T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

要約

我々は競争によって媒介される細菌を監視するための定性分析を記述緑膿菌 VI型分泌系（T6SS）。アッセイは運ぶ大腸菌標的細胞の生存/殺害に依存している lacZを - レポーター。この手法は、T6SS-堪能微生物の殺菌/静菌活性を評価するために調節可能である。

要約

VI型分泌系（T6SSs）は、グラム陰性菌は、標的細胞の^1,2の多種多様にタンパク質を輸送して注入することができる分子ナノマシンです。 T6SSは13コア·コンポーネントで構成されており、バクテリオ³のテール管と構造的類似性を表示しています。ファージは、標的細菌の細胞エンベロープに浸透し、DNAを注入するチューブと穿刺装置を使用しています。それはT6SSが表面にエフェクターや毒素を駆動するために、細菌の細胞エンベロープ内の特定のパスを作成するバクテリオファージ反転装置であることが提案されている。プロセスはさらに取ることができるとT6SS装置は、このように、これらの目標にエフェクターを注入し、細菌が接触している他のセルを穿孔可能性があります。尾管とT6SSの穿刺装置の部品はそれぞれ^4,5、HCPとVgrGタンパク質で作られています。

T6SSの汎用性がsを通じて実証されている様々な細菌性病原体を使用してtudies。 コレラ菌 T6SSは、C-末端アクチン架橋ドメイン^6,7を運ん^で "進化" VgrGを注入することにより、真核生物宿主細胞の細胞骨格を改造することができます。もう一つの顕著な例は、最近、従って特定の微生物ニッチと競争環境^8,9,10の中の細菌の設立を推進し、T6SSに依存した方法で細菌を標的とし、殺すことができ、緑膿菌を用いて記述されていました。

後者の場合、すなわち3 T6SS-分泌タンパク質、コード番号、Tse2とTSE3は標的細菌（ 図1）に注入された毒素として同定されている。ドナー細胞は、抗毒素Tsi1によって媒介されるメカニズム、Tsi2とTsi3免疫タンパク質^8,9,10を介してこれらのエフェクターの有害な影響から保護されます。 T6SS-堪能細菌がsで共培養しているときにこの抗菌活性をモニターすることができます他の細菌種と同じ種または^8,11,12,13のT6SS不活性細菌との競争の中で悪臭のする表面。

入手可能なデータには、抗生物質メーカーに大きく依存して時間がかかるのCFU計数を含めて、細菌の競合アッセイへの数値的アプローチを強調した。 Pのような抗生物質耐性菌の場合には緑膿菌は 、これらの方法は不適切であることができます。また、100以上の細菌ゲノム¹⁴で約200の異なるT6SS遺伝子座の同定と、簡便なスクリーニングツールが非常に望ましい。我々は使いやすいですし、標準的な実験材料と試薬を必要とするアッセイを開発した。この方法は、lacZ遺伝子の相補性を可能に獲物としてレポーター株（この場合大腸菌 DH5α）を使用してT6SS依存殺菌/静菌活性をモニターするための迅速かつ定性的な手法を提供しています。全体的に、この方法があるgrapをHICと寒天プレート上T6SS関連表現型の迅速な同定を可能にする。この実験プロトコルを考慮に、このような接触の増殖培地、温度や時間などの特定の条件を取って他の株や細菌種に適合させることができる。

プロトコル

1。菌株と文化

1. （標準CaCl _2の治療またはエレクトロポレーションを用いて^）15 大腸菌を形質転換することにより大腸菌受容細胞を（餌、P）のエンジニア大腸菌lacZ遺伝子（ 表1）の相補性を可能にするプラスミドとDH5α細胞。プレート40 mg / mlの最終濃度と適切な抗生物質で、5 - ブロモ-4 - クロロ - インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを含有するルリア - ベルターニ寒天プレート上で形質転換された細胞（LBA、1.5％寒天）（X-gal）を。 37℃で一晩、翌朝（§1.3参照）青形質転換体を選択。
2. T6SS活性である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ドナー細胞を成長させる（D ^+）またはT6SS不活性（D）（表1）一晩、LBAで37℃この例では、我々はPを使用ここで提示緑膿菌RETSは所持ひずみ恒常的に活性なH1-T6SS ¹⁶およびH1-T6SS遺伝子クラスター（ 表1）の欠失を持つ同質遺伝子変異。
3. 翌日、 大腸菌のうち、明るい青色のクローンを接種することにより通気フラスコ中で一晩培養液を準備プレートからの形質転換体（P）は、適切な抗生物質を補充したトリプシン大豆ブロス（TSB）5mlに、§1.1で説明した。 37℃で攪拌下で育つ℃、 §1.2で説明したプレートから^- （D）（D ^+）との単一のコロニーを均等に進みます。

