Complexes métalliques anticancéreux: Synthèse et évaluation de la cytotoxicité par le dosage au MTT

Résumé

Procédé pour la synthèse de titane et de vanadium agents anticancéreux sensibles à l'air est décrite, ainsi que l'évaluation de leur activité cytotoxique envers la lignée cellulaire de cancer humain par le test MTT.

Résumé

Titane (IV) et de vanadium (V) les complexes sont des agents anticancéreux très puissants. Un défi dans leur synthèse se réfère à leur instabilité hydrolytique; par conséquent, leur préparation doit être effectuée sous une atmosphère inerte. Evaluation de l'activité anti-cancéreuse de ces complexes peut être réalisée par le test MTT.

Le test MTT est un test colorimétrique basé sur la viabilité de la réduction enzymatique de la molécule de MTT en formazan quand il est exposé à des cellules viables. Le résultat de la réduction est un changement de couleur de la molécule de MTT. Les mesures de l'absorbance par rapport à un contrôle déterminent le pourcentage restant de cellules cancéreuses viables après leur traitement avec des concentrations variables d'un composé testé, ce qui se traduit pour l'activité anticancéreuse du composé et de ses valeurs _{de CI50.} Le test MTT est largement commune dans les études de cytotoxicité en raison de sa précision, la rapidité et la simplicité relative.

Ici nous avons préenvoyer un protocole détaillé pour la synthèse de médicaments à base d'air en métal sensible et les mesures de viabilité cellulaire, y compris la préparation des plaques de la cellule, l'incubation des composés avec des cellules, des mesures de viabilité en utilisant le test MTT, et la détermination des valeurs _{de CI50.}

Introduction

La chimiothérapie est encore l'un des principaux cours de traitements utilisés dans la clinique pour diverses maladies cancéreuses, et donc grande quantité de recherche est menée dans le monde entier dans le but de développer de nouvelles et améliorées des médicaments anticancéreux. Ces études commencent surtout au niveau chimique, la conception et la préparation de composés, suivie par l'évaluation biologique des propriétés cytotoxiques in vitro. La viabilité cellulaire peut être évaluée par des dosages différents qui fournissent des informations sur l'activité cellulaire ^2.1.

Le cisplatine est un exemple d'un complexe de platine qui est largement utilisé comme un médicament chimiothérapeutique, qui est considéré comme un traitement efficace surtout pour les cancers testiculaires et ovariennes ^4.3. Toutefois, son domaine d'activité étroit et des effets secondaires graves déclenchent des études d'autres complexes de métaux de transition puissant ^5-8. Entre autres, le titane (IV) et de vanadium (V) complexes ont montré des résultats prometteurs de haute activité et de réduire^9-16 toxicité. Ti (IV) complexes ont été les premiers à entrer en essais cliniques après le cisplatine en raison de ces propriétés, mais ils ont échoué les essais en raison de difficultés de formulation et de l'instabilité à l'hydrolyse. Il existe donc un besoin de développer des dérivés de courant améliorées de ces complexes métalliques qui peuvent combiner une forte activité anti-cancéreuse de la résistance à l'eau ^15,17-21.

Un défi dans la préparation de Ti (IV) et V (V) se réfère à des complexes de l'instabilité hydrolytique des réactifs précurseurs et, par conséquent, une atmosphère inerte doit être maintenue. La préparation de Ti (IV) et V (V) est effectuée dans des composés N ₂ ou Ar conditions dans une boîte à gants ou en utilisant des techniques de ligne de Schlenk.

Une méthode courante pour l'évaluation de l'activité anti-cancer est basée sur le MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) de bromure -2,5-diphényltétrazolium) dosage. Ce test est un test de viabilité colorimétrique qui a été présenté en 1983 par Mosmann^22. Il est très bien étudié et caractérisé, et il est considéré comme très efficace pour évaluer l'efficacité de nouveaux composés cytotoxiques en raison de sa précision, de rapidité, et sa capacité à être appliqué sur la variété de lignées cellulaires. Ce test de viabilité est basé sur le changement de couleur de la molécule de MTT quand il est exposé à des cellules viables. La mesure de l'absorbance, qui est proportionnelle au nombre de cellules viables, et la comparaison à des témoins non traités, l'évaluation de la capacité d'inhibition de croissance des cellules du composé testé permet.

