Anti-Krebs-Metall-Komplexe: Synthese und Zytotoxizität Bewertung durch die MTT-Assay

Zusammenfassung

Verfahren zur Synthese von luftempfindlichen Titan-und Vanadiumantikrebsmitteln wird beschrieben, zusammen mit der Bewertung der zytotoxischen Aktivität gegenüber menschlichen Krebszelllinie mit dem MTT-Assay.

Zusammenfassung

Titan (IV) und Vanadium (V)-Komplexe sind hochwirksamen Antikrebsmittel. Eine Herausforderung bei ihrer Synthese bezieht sich auf ihre hydrolytische Instabilität, deshalb sollte deren Herstellung unter einer inerten Atmosphäre durchgeführt werden. Bewertung der Antitumor-Aktivität dieser Komplexe können durch den MTT-Assay erzielt werden.

Der MTT-Test ist ein kolorimetrischer Assay, der auf Lebensfähigkeit enzymatischen Reduktion von MTT zu Formazan-Molekül, wenn es um lebensfähigen Zellen ausgesetzt ist. Das Ergebnis der Reduzierung ist ein Farbwechsel des MTT-Molekül. Absorptionsmessungen relativ zu einem Regler zum Einstellen des Prozentsatzes der verbleibenden lebensfähigen Krebszellen nach der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen einer Testverbindung, die Aktivität gegen Krebs der Verbindung und ihrer IC _50-Werte umgerechnet wird. Der MTT-Assay ist in Zytotoxizität Studien aufgrund ihrer Genauigkeit, Schnelligkeit und relative Einfachheit weit verbreitet.

Hier stellen wir vorschickte detailliertes Protokoll für die Synthese von luftempfindlichen Metall basierte Medikamente und die Lebensfähigkeit der Zellen-Messungen, einschließlich der Vorbereitung der Zellplatten, die Inkubation der Verbindungen mit den Zellen, die Lebensfähigkeit Messungen unter Verwendung des MTT-Tests, und die Bestimmung der IC _50-Werte.

Einleitung

Die Chemotherapie ist immer noch eines der Hauptgerichte von Behandlungen in der Klinik für verschiedene Krebserkrankungen eingesetzt und damit überwiegende Teil der Forschung wird weltweit mit dem Ziel, neue und verbesserte Krebsmedikamente entwickeln, durchgeführt. Solche Studien beginnen meist in der chemischen Ebene, mit der Gestaltung und Herstellung von Verbindungen, gefolgt von biologischen Auswertung der zytotoxischen Eigenschaften in vitro. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch verschiedene Tests, die Informationen über die Zellaktivität bieten ^1-2 bewertet werden.

Cisplatin ist ein Beispiel eines Platinkomplexes, der weitgehend als chemotherapeutisches Arzneimittel, die als eine effiziente Behandlung hauptsächlich für Hoden-und Eierstockkrebs ^3-4 verwendet wird. , Seinen engen Aktivitätsbereich und schwere Nebenwirkungen auslösen, jedoch Studien anderer potenter Übergangsmetallkomplexe ^5-8. Unter anderem Titan (IV) und Vanadium (V)-Komplexe zeigten vielversprechende Ergebnisse mit hoher Aktivität und reduzierteToxizität ^16.9. Ti (IV)-Komplexe waren die ersten klinischen Studien nach Cisplatin aufgrund dieser Eigenschaften geben, allerdings haben sie die Studien aufgrund Formulierungsschwierigkeiten und hydrolytische Instabilität fehlgeschlagen. Es besteht daher ein Bedürfnis, verbesserte Strom Derivate dieser Metallkomplexe, die eine hohe Anti-Krebs-Aktivität mit Wasserbeständigkeit ^15,17-21 kombinieren entwickeln.

Eine Herausforderung bei der Herstellung der Ti (IV) und V (V)-Komplexe bezieht sich auf die hydrolytische Instabilität der Vorläuferreagenzien, daher inerte Atmosphäre aufrechterhalten werden. Die Herstellung der Ti (IV) und V (V)-Verbindungen wird unter N ₂ oder Ar Bedingungen in einem Handschuhfach oder unter Verwendung von Schlenk-Techniken durchgeführt.

