Antitumorali metallo Complessi: Sintesi e citotossicità valutazione da parte del saggio MTT

Riepilogo

Un metodo per la sintesi di titanio e vanadio agenti antitumorali-vie sensitive è descritto, insieme con la valutazione della loro attività citotossica verso la linea di cellule di cancro umano dal saggio MTT.

Abstract

Titanio (IV) e vanadio (V) complessi sono agenti antitumorali molto potenti. Una sfida nella loro sintesi si riferisce alla loro instabilità idrolitica; quindi la loro preparazione deve essere condotta in atmosfera inerte. Valutazione dell'attività antitumorale di questi complessi può essere ottenuto mediante il saggio MTT.

Il saggio MTT è un saggio colorimetrico basato sulla redditività riduzione enzimatica della molecola MTT a formazano quando è esposto a cellule vitali. Il risultato della riduzione è un cambiamento di colore della molecola MTT. Misure di assorbanza relativi a un controllo determinano la percentuale rimanente cellule tumorali vitali dopo il loro trattamento con diverse concentrazioni di un composto in esame, che si traduce per l'attività antitumorale componenti ei valori di IC _50. Il saggio MTT è molto comune negli studi di citotossicità grazie alla sua precisione, rapidità e relativa semplicità.

Qui abbiamo preinviato un protocollo dettagliato per la sintesi di farmaci a base di metallo sensibile dell'aria e la misurazione della vitalità cellulare, compresa la preparazione delle piastre delle celle, incubazione dei composti con le cellule, misure di vitalità usando il saggio MTT, e determinazione dei valori di IC _50.

Introduzione

La chemioterapia è ancora uno dei principali cicli di trattamenti impiegati in clinica per varie malattie tumorali, e quindi grande quantità di ricerca è condotta in tutto il mondo con l'obiettivo di sviluppare nuovi e migliori farmaci antitumorali. Tali studi principalmente iniziano a livello chimico, con la progettazione e la preparazione di composti, seguita da valutazione biologica delle proprietà citotossiche in vitro. La vitalità cellulare può essere valutata da vari saggi che forniscono informazioni sulle attività cellulare ^1-2.

Cisplatino è un esempio di un complesso di platino che è ampiamente utilizzato come farmaco chemioterapico, che è considerato un trattamento efficace soprattutto per testicolari e ovarico ^3-4. Tuttavia, la sua ristretta gamma di attività e di gravi effetti collaterali innescare studi di altri complessi di metalli di transizione potente ^5-8. Tra gli altri, titanio (IV) e vanadio (V) complessi hanno mostrato risultati promettenti alta attività e ridottiTossicità ^9-16. Ti (IV) complessi sono stati i primi ad entrare in studi clinici, dopo cisplatino causa di queste proprietà, tuttavia, hanno fallito le prove a causa delle difficoltà di formulazione e di instabilità idrolitica. Vi è quindi l'esigenza attuale lo sviluppo di nuove derivati ​​di questi complessi metallici che possono combinare elevata attività antitumorale con resistenza all'acqua ^15,17-21.

Una sfida nella preparazione di Ti (IV) e V (V) complessi riferisce alla instabilità idrolitica dei reagenti precursori, pertanto, atmosfera inerte deve essere mantenuta. La preparazione di Ti (IV) e V (V) composti è condotta sotto N ₂ o Ar condizioni in una scatola portaoggetti o utilizzando tecniche di linea Schlenk.

Un metodo comune per valutare l'attività anti-cancro è basato sul MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro) saggio. Questo saggio è un saggio colorimetrico vitalità che è stato presentato nel 1983 da Mosmann^22. È estremamente ben studiato e caratterizzato, ed è considerato molto efficace quando si valuta l'efficacia di nuovi composti citotossici per la sua precisione, rapidità, ed la sua capacità di essere applicato su varie linee cellulari. Questo saggio redditività si basa sul cambiamento di colore della molecola MTT quando è esposto a cellule vitali. Misurazione dell'assorbanza, che è proporzionale al numero di cellule vitali, e rispetto a controlli non trattati, ha la valutazione delle capacità di inibizione della crescita cellulare del composto testato.

