" levha gösterilir veya inaktif (D ^- / P), T6SS donör P. E. ile aeruginosa suşu coli avlarlar. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. E. öldürülmesi Niceleme P. coli 5 saat inkübasyondan sonra aeruginosa. grafiği E. CFU sayımı sunar coli 3.4 adımda anlatılan. Sonuçları öldürme en teması 5 ilk saatlerde gerçekleşiyor düşündüren, T6SS + ve T6SS-suşları arasında 3 kat fark gösterir Burada sunulan.

Tartışmalar

Bu makalede sunulan yöntem T6SS-aracılı bakterisidal / bacteriostasis eylemin görsel gözlem sağlar. Tahlil bir agar plaka yüzeyi üzerinde gerçekleştirilir. Daha önce karışık sıvı bakteri kültürü ile gerçekleştirilir T6SS-bağlı öldürme deneyi çünkü iki bakteri ⁸ arasında sürekli temas olmaması nedeniyle olası, etkili olmadığı gösterilmiştir. T6SS hedef hücreler ¹⁷ içine DNA enjekte etmek için bakteriyofaj tarafından kullanılan ile benzer bir mekanizma ile çalışır inanılmaktadır. Sıvı kültüründe T6SS ve tüp benzeri yapı daha kolay kırılabilir, inter-bakteriyel temas kaybetmiş olabilir ve toksinler verimli teslim edilmez.

Inkübasyon sürelerinde açısından, biz donör zorlanma ve avını arasındaki açıklayan temas 5 başlangıç ​​saatleri P. arasındaki bakteri öldürme gözlemlemek yeterlidir aeruginosa, E. Şekil 3 'de gösterildiği coli . Bununla birlikte, bu deney koşulları optimize etmek için bir kinetik gerçekleştirilerek kuluçka zamanı ayarlamak için tavsiye edilir.

Bu yöntem, bir renk dayalı bir teknik olduğu için, çıkış sonuçları verici suşu pigmentasyon ile kısıtlanabilir. Örneğin, S. durumunda aeruginosa, bazı suşlar av gelen ayrım nispeten zor yapma, tahlil okuma engelleyebilir gibi pyocyanin ve pyoverdine gibi renkli pigmentler yüksek düzeyde üretmek. Böyle eflatun-gal veya kırmızı gal gibi diğer kromojenik β-galaktosidaz substratlar, X-gal (Tablo 1) yerine kullanılabilir.

Yarışma testi okuma için diğer muhabiri genleri yararlanabilirler. Örneğin, benzer bir deneyi de yeşil floresan protein etiketli avlayan ¹² kullanılarak yapılmıştır.

Bizim tayini, nicel olmasa da, iyi bir fikir veriyorT6SS faaliyetin bu hayatta kalma ya da bir muhabir yırtıcı öldürülmesi dayalı olduğu. Bu teknik, basit ve herhangi bir bakteri türlerinin T6SSs bakterisidal / bacteriostasis aktivitesini değerlendirmek için uygun olma avantajını sağlar. Şimdiye kadar, T6SS faaliyeti Gram-negatif bakteri ve T6SS-duyarlı Gram-pozitif bakterilere ait herhangi bir karşı örneği gösterilmiştir ¹² henüz rapor edilmiştir. Bu test etmek için çeşitli bakteri türleri üzerinde kültür uyumsuzluk (örneğin, büyüme sıcaklık, oksijen, belirli bir ortam) dikkate alınmalıdır olduğu da açıktır.

Tüm tahlil bir salgılanan toksin bile izleri av öldürmek için yeterli olabilir çünkü T6SS bileşenleri olan kesinlikle gereklidir değerlendirmek için de kullanılabilir. Kültür süpernatant ve western blot kullanarak standart bir prosedür testi T6SS bağımlı sekresyonunu göre T6SS bile zayıf aktivite sonra açıkça bizim tahlili ile tespit edilebiliranalizi. Bununla birlikte, uygun bir koloni oluşturan birim (CFU) sayım yine bu T6SS aktivitenin tayini için daha kesin gereklidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
P. aeruginosa PAKΔ RETS (D +) (Aktif T6SS)	Lab gerginlik		Referans 16 Açıklandığı
P. aeruginosa PAKΔ RETS Δ H1-T6SS (D -) (inaktif T6SS)	Bu çalışma,		H1-T6SS küme (genler PA0070 için PA0095 kapsayan) Başvuru 18 bölümünde açıklanan yordamı izleyerek allelik döviz tarafından silindi. Up parçası primerleri: mutator fragmanı primerlerin aşağıdaki seti ile oluşturulan: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 ', ve 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 '. Aşağı parçası astarlar: 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 ', 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 '
E.coli DH5α	Invitrogen	18258-012	F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec A1 sonunda A1 HSD R17 (r k - m k +) pho bir sup ​​E44 λ-thi -1 Gyr A96 rel A1
pBluescript II SK (+)	Agilent	212205	Bu vektör, α-tümleme için kullanılan β-galaktosidaz α peptid ifade eder.
X-gal	Invitrogen	15520-018	40 mikrogram / ml 'de kullanın
Luria Bertani agar	Merck kimyasalları	1.10283.0500
TSB (kazein soya broth)	Oxoid	CM109
Vortex çalkalayıcı Genius 3	IKA	3340000
Tarayıcı	Epson	V700
Spektrofotometre	WPA Biowave	CO8000 Hücre Yoğunluk Ölçer
Kırmızı-gal	Bioworld	30350001-1 (715241)
Kırmızı-gal	Araştırma organikler	1364c
			Tablo 1. Kullanılan Strain plazmid, malzeme ve reaktif.