מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

Summary

שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT.

Abstract

מתחמי טיטניום (IV) ונדיום (V) הם סוכנים אנטי סרטני חזקים מאוד. אתגר בסינתזה שלהם מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic, ולכן ההכנה שלהם צריכה להתנהל תחת אווירת אינרטי. הערכה של הפעילות אנטי סרטנית של מתחמים אלה יכול להיות מושגת על ידי assay MTT.

Assay MTT הוא assay כדאיות colorimetric מבוסס על הפחתה האנזימטית של מולקולת MTT לformazan כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. התוצאה של הירידה היא שינוי צבע של מולקולת MTT. מדידות ספיגת יחסית לשליטה לקבוע את אחוז שנותר תאים סרטניים קיימא לאחר הטיפול שלהם בריכוזים שונים של מתחם שנבדק, אשר תורגם לפעילות אנטי סרטנית המתחם וIC ₅₀ ערכיה. Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity בשל הדיוק שלו, מהירות ופשטות היחסית.

במסמך זה אנו מראשנשלח פרוטוקול מפורט לסינתזה של תרופות המבוססות על אוויר מתכת רגישה ומדידות כדאיות תא, כולל הכנה של צלחות התא, דגירה של התרכובות עם התאים, מדידות כדאיות באמצעות assay MTT, והנחישות של IC ₅₀ ערכים.

Introduction

כימותרפיה היא עדיין אחד הקורסים העיקריים של טיפולים המועסקים במרפאת למחלות סרטן שונות, ובכך כמות עצומה של מחקר שנערכה ברחבי העולם במטרה לפתח תרופות נגד סרטן חדשים ומשופרות. מחקרים כאלה בעיקר להתחיל ברמה הכימית, עם העיצוב והכנה של תרכובות, ואחריו הערכה ביולוגית של התכונות ציטוטוקסיות במבחנה. כדאיות תא עשויות להיות מוערכות על ידי מבחני שונים המספקים מידע על פעילות תאית ^1-2.

ציספלטין הוא דוגמא מורכבת פלטינה כי נעשה שימוש נרחב כתרופה כימותרפית, הנחשבת לטיפול יעיל בעיקר לסרטן אשכים ושחל ^3-4. עם זאת, הטווח שלה צר פעילות ותופעות לוואי חמור לעורר מחקרים של קומפלקסי מתכות מעבר חזק אחרים ^5-8. בין יתר, טיטניום (IV) ונדיום מתחמים (V) הראו תוצאות מבטיחות של פעילות גבוהה והקטינורעילות ^9-16. טי (IV) מתחמים היו הראשונים להיכנס לניסויים קליניים לאחר ציספלטין בשל מאפיינים אלה, עם זאת, הם נכשלו בניסויים בשל קשיי ניסוח וחוסר יציבות hydrolytic. יש אפוא צורך הנוכחי לפתח נגזרים משופרים של מתחמי מתכת אלה שעשויים לשלב פעילות אנטי סרטנית גבוהה עם עמידות למים ^15,17-21.

אתגר בהכנה של טי (IV) ו-V (V) מתחמים מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic של ריאגנטים המבשר, ולכן, יש לשמור אווירת אינרטי. ההכנה של טי (IV) ו-V (V) תרכובות מתבצעת בתנאי N ₂ או אר בתא הכפפות או תוך שימוש בטכניקות שורת Schlenk.

שיטה נפוצה אחת לצורך ההערכה של הפעילות אנטי סרטנית מבוססת על MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) רומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay. assay זה assay כדאיות colorimetric שהוצג ב1983 על ידי Mosmann^22. הוא מאוד נחקר היטב ומאופיין, והיא נחשבת יעילה ביותר כאשר אנו מעריכים את האפקטיביות של תרכובות ציטוטוקסיות חדשות בשל הדיוק שלו, מהירות, ויכולתה להיות מיושמת במגוון רחב של שורות תאים. assay כדאיות זה מבוסס על שינוי הצבע של מולקולת MTT כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. מדידה של הספיגה, שהוא פרופורציונאלי למספר תאי קיימא, והשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה, מאפשרת הערכה של יכולות עיכוב צמיחת תאים של המתחם שנבדק.