2。競合アッセイ

1. 翌日、実験のためのLBAプレートを準備します。これらのプレートが適切に（ブンゼンバーナーの近くや層流キャビネット内のいずれか）を乾燥させていることを確認します。株について"アッセイ入力"（入力）プレートを準備します（D ^+）、（D _{- ）、}および（P ）。 "アッセイ-出力"（出力）菌株用のプレートを準備します（ ^- D + P）と（D ⁺ P）。分割し、それに応じてプレートにラベルを付けます。
2. 一晩増殖させた後（§1.3参照）、入力細菌培養（ ^- D、D ⁺とP）の光学密度（OD _600nmの ） _を測定し、各菌株の1単位OD _600nmの細胞密度に相当を取得するために必要な量を計算し。それぞれの"入力"細胞培養（D ^- 、D ⁺とP）が最初に滅菌1.5mlエッペンドルフチューブに回収されています。
3. 室温で1分間に13,000 rpmで細菌サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。
4. 、D ⁺と新鮮なTSBの100μlのP文化、穏やかにピペッティングし、各対応の10ミリリットルを接種^- Dのペレットを再懸濁し"A入力"プレート（§2.1で調製したもの）上の単一のスポットとしてひずみをsponding。
5. "A-出力"プレート（§2.1で調製）接種する。 2つの別々のエッペンドルフチューブ（使用する文化がそれらの§2.4で説明されていることに注意）で30ミリリットル（P）と^-より正確には、静かに30μlの（P）および30μlの（D）と（D ^+）30μlを混ぜる。ミックス（D ⁺ / P）の20μlを接種すると、（D ^{- A} / P） "出力"プレート上の個々のスポットとして。スポットが近くブンゼンバーナーを乾燥や細菌の殺害が行われている間、適切な期間を37℃のインキュベーターでプレートを配置することができます。 Pの場合にはT6SS欠損株を持つアクティブT6SSを比較するときに緑膿菌 、効率的な殺菌を5時間のインキュベーション後に観察される。

3。 tの定性的観察彼殺菌

1. アッセイの読み出しのための40μg/ mlのX-galを含むLBAのプレートを準備します。プレートは、混合細菌文化を発見し、こうして殺し性能を読んで "読み出し入力"または "R入力"単離された細菌を発見するか、または "読み出し出力"または "R-出力"と呼ばれるでしょう。これらのプレートはきちんと乾燥させることも必要です。その裏に4等分にプレートを分割して0、10 ^{-1、10 -2、10 -3、}これらの部 ​​分に注釈を付け、（§3.3参照）寒天プレート上のスポットに細菌培養物の希釈物を指定する。希釈は、同じスポット内の青/白バクテリア比の半定量的評価が可能になります。
2. "入力"プレート（§2.4参照）から滅菌ループ個々の細菌スポットと "出力"プレート（§2.5参照）を用いて収集し、TSBの1ミリリットルを含む別個の1.5mlエッペンドルフチュー​​ブ内の各スポットを再懸濁します。効率的に再懸濁するために30分間エッペンドルフシェーカーブロックに置き細菌。
3. TSBの900μlを含む5回3エッペンドルフ管のシリーズを準備して、最大10 ^-3〜10倍段階希釈液に再懸濁した各スポットのために進んでください。ピペットチップを変更し、各希釈段階の間に渦を5秒にしてください。
4. 、無希釈懸濁液に最も希釈始まるまでに40μg/ mlのX-galを含むよく乾燥したLBAのプレート上に§3.3で調製したあなたの細菌の希釈液のスポッティング "のためにこれらの" R入力 "プレートを作るに進みます入力"スポットと" A-出力"スポット（ 図2）R出力"のプレート"。均質細菌懸濁液を維持するためにスポッティングに進む前に、簡単に渦各チューブを。結果の再現性については、象限内の三連でスポット20μlを（ 図2）。スポットが個別にプレート上で分離し、互いに向かって滑空しないままにする必要があるので、お皿の相対的乾燥度は、この段階では重要である。
   競合アッセイの定量化は、実験のこの段階でも可能です。ステップ3.3に続いて、40μg/ mlのX-galを含むプレート上のLBA 10 ^-3希釈液100μlを広げた。結果の再現性については、 "出力"プレートから各スポットについて三重のめっきに進みます。 ℃インキュベーターで一晩（16時間のインキュベーションに相当）は37に希釈プレートを置きます。青色のコロニー（生き残っP細胞）のカウントに進みます。競争の5時間後に得られた典型的な結果を図3に示します。
5. 各スポット内に過剰の液体の吸収を可能にするために、無菌ゾーン内プレートオープン（NO蓋）のままにします。
6. 一晩37℃のインキュベーターでプレートを置きます。このインキュベーション時間の間に、殺害はまだ両方の株が接触して残っているので、（D ⁺ / P）をミックスで発生している。
7. 写真を撮るまたは出力の分析（ 図2）のためのあなたのプレートをスキャンしてください。スポットは大部分が青のままそれはどこにいることを示し、E.大腸菌はPによって殺されていない緑膿菌 。それがそうであるときに、E.大腸菌は T6SS欠陥のPで混合される緑膿菌株 （D）（図2、右下のプレート）。