Test - Ein übliches Verfahren zur Bewertung der Anti-Krebs-Aktivität basiert auf dem MTT-((4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid 3) bezogen. Dieser Test ist ein Test, der farbmetrischen Rentabilität im Jahr 1983 von Mosmann präsentiert wurde^22. Es ist sehr gut untersucht und charakterisiert, und es wird als sehr leistungsfähig bei der Beurteilung der Wirksamkeit der neuen zytotoxischen Verbindungen aufgrund ihrer Präzision, Schnelligkeit und seine Fähigkeit, auf einer Vielzahl von Zelllinien verwendet werden. Diese Lebensfähigkeit Assay basiert auf der Farbänderung des MTT-Molekül, wenn es um lebensfähigen Zellen ausgesetzt basiert. Messung der Absorption bestimmt, die proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen ist, und der Vergleich zu unbehandelten Kontrollen, erlaubt die Beurteilung der Zellwachstumshemmung Fähigkeiten der getesteten Verbindung.

Der MTT-kolorimetrischen Assay wird in 96-Well-Plattenformat ²³ geleitet. Die Zellen können Vorinkubation in den Vertiefungen vor der Zugabe des getesteten Arzneimittels erforderlich. Die Vorinkubation Zeiten 0-24 Stunden nach der Zelllinie Eigenschaften variieren. Die Zellen werden in der Regel auf die Droge für 24-96 Stunden in Abhängigkeit von der Wirkstoffaktivität ausgesetzt. MTT-Lösung wird dann zu der behandelten Zellen, in denen die Schrei hinzugefügtow MTT zu Formazan lila durch eine Vielzahl von mitochondrialer und cytosolischer Enzyme, die in betriebsfähiger Zellen (Fig. 1) ²⁴ verringert. Der MTT-Molekül nicht durch tote Zellen oder roten Blutzellen (metabolisch inaktiven Zellen) Milzzellen (ruhende Zellen) und Concanavalin A-stimulierten Lymphozyten (aktivierte Zellen) ²² verringert. Nach 3-4 h Inkubation mit MTT Formazan die Niederschläge. Die Bildung des Formazan beginnt nach 0,5 h Inkubation aber für optimale Ergebnisse ist es am besten, um die Zellen zu MTT für mindestens 3 h ²² freizulegen. Folglich wird das Wachstumsmedium entfernt und die Formazan wird in einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt Isopropanol ²⁵ gelöst, obwohl DMSO kann auch verwendet werden ^26. Die Beseitigung des Mediums ist für genaue Ergebnisse zu erzielen, da Phenolrot, die in Wachstumsmedium weit verbreitet ist, und Ausfällen von Proteinen mit der Absorptionsmessung ²⁵ stören. Wenn die formaZan homogene Lösung erreicht, die Absorption der Lösung wird unter Verwendung eines Mikroplatten-Lese Spektrophotometer gemessen. Die Absorption bei 550 nm ist direkt proportional zur Anzahl der Zellen im Bereich von 200-50,000 Zellen pro Vertiefung, und somit können sehr kleine Mengen von ²² Zellen nachgewiesen werden. Die Absorption zeigt die Menge an lebensfähigen Zellen, die nach der Behandlung mit dem Arzneimittel blieb, und ist mit der Absorption von Kontrollzellen, die nicht mit dem Arzneimittel ausgesetzt waren, verglichen. Analyse der Ergebnisse durch geeignete Software stellt die IC ₅₀ (Inhibierung Konzentration, 50%)-Werte und ihre statistische Fehler auf der Grundlage mehrerer Wiederholungen der Messung.

Der MTT-Assay ist weit verbreitet in Zytotoxizitätsuntersuchungen für das Screening neuer Antikrebsverbindungen aufgrund ihrer relativen Einfachheit und Genauigkeit. Jedoch bei der Verwendung des MTT-Tests, die auf enzymatische Reaktion abhängig ist, man bedenken muß, daß verschiedene Enzyminhibitoren können die Reduktion von MTT Affektd zu falschen Ergebnissen führen ^27. Darüber hinaus bedeutet das MTT-Assay keine Information über den molekularen Mechanismus der zytotoxischen Aktivität des Wirkstoffs ^2.