Assay colorimetric MTT מתנהל במתכונת צלחת 96 היטב ^23. התאים עשויים לדרוש preincubation בבארות לפני התוספת של התרופה הנבדקת. הפעמים preincubation עשויות להשתנות 0-24 שעה בהתאם למאפייני הקו הסלולרי. תאים בדרך כלל נחשפו לתרופה ל24-96 שעות בהתאם לפעילות התרופה. פתרון MTT הוא הוסיף אז לתאים שטופלו, שבו לצעוקow MTT מצטמצם formazan הסגול על ידי מגוון של אנזימים של המיטוכונדריה וcytosolic כי הם מבצעיים בתאי קיימא (איור 1) ^24. מולקולת MTT לא מצטמצמת על ידי תאים מתים או תאי דם אדומים (מטבולית תאים לא פעילים), תאי טחול (תאי מנוחה) ולימפוציטים מגורה concanavalin (תאים הופעלו) ^22. אחרי 3-4 שעות של דגירה עם MTT משקעים formazan. היווצרות formazan מתחילה אחרי 0.5 שעות של דגירה, אבל עבור תוצאות אופטימליות עדיף לחשוף את התאים לMTT לפחות 3 שעות ^22. כתוצאה מכך, הגידול הבינוני מוסר וformazan הוא מומס בממס אורגני, רצוי isopropanol ^25, למרות DMSO יכול לשמש גם ^26. חיסולו של המדיום הוא חיוני להשגת תוצאות מדויקות מאז פנול אדום, שהוא נפוץ באופן נרחב במדיום גידול, והאצת חלבונים יכולים להפריע למדידת ספיגת ^25. כאשר הפורםפתרון זאן מגיע הומוגנית, הספיגה של הפתרון נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר microplate קורא. הספיגה ב 550 ננומטר עומד ביחס ישר למספר התאים בטווח של 200-50,000 תאים לכל טוב, ולכן ניתן לאתרם כמויות קטנות מאוד של תאים ^22. הספיגה מציינת את כמות תאי קיימא שנותרה לאחר טיפול בתרופה, והוא לעומת הספיגה של תאי בקרה שלא נחשפו לתרופה. ניתוח התוצאות על ידי תוכנה מתאימה מספק (ריכוז עיכוב; 50%) IC ₅₀ ערכים והשגיאות הסטטיסטיות שלהם מבוססים על מספר חזרות של המדידה.

Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity להקרנת תרכובות אנטי סרטניות חדשות, בשל דיוקה ופשטות יחסית. עם זאת, בעת שימוש assay MTT, אשר היה תלוי בתגובה האנזימטית, יש לקחת בחשבון כי מעכבי אנזים שונים יכולים להשפיע על ההפחתה של MTTd להוביל לתוצאות שגויות ^27. בנוסף, assay MTT אינו מספק כל מידע על המנגנון המולקולרי של הפעילות ציטוטוקסית של התרופה ^2.