結果

典型的な結果は、 表1に記載された株と試薬と図1に示します。この図に示すようにプレートを一晩インキュベートした後にスキャンした。 "読み出し - 入力"プレートは、このアッセイで使用菌株の連続希釈パターンを示す。予想されたように、 大腸菌大腸菌lacZ遺伝子はドナーP.ながら、X-galで補充した培地上で青く見えるスポット（P）の過剰発現を捕食緑膿菌株（D ^+、T6SSアクティブ）と（D ^- 、T6SS非アクティブ）白のまま。 "読み出し出力"プレートは、どの獲物とT6SSアクティブ株（D ⁺ A / P）との間のミックスは、このようにそれが殺されたことを示す青色の獲物の消失を示す目撃されています。これは、獲物をoutcompeteするドナーの能力を示しています。 （上の青色の持続^- D / P）はプレートが青獲物を殺すために非アクティブT6SSドナーのできないことを示しています。

図1。 大腸菌の死滅T6SS-堪能P.の大腸菌緑膿菌、P. 緑膿菌は、大腸菌に毒素を注入T6SS依存的に大腸菌は、標的細胞（白矢印）。二つの毒素東証とTSE3は（オレンジと赤の丸）、E.に注入され大腸菌のペリプラズムとペプチドグリカン^9を劣化させる。 Tse2毒素（黄色の丸）が大腸菌に注入され大腸菌の細胞質と菌活性^8,10を持っ^ています。毒素の複合作用は、標的細胞（雷や頭蓋骨のフラッシュ）殺す。標的細胞の生存は、（ 図2参照）を作製したβ-ガラクトシダーゼの活性を監視することによって検出することができますが、P. Aeruginosaは免疫タンパク質Tsi1、Tsi2とTsi3（オレンジ、黄色、赤の広場、それぞれ^）8,9,10によって毒素の活動に対して保護されています。

図2。寒天プレートアッセイはT6SS依存殺菌を監視するために、この図では上部Dの連続希釈液からなる"読み出し-入力"プレートに表示されている^-は、D ^+、およびP入力セル。開裂のX-galというPの入力セルは、β-ガラクトシダーゼ青lacZ遺伝子のα-相補性に起因してこのようにして製造されています。下部には（D ⁺ / P）がアクティブの間に細菌の混合の連続希釈液からなる"読み出し出力"のプレートを示されています、または非アクティブ（D ^{- A} / P）、T6SSドナーP.大腸菌と緑膿菌株大腸菌は食い物にする。 拡大図を表示するにはここをクリック 。

図3。 Eの殺害の定量P.の大腸菌 5時間のインキュベーション後に緑膿菌 。グラフは、 大腸菌のCFU計数を提示大腸菌は 3.4ステップで説明。結果は、殺害のほとんどは接触の初期5時間の間に行われていることを示唆し、T6SS +とT6SS-株の間に3倍の差を示してここに提示した。