Protokoll

1. Vorbereitung des V (V)-Komplex (Abbildung 2); ¹⁸ Schritte 1.1-1.4 Verhalten in einem Handschuhkasten, wenn ein Handschuhfach nicht verfügbar ist, fahren Sie mit der alternativen Schritte 2 (2,1 bis 2,6).
   1. Man löst 0.42 mmol des Liganden L H ₂ in trockenem THF und unter Rühren zu einer Lösung äquivalenter Mengen VO (O i Pr) ₃ in THF hinzu.
   2. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 15 min und entfernt die flüchtigen Bestandteile im Vakuum.
   3. In kaltem Hexan und entfernen Sie es unter Vakuum. Ein dunkelviolett Pulver sollte in einer quantitativen Ausbeute erhalten werden.
   4. Wiegen 8 mg der erhaltenen Verbindung in ein Eppendorf-Röhrchen. Fahren Sie mit Schritt 3.
2. Bereiten Sie die V (V)-Komplex mit einem Schlenk-Linie.
   1. Lösen 0,42 mmol des Liganden H ₂ L in trockenem THF in einem trockenen Schlenk-Kolben mit einem Septum Kappe, bringen zu einem Schlenk-und Wechsel gelten Vakuum / Inertgas (N ₂ oder Ar)-Umgebungen, empfiehlt es sich, drei s geltenuch Runden und warten 2-5 min auf den Vakuumstufen.
   2. In trockenem THF über eine Spritze durch das Septum Kappe.
   3. Hinzufügen äquivalente Mengen VO (O i Pr) ₃ in einer THF-Lösung, die in ähnlicher Weise durch Einhaken eines richtigen trockenen Schlenk-Kolben mit der Leitung, Anlegen einer inerten Umgebung und das Hinzufügen der Reagenzien mittels einer Spritze aus der Vanadiumlösung zu der hergestellt worden war, der Ligand.
   4. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 15 min und entfernt die flüchtigen Bestandteile unter Vakuum, wenn es ein Anliegen der instabilen Produkten, führen Schlenk Art Destillation der flüchtigen Bestandteile unter einer inerten Atmosphäre, die Nutzung inerten Gasstrom auf die erforderliche Glaswaren, die vorgetrocknet worden war befestigen .
   5. In kaltem Hexan und entfernen Sie es unter Vakuum. Ein dunkelviolett Pulver sollte in einer quantitativen Ausbeute erhalten werden.
   6. Wiegen 8 mg der erhaltenen Verbindung in ein Eppendorf-Röhrchen.
3. Herstellung der Ti (IV)-Komplex (Fig. 2); ²⁸ Verhalten Schritte 3.1-3.3 in einem Handschuhkasten, wenn ein Handschuhfach nicht verfügbar ist, stellen Sie die Alternative Schritte für die Vanadium-Analogon (Schritt 2), die anstelle einer Schlenk-beschäftigen diskutiert.
   1. Man löst 0.35 mmol des Liganden L H ₂ in trockenem THF und unter Rühren zu einer Lösung äquivalenter Mengen von Ti (O i Pr) ₄ in THF hinzu.
   2. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Entfernen der flüchtigen Bestandteile unter Vakuum zu einem gelben Produkt in quantitativer Ausbeute zu ergeben.
   3. Wiegen 8 mg der erhaltenen Verbindung in Eppendorf Fläschchen.
4. Herstellung von HT-29-Zellen 96-Well-Platte
   1. Kultur HT-29-Zellen in einer 75 cm ^2-Kolben mit RPMI-1640-Medium, das 1% Penicillin / Streptomycin-Antibiotika, 1% L-Glutamin und 10% fötalem Rinderserum (FBS), bei 37 ° C mit 5% CO ₂ enthält, .
   2. Entfernen Sie das Medium, wenn die HT-29-Zellen erreichen maximale Konfluenz (90-100%, alle 3-4 Tage ohne Subkultur). Waschen mit 1 mlTrypsin (0,25%) / EDTA (0,05%)-Lösung und entfernen.
   3. 1 ml Trypsin (0,25%) / EDTA (0,05%)-Lösung und Inkubation für 5 min.
   4. Lösen Sie die HT-29-Zellen aus dem Kolben und 10 ml des Mediums, um die Trypsin-Aktivität zu deaktivieren. Jeweils 5 ml der Zellen-Gemisch zu einer Röhre.
   5. Verwenden Pipette ein paar Tropfen der Mischung in Zellen Zähler Kammer übertragen. Der Zähler Kammer 5 x 5 Quadrate.
   6. Zählen Sie die Zellen in 5 repräsentative Quadrate mit einem Mikroskop: Die 4 Quadrate in den Ecken und die eine, die in der Mitte ist.
   7. Berechnen Sie die geschätzte Menge der Zellen vorhanden. Addieren Sie die Zellen in den fünf repräsentativen Plätzen und teilen durch 20.