Protocol

1. הכנת V (V) מורכב (איור 2); ¹⁸ התנהלות צעדים 1.1-1.4 בתא הכפפות, אם כפפת תיבה אינה זמינה, דלג לחלופת שלבים 2 (2.1-2.6).
   1. ממיסים 0.42 מילימול של ligands H ₂ L ב THF היבש ולהוסיף אותו לפתרון ערבוב של כמויות שווה ערך של VO (O i Pr) ₃ בTHF.
   2. מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות, ולהסיר את נדיפים תחת ואקום.
   3. הוספת הקסאן הקר ולהסיר אותו תחת ואקום. יש לקבל אבקה סגולה כהה בתשואה כמוני.
   4. שוקל 8 מ"ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf. דלג לשלב 3.
2. הכן מורכב V (V) באמצעות קו Schlenk.
   1. ממיסים 0.42 מילימול של L יגנד H ₂ בTHF היבש בבקבוק Schlenk יבש עם כובע מחץ, לצרף קו Schlenk ולהחיל לסירוגין סביבות ואקום / גז אינרטי (N ₂ או אר), מומלץ ליישם את שלושה sUCH סיבובים ולהמתין 2-5 דקות על שלבי הוואקום.
   2. הוספת THF היבש באמצעות מזרק דרך פקק מחצה.
   3. להוסיף כמויות שווה ערך של VO (O i Pr) ₃ בתמיסת THF, שהוכנה באופן דומה על ידי משדלת בקבוק Schlenk יבש נכון לשורה, החלת סביבת אינרטי והוספת חומרים כימיים באמצעות מזרק מהפתרון ונדיום לזה של ליגנד.
   4. מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות ולהסיר את נדיפים תחת ואקום, ואם יש חשש של מוצרים יציבים, לבצע זיקוק סוג Schlenk של נדיפים תחת אווירת אינרטי; להשתמש זרימת גז אינרטי לצרף הזכוכית הנדרשת שpredried .
   5. הוספת הקסאן הקר ולהסיר אותו תחת ואקום. יש לקבל אבקה סגולה כהה בתשואה כמוני.
   6. שוקל 8 מ"ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf.
3. הכנת Ti (IV) מורכב (איור 2); ²⁸ התנהלות הצעדים 3.1-3.3 בתא הכפפות, אם כפפת תיבה אינה זמינה, להתאים את הצעדים חלופיים שנדונו לאנלוגי ונדיום (שלב 2) שמעסיקים קו Schlenk במקום.
   1. ממיסים 0.35 מילימול של L יגנד H ₂ בTHF היבש ולהוסיף אותו לפתרון ערבוב של כמויות שווה ערך של טי (O i Pr) ₄ בTHF.
   2. מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. הסר את נדיפים תחת ואקום כדי לתת מוצר צהוב בתשואה כמוני.
   3. שוקל 8 מ"ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf.
4. הכנת HT-29 תאי צלחת 96 היטב
   1. תרבות HT-29 תאים בבקבוק ² 75 סנטימטר עם מדיום RPMI-1640 המכיל פניצילין / אנטיביוטיקה 1% סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, ו10% בסרום שור העובר (FBS), על 37 ° C עם 5% CO ₂ .
   2. הסר את המדיום כאשר HT-29 התאים מגיעים confluency המקסימאלי (90-100%, כל 3-4 ימים ללא תת). לשטוף עם 1 מיליליטרפתרון של טריפסין (0.25%) / EDTA (0.05%) ולהסיר אותו.
   3. הוסף 1 מיליליטר של טריפסין (0.25%) פתרון / EDTA (0.05%) ו דגירה במשך 5 דקות.
   4. לנתק את HT-29 התאים מהבקבוק ולהוסיף 10 מיליליטר של המדיום כדי להשבית את פעילות טריפסין. להעביר 5 מיליליטר של תערובת התאים לצינור.
   5. השתמש פיפטה להעביר כמה טיפות של תערובת התאים לתוך תא דלפק. קאמרי הדלפק כולל 5 x 5 ריבועים.
   6. ספירת התאים ב5 ריבועי נציג באמצעות מיקרוסקופ: 4 ריבועים בפינות והאחד שהוא באמצע.
   7. לחשב את הסכום המשוער של תאים קיימים. סיכום התאים ב5 ריבועי הנציג ולחלק ידי 20.
   8. מחלקים 0.6 ידי התוצאה של צעד 4.7. המספר שקיבל הוא כמות תערובת תא הנדרשת לכל צלחת. חישוב זה מתייחס לצלחת המכילה 0.6 x 10 ⁶ תאים (9,000 תאים לכל היטב).
   9. השתמש פיפטה להעביר את כמות התערובת הדרושה לכל תא p(200 μl לכל טוב × 66 בארות) באיחור (כפי שמחושב בסעיף 4.8) ולהוסיף 13.2 מיליליטר של המדיום.
   10. מוסיף את התערובת לצלחת 96 היטב על ידי פיפטה 11 ערוצים (200 μl לכל טוב, 6 קווים, 66 בארות בסך הכל). גם אחד של כל שורה צריך להישאר ריקים לבקרה ריקה.
   11. דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO ₂ למשך 24 שעות כדי לאפשר לתאים לצרף לצלחת.
5. החדרת התרכובות
   1. הוסף 200 μl (או כמות שונה בהתאם לטווח הריכוז הרצוי) של THF היבש עד 8 מ"ג של כל מתחם שקל כפי שמתואר בשלב 1.4 (או 2.6) או 3.3. שוקל 8 מ"ג L יגנד H _2, יותר מדי.
   2. לדלל כל פתרון מתחם נוסף על ידי הוספת 60 μl של THF ב9 מבחנות אפנדורף שונות.
   3. העבר עם טפטפת 60 μl מהתערובת בסעיף 5.1 לבקבוקון אפנדורף הראשון, resuspend והעברת 60 μl לבקבוקון הבא, וכן הלאה עד 10 ריכוזים שונים הם obtained (כולל תערובת ההורה בסעיף 5.1).
   4. לדלל 20 μl של כל ריכוז בTHF עם 180 μl של מדיום.
   5. הכן פתרון שליטה עם THF בלבד; 20 μl של THF עם 180 μl של מדיום בכל מדידה.
   6. הוסף 10 μl מהפתרון שהתקבל (כולל שליטת THF), לכל טוב שכבר מכיל 200 μl של הפתרון הנ"ל של תאים במדיום לתת ריכוזים סופיים של המתחם של עד 200 מ"ג / ליטר (יכול טווח הריכוז להיות שונה בהתאם לפעילות במתחם).
   7. אתה יכול לראות כמה משקעים בריכוז הגבוה ביותר מיושם בהתאם למסיסות המתחם.
   8. חזור על כל מדידה של 3x המתחם (3 קווים בצלחת של אותו מתחם); כל שורה מכילה: תאים שטופלו במתחם ב10 ריכוזים שונים, 1 תאים המכילים גם טופלו בממס רק לבקרה ול1 גם ללא תאים לריקים שליטה.
   9. דגירה את הצלחת העמוסה במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ אווירה.
6. מדידת cytotoxicity באמצעות assay MTT
   1. הכן את פתרון MTT על ידי הוספת 1 גרם של אבקת MTT לפתרון 200 מיליליטר של מדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום. פתרון המניות יכול להיות מחולק ל15 צינורות מיליליטר ומאוחסן -20 ° C.
   2. הוסף 20 μl של פתרון MTT לכל פיפטה 11 ערוצית באמצעות היטב (פרט לבארות שליטה הריקה ללא תאים מצעד 4.10), ו דגירה את הצלחת למשך 3 שעות נוספות.
   3. הסר את הפתרון הבינוני מכל טוב.
   4. הוסף 200 μl של isopropanol היטב כל אחד לפזר formazan. מערבבים את הצלחת ל0.5 שעה עד שיגיע homogeneousness.
   5. מדוד את הספיגה ב 550 ננומטר ל200 μl של הפתרון האמור על ידי ספקטרופוטומטר microplate קורא.
   6. חזור על כל מדידה (הכולל 3 חזרות, ראה שלב 5.8) ב -3 ימים שונים.
   7. לחשב tהוא אחוז של כדאיות תא על ידי ניכוי הערך ספיגת שליטה הריקה מהערך הנמדד, חלוקת התוצאה על ידי הספיגה של ערך שליטת ממס THF והכפלה ב100%.
   8. חישוב IC ₅₀ ערכים באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה (או שווה ערך).
   9. IC דיווח ₅₀ הוא הממוצע של כל IC ₅₀ הערכים שנאספו על לפחות שלושה ימים שונים, ואת ערך השגיאה הוא סטיית התקן.