ディスカッション

この記事で紹介した方法はT6SS媒介性殺菌/静菌活性を目視することができます。アッセイは、寒天プレートの表面上で実行されます。これは、予め混合菌液の培養で行わT6SS依存殺傷アッセイがないため、2つの細菌⁸の間に安定した接触の不足の可能性が高い、効率的ではないことが示されている。 T6SSは、標的細胞¹⁷にDNAを注入するためにバクテリオファージで使用されているものと同種のメカニズムで動作するように考えられている。液体培養では、T6SSのチューブ状の構造がより簡単に壊れる可能性があり、相互に細菌の接触が失われる可能性があり、毒素を効率的に配信されません。

インキュベーション時間の面では、我々はドナー株と獲物の間に記述する接触の5初期時間はPと殺菌を観察するのに十分である緑膿菌と大腸菌 図3に示すように、 大腸菌 、 。それにもかかわらず、それは実験条件を最適化するために運動を行うことにより、インキュベーション時間を調整することをお勧めします。

このメソッドが色ベースの技術であるため、出力結果は、ドナー株の色素沈着が損なわれることがあります。例えば、Pの場合には緑膿菌 、一部の菌株は、獲物との区別は比較的困難にし、アッセイ読み出しを妨害することができるようピオシアニンとpyoverdineとして着色顔料を高レベルで生産しています。そのようなマゼンタ-galまたは赤ギャルのような他の発色性β-ガラクトシダーゼ基質は、X-galを（ 表1）の代わりに使用できます。

競合アッセイは、読み出しのために他のレポーター遺伝子を利用することができます。例えば、同じようなアッセイはまた、緑色蛍光タンパク質で標識した餌^12を用い^て行われてきた。

我々のアッセイは、定量的ではないながら、良い指標を与えるそれは生存またはレポーター獲物の殺害に基づいているのでT6SS活動の。この手法は、任意の細菌種からT6SSsの殺菌/静菌活性を評価するのは簡単で便利であるという利点を提示します。これまでのところ、T6SSの活性はグラム陰性菌に対して示されており、T6SS敏感なグラム陽性菌の明確な例はまだ¹²報告されていない。それは、（ 例えば 、成長温度、酸素化、特定のメディア）は、異なる細菌種の文化の中での非互換性をテストすることは明らかであると考えられるべきである。

我々のアッセイはまた、分泌毒素の痕跡が獲物を殺すのに十分であるかもしれないので、絶対に必要不可欠であるT6SSコンポーネントのかを評価するために使用できます。 T6SSの弱い活性が明らかに培養上清及びウェスタンブロットを用いて標準的な手順のテストT6SS依存分泌に比べて我々のアッセイによって検出される可能性がある解析。しかし、適切なコロニー形成単位（CFU）のカウントがまだこのT6SS活動を正確に定量するために必要です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
緑膿菌 PAKΔRETS（D +） （アクティブT6SS）	ラボ株		文献16に記載されて
緑膿菌PAKΔRETSΔH1-T6SS（D - ）（非アクティブT6SS）	この研究		H1-T6SSクラスタが （遺伝子PA0070へPA0095を包含する）文献18に記載されている手順に従って対立遺伝子交換によって削除されました。最大フラグメントプライマー：ミューテータ断片をプライマーの下記のセットで生成されました： 5'-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 '、および 5'CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 '。ダウン断片プライマー： 5'-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 '、 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 '
大腸菌 DH5α	インビトロジェン	18258-012	F-φ80LACZΔM15Δ（lacリZYA-argは F）はU169 REC A1の終わり A1 HSD R17（R K - 、K +メートル） フォー商標E44λ-THI -1 GYR A96 REL A1
たpBluescript II SK（+）	アジレント	212205	このベクトルは、α-相補性を用いられるβ-ガラクトシダーゼのαペプチドを発現する。
のX-gal	インビトロジェン	15520-018	40μg/ mlの濃度で使用
ルリアベルターニ寒天	メルク化学品	1.10283.0500
TSB（カゼイン大豆ブロス）	オキソイド	CM109
ボルテックスシェーカーの天才3	IKA	3340000
スキャナー	エプソン	V700
分光光度計	WPA Biowave	CO8000セル密度計
マゼンタギャル	Bioworld	30350001から1（715241）
赤ギャル	研究有機物	1364c
			表1使用した菌株、プラスミド、材料および試薬。