Визуальный анализов для мониторинга T6SS-опосредованной Бактериальные конкурса

Резюме

Мы описываем качественного анализа для контроля бактериальной конкуренции при посредничестве Синегнойной палочки Типа VI секреции системы (T6SS). Анализ основан на выживание / убийство кишечная палочка целевой клетки, несущие LacZ-Репортер. Этот метод является регулируемым для оценки бактерицидного / бактериостаз деятельности T6SS-опытный микроорганизмов.

Аннотация

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells^1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages³. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively^4,5.

The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain^6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment^8,9,10.

In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins^8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species^8,11,12,13.

The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes¹⁴, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5α) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

протокол

1. Бактериальных штаммов и культур

1. Инженер получателя кишечная палочка клетки (Prey, P) путем преобразования (с использованием стандартного лечения CaCl ₂ или электропорации) ¹⁵ E. палочки DH5α клеток с плазмидой позволяющий-дополнения гена LacZ (табл. 1). Плита трансформированных клеток на Лурия-Bertani агаром (LBA, 1,5% агар), содержащих 5-бром-4-хлор-индолил-β-D-галактопиранозида (X-Gal) в дозе 40 мг / мл конечной концентрации и соответствующих антибиотиков. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи и на следующее утро выбрать для синих трансформантов (см. § 1.3).
2. Расти синегнойной палочки донорских клеток, которые являются T6SS-активных (D ⁺⁾ или T6SS-неактивные (D-) (табл. 1) на LBA течение ночи при 37 ° C. В примере, представленном здесь мы использовали P. палочки Рец напрягать обладающихпостоянно активный H1-T6SS ¹⁶ и изогенных мутантов с делецией H1-T6SS кластера генов (табл. 1).
3. На следующий день, готовить в течение ночи культуральной жидкости в колбе газированные путем посева ярко-синий клон среди E. палочки трансформантов (P) от пластины описаны в § 1.1, в 5 мл триптического соевого бульона (БСЭ) с добавлением соответствующего антибиотика. Вырастить при перемешивании при температуре 37 ° C. Приступить наравне с одной колонии (D ⁺⁾ и (D ^-) из табличке, описанной в § 1.2.

2. Анализ конкуренции

1. Подготовка LBA пластин для следующего эксперимента день. Убедитесь, что эти пластины правильно сушат (либо рядом с горелкой Бунзена или в ламинарный шкаф потока). Подготовка "Анализ-вход" (A-Input) пластины для штаммов (D ^+), (D _-) и (P ). Подготовка "Анализ-выход" (A-выход) пластины для штаммов (D ^- + P) и (D ^{+ +} P). Разделяй и обозначения пластин соответственно.
2. После ночного роста (см. § 1.3), измерение оптической плотности (OD _{600 нм)} входного бактериальной культуры (D ^- D ⁺ и P) и рассчитать объем необходимых для получения эквивалентной плотности клеток на 1 единицу OD _{600 нм} каждого штамма . Каждый «вход» культуре клеток (D ^- D ⁺ и P) первоначально собранные в 1,5 мл стерильного трубы Эппендорф.
3. Центрифуга бактериальных образцов при 13000 оборотов в минуту в течение 1 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
4. Ресуспендируют гранул D ^- D ^+, и P культур, в 100 мкл свежей TSB осторожным пипетированием и прививать 10 мл каждая соответствуетсоответствующая деформации как одно пятно на кнопку "ввод" пластины (подготовленные в § 2.1).
5. Привить "A-выход" пластины (подготовленные в § 2.1). Точнее, осторожно смешать 30 мкл (D ⁺⁾ с 30 мкл (Р) и 30 мкл (D ^-) с 30 мл (P) в двух отдельных труб Эппендорф (обратите внимание, что культуры использовали те, описанных в § 2.4) . Инокулировать 20 мкл смеси (D ⁺ / Р) и (D ^- / P) в виде отдельных пятен на "A-выход" пластины. Дайте высохнуть пятна около газовой горелки и поместите пластину в инкубаторе при температуре 37 ° C в течение соответствующего периода времени, в течение которого бактериальной убийство происходит. В случае P. палочки, эффективный бактериальный убийства наблюдается после 5 ч инкубации при сравнении с активными T6SS T6SS дефектных деформаций.