תוצאות

מתחמים הוכנו על בסיס נהלים שנקבעו ^18,28 וטוהר שלהם עשוי להיות מוערך על ידי ניתוח NMR ויסודות.

הנתונים שהתקבלו מassay MTT מנותח להעריך cytotoxicity של המתחם ^18,21. ראשית, חיסור של הערך ספיגת שליטה הריקה מכל הערכים האחרים מתבצע. שנית, ער?...

Discussion

השיטה המתוארת בכתב היד הזה משלבת סינתזה כימית עם assay כדאיות תא ביולוגי. כמו בכל שיטות ביולוגיות הנוגעות לתאי קיימא, הוא חיוני לעבודה בברדס למינרית, ולשמור על תנאים סטריליים, כוללים השימוש בממסים אורגניים סטרילי. כמו כן, הכנה ואחסון של תרופות על בסיס לא יציבה hydrolytically מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Hexane AR	Gadot	830122313	Dried using a solvent drying system
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38
Isopropanol AR	Gadot	830111370
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
MTT	Sigma-Aldrich	M5655-1G
Penicillin/streptomycin antibiotics	Biological Industries	03-031-1B
RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine	Sigma-Aldrich	R8758
RPMI without phenol red	Biological Industries	01-103-1A
Tetrahydrofuran (THF) AR	Gadot	830156391	dried using a solvent drying system
Ti(OiPr)4	Sigma-Aldrich	205273-500ML	moisture sensitive
Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-052-1B
VO(OiPr)3	Sigma-Aldrich	404926-10G	moisture sensitive
Equipment
12-channel pipette 30-300 μl	Thermo Scientific
12-channel pipette 5-50 μl	Finnpipette
75 cm2 flask	NUNC	156472
96-well plate with lid (flat bottom)	NUNC	167008
CO2 Incubator	Binder	APT.line C150
Counter chamber	Marienfeld-Superior	650030
Eppendorf vial	KARTELL
Glove box	M. Braun
Laminar flow hood	ADS LAMINAIRE	OPTIMALE 12
Microplate reader spectrophotometer	Bio-Tek	El-800
Microscope	Nikon	Eclipse TS100
Pipette 20-200 μl	Finnpipette
Pipette 5-50 μl	Finnpipette