Il saggio colorimetrico MTT è condotto in un formato di piastra da 96 pozzetti ^23. Le cellule possono richiedere preincubazione nei pozzetti prima dell'aggiunta del farmaco testato. I tempi di preincubazione possono variare 0-24 ore secondo le proprietà della linea cellulare. Cellule sono solitamente esposte al farmaco per 24-96 ore a seconda dell'attività farmaco. Soluzione di MTT è quindi aggiunta alle cellule trattate, dove il urlanoow MTT è ridotto a formazano viola da una varietà di enzimi mitocondriali e citosolici che sono operativi in cellule vitali (Figura 1) ^24. La molecola MTT non è diminuito di cellule morte o globuli rossi (cellule metabolicamente inattivi), cellule della milza (cellule di riposo) e di linfociti A-stimolata concanavalina (cellule attivate) ^22. Dopo 3-4 ore di incubazione con MTT precipitati formazano. La formazione del formazano inizia dopo 0,5 ore di incubazione, ma per ottenere risultati ottimali è meglio esporre le cellule ad MTT per almeno 3 ore ^22. Di conseguenza, il terreno di coltura viene rimosso e il formazano viene disciolta in un solvente organico, preferibilmente isopropanolo ^25, sebbene DMSO può anche essere utilizzato ^26. L'eliminazione del mezzo è fondamentale per ottenere risultati accurati da rosso fenolo, che è molto comune nel terreno di coltura, e precipitando proteine ​​possono interferire con la misurazione dell'assorbanza ^25. Quando la formasoluzione zan raggiunge omogenea, l'assorbanza della soluzione viene misurata utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. L'assorbanza a 550 nm è direttamente proporzionale al numero di celle in serie di 200-50,000 cellule per pozzetto, e quindi molto piccole quantità di cellule può essere rilevata ^22. L'assorbanza indica la quantità di cellule vitali residuo dopo il trattamento con il farmaco, e viene confrontato con l'assorbanza di cellule di controllo che non sono stati esposti al farmaco. Analisi dei risultati per il software corretto prevede l'(concentrazione di inibizione; 50%) IC ₅₀ valori ei loro errori statistici basati su diverse ripetizioni della misura.

Il saggio MTT è molto comune negli studi di citotossicità per lo screening di nuovi composti antitumorali, grazie alla sua precisione e la relativa semplicità. Tuttavia, quando si utilizza il saggio MTT, che è dipesa reazione enzimatica, si deve considerare che i vari inibitori enzimatici possono influenzare la riduzione di un MTTd portare a falsi risultati ^27. Inoltre, il saggio MTT non fornisce alcuna informazione sul meccanismo molecolare dell'attività citotossica del farmaco ^2.