3. Качественные наблюдения тОн Бактериальные убийство

1. Подготовка LBA пластины, содержащей 40 мкг / мл X-гал для считывания анализа. Пластинами будет называться "Считывание вход" или "R-вход" обнаружить изолированные бактерии или "считывание выхода" или "R-выход", чтобы определить смешанных бактериальных культур и, следовательно, читать убийства производительности. Эти пластины также должны быть правильно высушить. Разделите пластины в четыре равные части на спине и комментировать эти части 0, 10 ^-1, 10 ^-2 и 10 ^-3, обозначающий разведения бактериальной культуры обнаружить на агаром (см. § 3.3). Разведение позволит полу-количественной оценки синий / белый соотношение бактерий в том же месте.
2. Соберите стерильной петлей отдельных бактериальных пятна от "входного" тарелка (см. § 2,4) и "выходом" тарелка (см. § 2,5) и ресуспендируют каждого места в различных трубах 1,5 мл Eppendorf, содержащий 1 мл TSB. Поместите в шейкер Eppendorf блок в течение 30 мин для ресуспендирования эффективнобактерии.
3. Подготовить ряд в 5 раз 3 трубки Эппендорф, содержащий 900 мкл TSB и продолжить для каждого ресуспендированных место, чтобы десять раз серийных разведений до 10 ^-3. Убедитесь в том, чтобы изменить наконечники и вихрем 5 секунд между каждым шагом разведения.
4. Приступить к кровянистые выделения из ваших бактериальных разведения подготовлен в § 3.3 на хорошо высушенные пластины LBA, содержащих 40 мкг / мл X-гал, начиная с самых разбавленных в неразбавленном подвески, что делает эти "R-вход" пластины для " -вход "пятен и" R-выход "пластины для" A-выходом "пятна (рис. 2). Vortex кратко каждую трубку, прежде чем приступить к кровянистые выделения держать однородной суспензии бактерий. Для воспроизводимости результатов, местная 20 мкл в трех экземплярах в квадранте (рис. 2). Относительная сухость вашей тарелке важно на данном этапе, поскольку пятна должны оставаться индивидуально разделенных на тарелке, а не скользить по отношению друг к другу.
   Количественной оценки конкурентный анализ также возможно на этой стадии эксперимента. Вслед за шагом 3,3, распространились по 100 мкл разведения 10 ^-3 на пластинах LBA, содержащей 40 мкг / мл X-гал. Для воспроизводимости результатов, переходите к покрытие в трех экземплярах для каждого пятна от "выходом" пластины. Поместите разведении пластин при 37 ° C инкубаторе в течение ночи (соответствует 16 ч инкубации). Перейдем к подсчету синих колоний (P клетки, которые остались живы). Типичные результаты, полученные после 5 часов конкуренция показано на рисунке 3.
5. Оставьте пластину открытых (без крышки) в стерильную зону, чтобы поглощение жидкости в избыточных внутри каждого пятна.
6. Поместите пластинку в 37 ° C инкубаторе в течение ночи. За это время инкубации, убийства, все еще ​​происходит в смеси (D ⁺ / P), так как штаммы-прежнему находятся в контакте.
7. Сфотографируйтеили сканирование пластин для выхода анализа (рис. 2). Где пятна остаются в основном синие это означает, что E. палочка не была убита P. палочки. Это тот случай, когда E. палочки, смешивают с T6SS дефектной P. палочки штамма (D-) (рис. 2, пластины в нижнем правом углу).

Результаты

Типичные результаты приведены на рисунке 1 с деформациями и реагенты, описанные в таблице 1. Пластины показано на этом рисунке были проверены после инкубации в течение ночи. "Считывание-Input" тарелки показать серийный образец для разведения штаммов, используемых в этом анализе. Как и ожидалось, E. палочки охотятся пятна (P) гиперэкспрессией гена LacZ появляются синего цвета на среде с добавлением X-галлон, в то время как донор P. палочки штамма (D ^+, T6SS активной) и (D ^-, T6SS неактивные) остаются белыми. "Считывание-выход" пластины, на которой баланс между добычей и T6SS активной деформации (D ⁺ / P) была замечена показать исчезновения синего добычу таким образом, указав, что он был убит. Это свидетельствует о способности доноров вытеснять добычу. Сохранение синего цвета на (D ^- / P) пластина демонстрирует неспособность неактивных доноров T6SS, чтобы убить синего добычу.

Рисунок 1. Убийство E. палочки по T6SS-опытный P. палочки. P. палочки вводит токсинов в E. кишечной клетки-мишени в T6SS-зависимым способом (показано белой стрелкой). Два токсинов Tse1 и Tse3 (оранжевые и красные круги) вводят в E. периплазме палочки и ухудшают пептидогликана ^9. Tse2 токсина (желтый круг) вводят в E. палочки цитоплазме и имеет бактериостатической активности ^8,10. Комбинированное действие токсинов убивает клетки-мишени (вспышка молнии и черепа). Выживание клетки-мишени могут быть обнаружены путем наблюдения за деятельностью производится β-галактозидазы (см. также рис 2). P.eruginosa защищен от активности токсинов иммунитет белков Tsi1, TSI2 и Tsi3 (оранжевые, желтые и красные квадраты, соответственно), ^8,9,10.