Le test colorimétrique MTT est conduite dans un format de plaque à 96 puits ^23. Les cellules peuvent nécessiter une pré-incubation dans les puits avant l'ajout du médicament testé. Les temps de pré-incubation peut varier de 0 à 24 heures en fonction des propriétés de la ligne de cellule. Les cellules sont généralement exposés à la drogue pour 24-96 heures en fonction de l'activité du médicament. Solution de MTT est ensuite ajouté à des cellules traitées, où le hurlentow MTT est réduit en formazan pourpre par une variété d'enzymes mitochondriales et cytosoliques qui sont opérationnels dans les cellules viables (figure 1) ^24. La molécule MTT n'est pas réduite par les cellules mortes ou des cellules rouges du sang (cellules métaboliquement inactives), des cellules de rate (cellules au repos) et la concanavaline A lymphocytes stimulés par les cellules activées ^(22). Après 3-4 heures d'incubation avec les MTT Les précipités formazan. La formation de formazan commence après 0,5 h d'incubation, mais pour des résultats optimaux, il est préférable d'exposer les cellules à du MTT pendant au moins 3 heures ^22. Par conséquent, le milieu de culture est éliminé et le formazan est solubilisé dans un solvant organique, de préférence l'isopropanol ^25, bien que le DMSO peut également être utilisé ^26. L'élimination du milieu est crucial pour l'obtention de résultats précis puisque le rouge de phénol, qui est largement commun dans le milieu de croissance, et en précipitant les protéines peuvent interférer avec la mesure de l'absorbance ^25. Lorsque la formazan solution homogène atteint, l'absorbance de la solution est mesurée en utilisant un spectrophotomètre lecteur de microplaques. L'absorbance à 550 nm est directement proportionnelle au nombre de cellules dans la gamme de 200-50,000 cellules par puits, et donc de très petites quantités de cellules peut être détectée ^22. L'absorbance indique la quantité de cellules viables qui reste après le traitement avec le médicament, et est comparée à l'absorbance des cellules témoins qui n'ont pas été exposés au médicament. L'analyse des résultats par un logiciel approprié fournit la (concentration d'inhibition; 50%) IC ₅₀ valeurs et leurs erreurs statistiques basées sur plusieurs répétitions de la mesure.

Le test MTT est largement commun dans des études de cytotoxicité pour le criblage de nouveaux composés anti-cancéreux, en raison de sa précision et sa relative simplicité. Cependant, lors de l'utilisation du test MTT, qui est dépend de la réaction enzymatique, on doit considérer que les différents inhibiteurs d'enzymes peuvent affecter la réduction du MTT und conduire à des résultats erronés ^27. En outre, le test MTT ne fournit pas d'informations sur le mécanisme moléculaire de l'activité cytotoxique du médicament ^2.