Protocollo

1. Preparazione del V (V) complesso (Figura 2); ¹⁸ condotta passaggi 1.1-1.4 in un glove-box, se un glove-box non è disponibile, passare alla alternativa passaggi 2 (2.1-2.6).
   1. Sciogliere 0,42 mmol dei leganti H ₂ L in THF anidro e aggiungerlo a una soluzione sotto agitazione di quantità equivalenti di VO (O i Pr) ₃ in THF.
   2. Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 15 min, e rimuovere le sostanze volatili sotto vuoto.
   3. Aggiungere esano freddo e rimuoverlo sotto vuoto. Una polvere viola scuro deve essere ottenuta con una resa quantitativa.
   4. Pesare 8 mg del composto ottenuto in una fiala Eppendorf. Passare al punto 3.
2. Preparare il complesso V (V) usando una linea Schlenk.
   1. Sciogliere 0,42 mmol del legante H ₂ L in THF anidro in un pallone Schlenk secco con un coperchio a diaframma, subordinare una linea Schlenk e diffusa alternata vuoto / gas inerte (N ₂ o Ar) ambienti, si raccomanda di applicare tre sale turni e aspettare 2-5 minuti sulle fasi di vuoto.
   2. Aggiungere THF anidro tramite siringa attraverso il coperchio a diaframma.
   3. Aggiungere quantità equivalenti di VO (O i Pr) ₃ in una soluzione di THF, che era stato preparato in modo simile agganciando un pallone Schlenk secco propria della linea, applicando un ambiente inerte e aggiungendo i reagenti attraverso una siringa dalla soluzione vanadio a quella di il ligando.
   4. Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 15 minuti e rimuovere le sostanze volatili sotto vuoto, se c'è una preoccupazione di prodotti instabili, effettuare tipo Schlenk distillazione di sostanze volatili in atmosfera inerte; utilizzare il flusso di gas inerte per fissare la vetreria necessaria che era stato Pre-essiccata .
   5. Aggiungere esano freddo e rimuoverlo sotto vuoto. Una polvere viola scuro deve essere ottenuta con una resa quantitativa.
   6. Pesare 8 mg del composto ottenuto in una fiala Eppendorf.
3. Preparazione del Ti (IV) complesso (Figura 2); ²⁸ condotta passaggi 3.1-3.3 in un glove-box, se un glove-box non è disponibile, regolare le fasi alternative discusse per l'analogo vanadio (passaggio 2) che impiegano una linea Schlenk invece.
   1. Sciogliere 0,35 mmol del legante H ₂ L in THF anidro e aggiungerlo a una soluzione sotto agitazione di quantità equivalenti di Ti (O i Pr) ₄ in THF.
   2. Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 2 ore. Rimuovere le sostanze volatili sotto vuoto per dare un prodotto giallo in una resa quantitativa.
   3. Pesare 8 mg del composto ottenuto in Eppendorf flaconcino.
4. Preparazione di HT-29 cellule piastra a 96 pozzetti
   1. Culture HT-29 cellule in un pallone 75 centimetri ² con mezzo RPMI-1640 contenente 1% di penicillina / streptomicina antibiotici, 1% di L-glutammina e 10% siero bovino fetale (FBS), a 37 ° C con 5% di CO ₂ .
   2. Rimuovere il mezzo quando il HT-29 cellule raggiungono la confluenza massima (90-100%, ogni 3-4 giorni senza sottocultura). Lavare con 1 mlsoluzione di tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) e rimuoverlo.
   3. Aggiungere 1 ml di tripsina (0,25%) in soluzione / EDTA (0,05%) e incubare per 5 min.
   4. Staccare le HT-29 cellule dal pallone e aggiungere 10 ml del mezzo per disabilitare l'attività tripsina. Trasferire 5 ml della miscela cellule in una provetta.
   5. Usare la pipetta per trasferire alcune gocce della miscela cellule nella camera del contatore. La camera di contatore include 5 x 5 caselle.
   6. Contare le cellule in 5 quadrati rappresentativi utilizzando un microscopio: i 4 quadrati negli angoli e quello che è nel mezzo.
   7. Calcolare la quantità stimata di cellule presenti. Sommare le celle nelle 5 piazze rappresentative e dividere per 20.
   8. Dividere 0.6 dal risultato del punto 4.7. Il numero ricevuto è la quantità di miscela di cellule necessario per piastra. Questo calcolo si riferisce ad una piastra contenente 0,6 x 10 ⁶ cellule (9.000 cellule per pozzetto).
   9. Usare la pipetta per trasferire la quantità di miscela di cellule necessarie per pin ritardo (come calcolato nel paragrafo 4.8) e aggiungere 13,2 ml di terreno (200 microlitri per pozzetto × 66 pozzetti).
   10. Aggiungere la miscela di piastra a 96 pozzetti con una pipetta 11 canali (200 microlitri per pozzetto, 6 linee, 66 pozzetti in totale). Un bene di ogni riga dovrebbe rimanere vuoto per il controllo del vuoto.
   11. Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 24 ore per permettere alle cellule di attaccarsi alla piastra.
5. Inserimento dei composti
   1. Aggiungere 200 microlitri (o quantità differente a seconda del campo di concentrazione desiderata) di THF anidro a 8 mg di ciascun composto pesato come descritto al punto 1.4 (o 2.6) o 3.3. Pesare 8 mg del legante H ₂ L, anche.
   2. Diluire ogni soluzione mescola ulteriormente con l'aggiunta di 60 ml di THF in 9 diverse fiale Eppendorf.
   3. Con una pipetta 60 microlitri della miscela nel paragrafo 5.1 al primo flaconcino Eppendorf, risospendere e trasferire 60 microlitri all'altra fiala, e così via fino a 10 differenti concentrazioni sono obtained (compresa la miscela madre nel paragrafo 5.1).
   4. Diluire 20 ml di ciascuna concentrazione in THF con 180 ml di mezzo.
   5. Preparare una soluzione di controllo con un solo THF, 20 ml di THF con 180 ml di mezzo in ogni misurazione.
   6. Aggiungere 10 microlitri della soluzione risultante (compreso il controllo THF), a ciascun pozzetto contenente già 200 microlitri della soluzione citata delle cellule nel mezzo di ottenere concentrazioni finali del composto di fino a 200 mg / L (intervallo di concentrazione può essere modificato secondo l'attività composto).
   7. Si può osservare una certa precipitazione alla concentrazione massima applicata a seconda della solubilità composto.
   8. Ripetere ogni misurazione dei composti 3x (3 linee nella piastra dello stesso composto); ciascuna riga contiene: cellule trattate con il composto in 10 differenti concentrazioni, 1 pozzetto contenente cellule trattate con solvente solo per 1 pozzetto senza cellule per vuoto controllo.
   9. Incubare la piastra caricata per 3 giorni a 37 ° C in 5% CO ₂ nell'atmosfera.
6. Misurazione citotossicità usando il saggio MTT
   1. Preparare la soluzione MTT aggiungendo 1 g di polvere MTT ad una soluzione di mezzo RPMI-1640 200 ml senza rosso fenolo. La soluzione madre può essere diviso per provette da 15 ml e conservato a -20 ° C.
   2. Aggiungere 20 ml di soluzione di MTT ad ogni pozzetto con una pipetta 11 canali (tranne che per i pozzetti di controllo in bianco, senza le cellule dal punto 4.10), e incubare la piastra per ulteriori 3 ore.
   3. Rimuovere la soluzione intermedia, da ogni pozzetto.
   4. Aggiungere 200 ml di isopropanolo a ciascun pozzetto per sciogliere formazano. Mescolare la piastra per 0,5 ore fino a raggiungere omogeneità.
   5. Misurare l'assorbanza a 550 nm per 200 microlitri della soluzione citata da uno spettrofotometro per micropiastre.
   6. Ripetere ogni misurazione (che include 3 ripetizioni, vedere il punto 5.8) per 3 giorni diversi.
   7. Calcola tegli percentuale di vitalità cellulare detraendo il valore di assorbanza del bianco di controllo dal valore misurato, dividendo il risultato per l'assorbanza del valore di controllo solvente THF e moltiplicando per 100%.
   8. Calcola IC ₅₀ valori utilizzando il software GraphPad Prism (o equivalente).
   9. La IC ₅₀ è riportata la media di tutti i valori di IC ₅₀ raccolti su almeno tre diversi giorni, e il valore di errore è la deviazione standard.