   8. Teilen 0,6 durch das Ergebnis von Schritt 4.7. Die empfangene Nummer ist die Menge des Zellgemisches pro Platte erforderlich. Diese Berechnung bezieht sich auf eine Platte, die 0,6 x 10 ⁶ Zellen (9000 Zellen pro Vertiefung) enthält.
   9. Verwenden Pipette, die Menge des Zellgemisch pro p erforderlich übertragenEnde (wie in Abschnitt 4.8 berechnet) und fügen 13,2 ml Medium (200 ul pro Well × 66 Vertiefungen).
   10. Fügen Sie die Mischung auf 96-Well-Platte mit 11-Kanal-Pipette (200 ul pro Well, 6 Zeilen, 66 Brunnen insgesamt). Ein gut jeder Zeile sollte für leere Steuer leer bleiben.
   11. Inkubieren der Platte bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 24 Stunden, damit die Zellen an der Platte zu befestigen.
5. Einführen der Verbindungen
   1. Nach Zugabe von 200 ul (oder andere Menge entsprechend dem gewünschten Konzentrationsbereich) trockenes THF zu 8 mg jeder Verbindung gewogen, wie in Schritt 1.4 (oder 2.6) und 3.3 beschrieben. Wiegen 8 mg des Liganden L ₂ H, zu.
   2. Verdünnen Sie jede Verbindung Lösung durch Zugabe von 60 ul THF in 9 verschiedenen Eppendorf-Röhrchen.
   3. Transfer mit einer Pipette 60 ul der Mischung in Abschnitt 5.1 zur ersten Eppendorf-Röhrchen, resuspendieren und 60 ul Über zum nächsten Fläschchen, und so weiter, bis 10 verschiedene Konzentrationen obtained (einschließlich der Mutter Mischung in Abschnitt 5.1).
   4. Verdünne 20 &mgr; l jeder Konzentration in THF mit 180 &mgr; l Medium.
   5. Bereiten Sie eine Lösung mit nur Steuer THF; 20 ul THF mit 180 ul Medium in jeder Messung.
   6. Hinzufügen von 10 &mgr; l der resultierenden Lösung (einschließlich des Steuer THF), zu jeder Vertiefung, das bereits 200 ul der oben erwähnten Lösung von Zellen in dem Medium bis zu einer Endkonzentration der Verbindung von bis zu 200 mg / l zu ergeben (die Konzentrationsbereich nach der Verbindung Aktivität) verändert werden.
   7. Sie können etwas Niederschlag auf dem höchsten je nach Löslichkeit der Verbindung angewendet Konzentration zu beobachten.
   8. Wiederholen Sie jede Messung der Verbindung 3x (3 Linien in der Platte der gleichen Verbindung), jede Zeile enthält: Zellen mit der Verbindung in 10 verschiedenen Konzentrationen, 1 Vertiefung, die Zellen mit Lösungsmittel nur zur Steuerung und ein gut behandelt ohne Zellen für leere behandelt Kontrolle.
   9. Inkubieren der geladenen Platte für 3 Tage bei 37 ° C in 5% CO _{2-Atmosphäre.}
6. Zytotoxizität Messung unter Verwendung des MTT-Assays
   1. Vorbereitung der MTT-Lösung durch Zugabe von 1 g Pulver auf eine MTT 200 ml einer Lösung von RPMI-1640-Medium ohne Phenolrot. Die Stammlösung kann bis zu 15-ml-Röhrchen aufgeteilt und in -20 ° C gelagert werden
   2. In 20 ul MTT-Lösung in jede Vertiefung mit 11-Kanal-Pipette (außer in den leeren Brunnen ohne Kontrolle der Zellen aus Schritt 4.10) und Inkubation der Platte für weitere 3 Stunden.
   3. Entfernen Sie die mittlere Lösung aus jeder Vertiefung.
   4. In 200 ul Isopropanol in jede Vertiefung zu Formazan aufzulösen. Rühren Sie die Platte für 0,5 Stunden, bis Homogenität erreicht ist.
   5. Die Absorption bei 550 nm für 200 ul des oben genannten Lösung mit einem Mikroplatten-Reader Spektralphotometer.
   6. Wiederholen Sie jede Messung (das sind 3 Wiederholungen, siehe Schritt 5.8) auf drei verschiedenen Tagen.
   7. Berechnen Sie ter Anteil der Lebensfähigkeit der Zellen durch den Abzug der Blindkontrolle Absorptionswert aus dem Messwert und teilt das Ergebnis durch die Absorption der Lösungsmittel THF Steuerwert multipliziert mit 100%.
   8. Berechnen Sie IC _50-Werte mit GraphPad Prism-Software (oder gleichwertig).
   9. Die berichteten IC ₅₀ ist der Durchschnitt der _IC50-Werte an mindestens drei verschiedenen Tagen gesammelt, und der Fehlerwert ist die Standardabweichung.