Рисунок 2. Анализ агар пластины для мониторинга T6SS зависит от бактериальных убийства На этом рисунке показано в верхней части "Считывание-Input" пластины, состоящие из последовательных разведениях D ^-., D ^+, и клетки P входа. Клетки P входных синего в связи с α-дополнения гена LacZ и таким образом производится β-галактозидазы, который расщепляет X-гал. В нижней части отображается "Считывание-выход" пластины, состоящие из последовательных разведений бактериальной сочетание между активным ⁽⁺ D / P) , или неактивный (D ^- / P), T6SS доноров P. палочки штамма E. палочки добычу. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Количественное определение убийства Е. палочки П. палочки через 5 ч инкубации. график представляет подсчет КОЕ E. палочки описано в 3,4 шага. Приведенные результаты показывают, 3-кратная разница между T6SS + и T6SS-штаммов, предполагая, что большинство убийств происходит в течение 5 первые часы контакта.

Обсуждение

Метод, представленный в этой статье, позволяет визуальное наблюдение T6SS-опосредованной бактерицидные / бактериостаз деятельности. Анализ проводится на поверхности агара пластины. Ранее было показано, что T6SS-зависимых убийства анализ выполняется со смешанной бактериальной культуры жидкость не является эффективным, вероятно, из-за отсутствия устойчивых контактов между двумя бактериями ^8. T6SS Считается, что работать с механизмом сродни той, которая используется бактериофагов для введения ДНК в клетки-мишени ^17. В культуральной жидкости, трубы, как структура T6SS может сломать легче, между бактериальным контакт может быть потерян, и токсины, эффективно не доставлено.

С точки зрения времени инкубации, 5 первые часы контакта, который мы описываем между штамма донора и добычу достаточно, чтобы наблюдать бактериальных убийства между P. палочки и E. палочки, как показано на рисунке 3 . Тем не менее, желательно, чтобы настроить время инкубации, выполняя кинетической с целью оптимизации условий эксперимента.

Поскольку этот метод является цветом на основе техники, выходной результат может быть скомпрометирована пигментации донора штамма. Например, в случае P. палочка, некоторые штаммы продуцируют высокие уровни цветные пигменты, такие как пиоцианина и pyoverdine, которая может повлиять на анализ считывания, делая отличие от добычи довольно трудно. Другие хромогенных β-галактозидазы субстратов, таких как пурпурный-гал или красно-гал, могут быть использованы вместо X-галлон (табл. 1).

Анализ конкуренции могут воспользоваться другие гены репортер считывания. Например, подобный анализ был также выполняется с помощью зеленого флуоресцентного белка-меченных жертв ^12.

Наш анализ, а не количественный, дает хорошее представлениеиз T6SS деятельности, поскольку она основана на выживание или убийстве репортера добычу. Эта техника представляет то преимущество, что легко и удобно для оценки бактерицидного / бактериостаз деятельности T6SSs от любых видов бактерий. До сих пор деятельность T6SS было показано в отношении грамотрицательных бактерий и не яркий пример T6SS чувствительных грамположительных бактерий, сообщалось еще ^12. Очевидно также, что несовместимость в культуру различных видов бактерий для тестирования (например, рост температуры, кислорода, конкретные носители) должен быть рассмотрен.

Наш анализ также может быть использован для оценки, какие из T6SS компоненты являются абсолютно необходимыми, так как даже следы выделяется токсин может быть достаточно, чтобы убить жертву. Даже слабая активность T6SS может то, очевидно, быть обнаружен нашими анализа по сравнению со стандартной процедуре тестирования T6SS-зависимой секреции использованием супернатанта культуры и вестерн-блотанализа. Тем не менее, надлежащее колониеобразующих единицы (КОЕ) счета-прежнему необходимо для точной количественной оценки этой T6SS деятельности.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
P. палочки PAKΔ Рец (D +) (Активный T6SS)	Лаборатория штамм		Описанные в ссылку 16
P. палочки PAKΔ Рец Δ H1-T6SS (D -) (неактивный T6SS)	Это исследование		H1-T6SS кластера (охватывающий генов PA0070 PA0095 в) был удален аллельного обмена в соответствии с процедурой, описанной в работе 18. Мутатор фрагмент был создан со следующим набором праймеров: До праймеры фрагмент: 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 ', и 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 '. Вниз праймеры фрагмент: 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 », 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 '
E.coli DH5α	Invitrogen	18258-012	F-φ80 лаковые ZΔM15 Δ (ЛАК ZYA-Arg F) U169 REC A1 A1 конце HSD R17 (R K -, м K +) фо вир E44 λ-Тхи -1 Гыр A96 отн A1
pBluescript II SK (+)	Agilent	212205	Этот вектор выражает α пептида β-галактозидазы для α-дополнения.
X-гал	Invitrogen	15520-018	Используйте при 40 мкг / мл
Лурия Bertani агара	Merck химикатов	1.10283.0500
БСЭ (казеин, соевый бульон)	Oxoid	CM109
Vortex шейкере Genius 3	IKA	3340000
Сканер	Epson	V700
Спектрофотометр	WPA Biowave	CO8000 сотовых Измеритель плотности
Magenta-гал	BioWorld	30350001-1 (715241)
Red-гал	Исследования органических	1364c
			Таблица 1. Процедить, плазмиды, материальных и используемого реагента.