Protocole

1. Préparation de la V (V) complexe (figure 2); ¹⁸ conduite étapes 1.1-1.4 dans une boîte à gants, si une boîte à gants n'est pas disponible, passez à l'alternative étapes 2 (2.1-2.6).
   1. Dissoudre 0,42 mmol des ligands H ₂ L dans le THF sec et l'ajouter à une solution sous agitation de quantités équivalentes de VO (O i Pr) ₃ dans le THF.
   2. On agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 15 minutes, et retirer les substances volatiles sous vide.
   3. Ajouter hexane froid et retirer sous vide. Une poudre violet foncé doit être obtenu avec un rendement quantitatif.
   4. Peser 8 mg du composé obtenu dans un flacon Eppendorf. Passer à l'étape 3.
2. Préparer le complexe V (V) en utilisant un tube de Schlenk.
   1. Dissoudre 0,42 mmol du ligand H ₂ L dans du THF sec dans un ballon de Schlenk sec avec un bouchon à septum, attacher à une ligne de Schlenk et s'applique vide / gaz inerte (N ₂ ou Ar) environnements alternatif, il est recommandé d'appliquer trois sette tours et attendre 2-5 minutes sur les étages de vide.
   2. Ajouter THF sec via une seringue à travers le septum.
   3. Ajouter des quantités équivalentes de VO (O i Pr) ₃ dans une solution de THF, qui a été préparé de manière similaire en l'accrochant un ballon de Schlenk sec propre à la ligne, application d'un milieu inerte et en ajoutant les réactifs par l'intermédiaire d'une seringue à partir de la solution de vanadium à celle de la le ligand.
   4. Incorporer le mélange de réaction à température ambiante pendant 15 minutes et enlever les substances volatiles sous vide, si il ya une préoccupation de produits instables, effectuer le type Schlenk distillation des substances volatiles sous atmosphère inerte; utiliser les flux de gaz inerte pour fixer la verrerie nécessaire qui avait été préalablement séché .
   5. Ajouter hexane froid et retirer sous vide. Une poudre violet foncé doit être obtenu avec un rendement quantitatif.
   6. Peser 8 mg du composé obtenu dans un flacon Eppendorf.
3. Préparation du Ti (IV) complexe (Figure 2), ²⁸ conduite étapes 3.1 à 3.3 dans une boîte à gants, et si une boîte à gants n'est pas disponible, ajuster les étapes alternatives examinées pour l'analogue de vanadium (étape 2) qui utilisent à la place un tube de Schlenk.
   1. Dissoudre 0,35 mmole du ligand L ₂ H dans du THF sec, et l'ajouter à une solution sous agitation de quantités équivalentes de Ti (O i Pr) ₄ dans du THF.
   2. On agite le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 2 h. Retirer les substances volatiles sous vide pour donner un produit jaune avec un rendement quantitatif.
   3. Peser 8 mg du composé obtenu dans l'Eppendorf flacon.
4. Préparation des cellules HT-29 plaque de 96 puits
   1. Culture cellules HT-29 dans un flacon de 75 ^cm2 avec du milieu RPMI-1640 contenant 1% de pénicilline / antibiotiques streptomycine, 1% de L-glutamine et 10% de sérum bovin fœtal (FBS), à 37 ° C avec 5% de CO ₂ .
   2. Retirez le support lorsque les cellules HT-29 atteignent la confluence maximale (90-100%, tous les 3-4 jours sans sous-culture). Laver avec 1 mlde trypsine (0,25%) / EDTA (0,05%) solution et le retirer.
   3. Ajouter 1 ml de trypsine (0,25%) / EDTA (0,05%) et incuber la solution pendant 5 min.
   4. Détacher les cellules HT-29 de la fiole et ajouter 10 ml du milieu de désactiver l'activité de la trypsine. Transférer 5 ml du mélange de cellules dans un tube.
   5. Utilisez la pipette pour transférer quelques gouttes du mélange de cellules dans la chambre de compteur. La chambre de compteur comporte 5 x 5 carrés.
   6. Compter les cellules à 5 places représentatives à l'aide d'un microscope: les 4 carrés dans les coins et celui qui est au milieu.
   7. Calculer le montant estimé de cellules présentes. Additionner les cellules dans les 5 carrés représentatifs et diviser par 20.
   8. Diviser par 0,6 la suite de l'étape 4.7. Le nombre obtenu est la quantité de mélange de cellules requis par plaque. Ce calcul repose sur un plateau qui contient de 0,6 x 10 ⁶ cellules (9.000 cellules par puits).
   9. Utilisez la pipette pour transférer la quantité de mélange de cellules requises par pfin (tel que calculé à la section 4.8) et ajouter 13,2 ml du milieu (200 pi par puits × 66 puits).
   10. Ajouter le mélange à la plaque de 96 puits par 11 canaux pipette (200 pi par puits, 6 lignes, 66 puits au total). Un puits de chaque ligne doit rester vide pour contrôle à blanc.
   11. Incuber la plaque à 37 ° C avec 5% _de CO2 pendant 24 heures pour permettre aux cellules de se fixer à la plaque.
5. Insertion des composés
   1. Ajouter 200 ul (ou quantité différente en fonction de la plage de concentration souhaitée) de THF sec à 8 mg de chaque composé pesé comme décrit dans l'étape 1.4 (ou 2.6) ou 3.3. Peser 8 mg du ligand L ₂ H, aussi.
   2. Diluer chaque solution de composé plus loin en ajoutant 60 pl de THF dans 9 des tubes Eppendorf différentes.
   3. Aide d'une pipette 60 ul du mélange à la section 5.1 de la première fiole Eppendorf, remettre en suspension et le transfert de 60 pi à l'autre flacon, et ainsi de suite jusqu'à 10 concentrations différentes sont obtained (y compris le mélange de parent dans la section 5.1).
   4. Diluer 20 ul de chaque concentration dans le THF avec 180 ul de milieu.
   5. Préparer une solution de contrôle uniquement avec du THF; 20 ul de THF avec 180 ul de milieu dans chaque mesure.
   6. Ajouter 10 ul de la solution résultante (y compris le contrôle de THF), à chaque puits contenant déjà 200 ul de la solution mentionnée ci-dessus de cellules dans le milieu pour obtenir des concentrations finales du composé de jusqu'à 200 mg / L (la plage de concentration peut être modifiée en fonction de l'activité de composé).
   7. Vous pouvez observer une certaine précipitation à la concentration maximale appliquée en fonction de la solubilité du composé.
   8. Répéter chaque mesure des 3x composés (3 conducteurs de la plaque du même composé); chaque ligne contient: cellules traitées avec le composé à 10 concentrations différentes, une des cellules et contenant traités avec le solvant seul pour le contrôle et 1 puits sans cellules pour flan contrôle.
   9. Incuber la plaque chargée pendant 3 jours à 37 ° C dans 5% de CO _2, atmosphère.
6. la mesure de la cytotoxicité en utilisant l'essai au MTT
   1. Préparer la solution de MTT en ajoutant 1 g de poudre de MTT à une solution de 200 ml de milieu RPMI-1640 sans rouge de phénol. La solution mère peut être divisée pour tubes de 15 ml et stocké à -20 ° C.
   2. Ajouter 20 ul de solution de MTT à chaque canal de 11 puits en utilisant une pipette (sauf pour les puits témoins à blanc sans les cellules de l'étape 4.10), et incuber la plaque pendant 3 heures supplémentaires.
   3. Retirer la solution de milieu de chaque puits.
   4. Ajouter 200 pi d'isopropanol à chaque puits pour dissoudre le formazan. Incorporer la plaque pendant 0,5 heure jusqu'à homogénéité est atteint.
   5. Mesurer l'absorbance à 550 nm de 200 pl de la solution mentionnée ci-dessus par un spectrophotomètre lecteur de microplaques.
   6. Répétez chaque mesure (qui comprend 3 répétitions, voir étape 5.8) sur 3 jours différents.
   7. Calculer til pourcentage de viabilité cellulaire en déduisant la valeur d'absorbance de contrôle à blanc à partir de la valeur mesurée, en divisant le résultat par l'absorbance de la valeur de commande de solvant THF et en multipliant par 100%.
   8. Calculer les valeurs _{de CI50} en utilisant le logiciel GraphPad Prism (ou équivalent).
   9. L'IC ₅₀ rapportée est la moyenne de toutes les valeurs _{de CI50} collectées sur au moins trois jours différents, et la valeur d'erreur est la déviation standard.