Risultati

I complessi sono stati preparati sulla base delle procedure stabilite ^18,28 e la loro purezza può essere valutata mediante analisi NMR ed elementare.

I dati ricevuti dal saggio MTT viene analizzata per valutare la citotossicità del composto ^18,21. In primo luogo, viene eseguita la sottrazione del valore di assorbanza del bianco di controllo da tutti gli altri valori. In secondo luogo, il valore del controllo del solvente THF è impostato su 100% vitalità, come è sta...

Discussione

Il metodo descritto in questo manoscritto unisce la sintesi chimica con saggio biologico vitalità cellulare. Come con tutti i metodi biologici relativi cellule vitali, è fondamentale per lavorare in una cappa laminare, e mantenere condizioni di sterilità, compreso l'uso di solventi organici sterili. Inoltre, la preparazione e lo stoccaggio di farmaci a base di metallo idroliticamente instabile devono essere effettuate in condizioni inerti, per i quali dovrebbero essere utilizzati tecniche vano portaoggetti o di l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Hexane AR	Gadot	830122313	Dried using a solvent drying system
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38
Isopropanol AR	Gadot	830111370
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
MTT	Sigma-Aldrich	M5655-1G
Penicillin/streptomycin antibiotics	Biological Industries	03-031-1B
RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine	Sigma-Aldrich	R8758
RPMI without phenol red	Biological Industries	01-103-1A
Tetrahydrofuran (THF) AR	Gadot	830156391	dried using a solvent drying system
Ti(OiPr)4	Sigma-Aldrich	205273-500ML	moisture sensitive
Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-052-1B
VO(OiPr)3	Sigma-Aldrich	404926-10G	moisture sensitive
			Equipment
12-channel pipette 30-300 μl	Thermo Scientific
12-channel pipette 5-50 μl	Finnpipette
75 cm2 flask	NUNC	156472
96-well plate with lid (flat bottom)	NUNC	167008
CO2 Incubator	Binder	APT.line C150
Counter chamber	Marienfeld-Superior	650030
Eppendorf vial	KARTELL
Glove box	M. Braun
Laminar flow hood	ADS LAMINAIRE	OPTIMALE 12
Microplate reader spectrophotometer	Bio-Tek	El-800
Microscope	Nikon	Eclipse TS100
Pipette 20-200 μl	Finnpipette
Pipette 5-50 μl	Finnpipette