Ergebnisse

Die Komplexe wurden basierend auf den festgelegten Verfahren ^18,28 und ihre Reinheit durch NMR und Elementaranalyse ausgewertet werden vorbereitet.

Die aus dem MTT-Test erhaltenen Daten analysiert, um die Zytotoxizität der Verbindung ^18,21 auszuwerten. Zunächst Subtraktion des Blindkontrolle Absorptionswert von allen anderen Werten durchgeführt wird. Zweitens wird das Lösungsmittel THF Steuerwert auf 100% Rentabilität eingestellt, da keine wachstumshemmende Verbind...

Diskussion

Die in dieser Handschrift beschriebenen Methode kombiniert die chemische Synthese mit biologischen Zelllebensfähigkeitstest. Wie bei allen biologischen Methoden zur lebensfähigen Zellen, ist es wichtig, in einer laminaren Haube arbeiten und sterilen Bedingungen, einschließlich der Verwendung von sterilen organischen Lösungsmitteln zu halten. Auch sollte der Herstellung und Lagerung von hydrolytisch instabilen Metall basierte Medikamente unter inerten Bedingungen durchgeführt werden, für das Handschuhfach oder-Schl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Hexane AR	Gadot	830122313	Dried using a solvent drying system
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38
Isopropanol AR	Gadot	830111370
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
MTT	Sigma-Aldrich	M5655-1G
Penicillin/streptomycin antibiotics	Biological Industries	03-031-1B
RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine	Sigma-Aldrich	R8758
RPMI without phenol red	Biological Industries	01-103-1A
Tetrahydrofuran (THF) AR	Gadot	830156391	dried using a solvent drying system
Ti(OiPr)4	Sigma-Aldrich	205273-500ML	moisture sensitive
Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-052-1B
VO(OiPr)3	Sigma-Aldrich	404926-10G	moisture sensitive
			Equipment
12-channel pipette 30-300 μl	Thermo Scientific
12-channel pipette 5-50 μl	Finnpipette
75 cm2 flask	NUNC	156472
96-well plate with lid (flat bottom)	NUNC	167008
CO2 Incubator	Binder	APT.line C150
Counter chamber	Marienfeld-Superior	650030
Eppendorf vial	KARTELL
Glove box	M. Braun
Laminar flow hood	ADS LAMINAIRE	OPTIMALE 12
Microplate reader spectrophotometer	Bio-Tek	El-800
Microscope	Nikon	Eclipse TS100
Pipette 20-200 μl	Finnpipette
Pipette 5-50 μl	Finnpipette