Résultats

Les complexes ont été préparés sur la base de procédures établies ^18,28 et leur pureté peut être évaluée par analyse RMN et élémentaire.

Les données reçues à partir du test MTT est analysé pour évaluer la cytotoxicité du composé ^18,21. Tout d'abord, la soustraction de la valeur d'absorbance de contrôle à blanc à partir de toutes les autres valeurs est réalisée. En second lieu, le solvant THF valeur de commande est réglée à 100% de viab...

Discussion

La méthode décrite dans ce manuscrit combine synthèse chimique biologique avec dosage de la viabilité cellulaire. Comme avec toutes les méthodes biologiques concernant les cellules viables, il est essentiel de travailler sous une hotte laminaire, et de maintenir des conditions stériles, y compris l'utilisation de solvants organiques stériles. De plus, la préparation et le stockage de médicaments à base métallique hydrolytiquement instables doivent être effectuées dans des conditions inertes, pour lequel...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Hexane AR	Gadot	830122313	Dried using a solvent drying system
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38
Isopropanol AR	Gadot	830111370
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
MTT	Sigma-Aldrich	M5655-1G
Penicillin/streptomycin antibiotics	Biological Industries	03-031-1B
RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine	Sigma-Aldrich	R8758
RPMI without phenol red	Biological Industries	01-103-1A
Tetrahydrofuran (THF) AR	Gadot	830156391	dried using a solvent drying system
Ti(OiPr)4	Sigma-Aldrich	205273-500ML	moisture sensitive
Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-052-1B
VO(OiPr)3	Sigma-Aldrich	404926-10G	moisture sensitive
Equipment
12-channel pipette 30-300 μl	Thermo Scientific
12-channel pipette 5-50 μl	Finnpipette
75 cm2 flask	NUNC	156472
96-well plate with lid (flat bottom)	NUNC	167008
CO2 Incubator	Binder	APT.line C150
Counter chamber	Marienfeld-Superior	650030
Eppendorf vial	KARTELL
Glove box	M. Braun
Laminar flow hood	ADS LAMINAIRE	OPTIMALE 12
Microplate reader spectrophotometer	Bio-Tek	El-800
Microscope	Nikon	Eclipse TS100
Pipette 20-200 μl	Finnpipette
Pipette 5-50 μl	Finnpipette