Anticancerosos complejos metálicos: Síntesis y Evaluación de la citotoxicidad por el ensayo MTT

Resumen

Un método para la síntesis de agentes de titanio y vanadio contra el cáncer sensibles al aire se describe, junto con la evaluación de su actividad citotóxica hacia línea celular de cáncer humano por el ensayo MTT.

Resumen

Complejos de titanio (IV) y vanadio (V) son agentes anticancerígenos altamente potentes. Un reto en su síntesis se refiere a su inestabilidad hidrolítica, por lo tanto su preparación debe llevarse a cabo bajo una atmósfera inerte. Evaluación de la actividad contra el cáncer de estos complejos se puede lograr mediante el ensayo de MTT.

El ensayo MTT es un ensayo de viabilidad colorimétrico basado en la reducción enzimática de la molécula de MTT a formazán cuando se expone a las células viables. El resultado de la reducción es un cambio de color de la molécula MTT. Las mediciones de absorbancia relativos a un control determinan el porcentaje restante de las células cancerosas viables después de su tratamiento con concentraciones variables de un compuesto ensayado, que se traduce a la actividad contra el cáncer compuesto y sus valores de CI _50. El ensayo MTT es ampliamente común en estudios de citotoxicidad debido a su precisión, rapidez y relativa sencillez.

En esto nos preenviado un protocolo detallado para la síntesis de los fármacos basados ​​en metales sensibles al aire y mediciones de viabilidad celular, incluyendo la preparación de las placas de células, la incubación de los compuestos con las células, las mediciones de viabilidad utilizando el ensayo de MTT, y la determinación de los valores de _IC50.

Introducción

La quimioterapia es todavía uno de los platos principales de los tratamientos empleados en la clínica para varias enfermedades de cáncer, por lo que gran cantidad de investigación se lleva a cabo en todo el mundo con el objetivo de desarrollar nuevos y mejores medicamentos contra el cáncer. Estos estudios comienzan principalmente a nivel químico, con el diseño y la preparación de los compuestos, seguido de evaluación biológica de las propiedades citotóxicas in vitro. La viabilidad celular puede evaluarse mediante diversos ensayos que proporcionan información sobre la actividad celular ^1-2.

El cisplatino es un ejemplo de un complejo de platino que se utiliza ampliamente como un fármaco quimioterapéutico, que se considera un tratamiento eficaz principalmente para los cánceres testiculares y ováricos ^3-4. Sin embargo, su estrecho rango de actividad y los efectos secundarios graves se activan los estudios de otros complejos de metales de transición potente ^5-8. Entre otros, de titanio (IV) y vanadio complejos (V) mostraron resultados prometedores de alta actividad y reducentoxicidad ^9-16. Ti (IV) fueron los primeros en entrar en ensayos clínicos después de cisplatino debido a estas propiedades, sin embargo, han fallado los ensayos debido a las dificultades de formulación y la inestabilidad hidrolítica. Hay así una necesidad actual para desarrollar mejores derivados de estos complejos metálicos que pueden combinar alta actividad contra el cáncer con resistencia al agua ^15,17-21.

Un reto en la preparación de Ti (IV) y V (V) se refiere a complejos de la inestabilidad hidrolítica de los reactivos precursores, por lo tanto, la atmósfera inerte debe mantenerse. La preparación de Ti (IV) y V (V) compuestos se lleva a cabo en atmósfera _de N2 o Ar condiciones en una caja de guantes o utilizando técnicas de línea Schlenk.

Un método común para la evaluación de la actividad anti-cáncer se basa en el MTT (3 - (4,5-dimetiltiazolil) -2,5-difeniltetrazolio) de ensayo. Este ensayo es un ensayo de viabilidad colorimétrico que se presentó en 1983 por Mosmann^22. Está muy bien estudiado y caracterizado, y se considera altamente eficiente en la evaluación de la eficacia de nuevos compuestos citotóxicos debido a su precisión, rapidez, y su capacidad para ser aplicada en la variedad de líneas celulares. Este ensayo de viabilidad se basa en el cambio de color de la molécula MTT cuando se expone a las células viables. Medición de la absorbancia, que es proporcional al número de células viables, y la comparación con los controles no tratados, permite la evaluación de las capacidades de inhibición del crecimiento celular del compuesto ensayado.

El ensayo colorimétrico de MTT se lleva a cabo en un formato de 96 pocillos placa ^23. Las células pueden requerir la preincubación en los pocillos antes de la adición del fármaco probado. Los tiempos de preincubación puede variar desde 0 hasta 24 horas de acuerdo con las propiedades de la línea celular. Las células están normalmente expuestas a la droga durante 24-96 horas, dependiendo de la actividad del fármaco. Solución de MTT se añade entonces a las células tratadas, en el que el gritanOW MTT se reduce a formazán púrpura por una variedad de enzimas mitocondriales y citosólicas que están en funcionamiento en las células viables (Figura 1) ^24. La molécula de MTT no se reduce por las células muertas o células rojas de la sangre (células metabólicamente inactivos), células de bazo (células en reposo) y concanavalina A linfocitos estimulada (células activadas) ^22. Después de 3-4 horas de incubación con MTT formazan los precipitados. La formación del formazano comienza después de 0,5 horas de incubación, pero para obtener resultados óptimos es mejor para exponer las células a MTT durante al menos 3 h ^22. En consecuencia, se elimina el medio de cultivo y el formazán se disuelve en un disolvente orgánico, preferentemente isopropanol ^25, aunque DMSO también se puede utilizar ^26. La eliminación del medio es crucial para la consecución de resultados precisos desde rojo de fenol, que es ampliamente común en medio de crecimiento, y la precipitación de las proteínas pueden interferir con la medición de la absorbancia ^25. Cuando la formaciónsolución Zan alcanza homogénea, la absorbancia de la solución se mide utilizando un espectrofotómetro lector de microplacas. La absorbancia a 550 nm es directamente proporcional al número de células en el rango de 200-50,000 células por pocillo, y por lo tanto muy pequeñas cantidades de células se puede detectar ^22. La absorbancia indica la cantidad de células viables que se mantuvo después del tratamiento con el fármaco, y se compara con la absorbancia de células de control que no fueron expuestos a la droga. Análisis de los resultados por el software adecuado proporciona la _IC50 (concentración de inhibición, el 50%) los valores y los errores estadísticos basados ​​en varias repeticiones de la medición.

El ensayo MTT es ampliamente común en estudios de citotoxicidad para la selección de nuevos compuestos contra el cáncer, debido a su precisión y simplicidad relativa. Sin embargo, cuando se utiliza el ensayo MTT, que se dependía de la reacción enzimática, se debe considerar que varios inhibidores de la enzima pueden afectar a la reducción de MTT und conducir a falsos resultados ^27. Además, el ensayo de MTT no proporciona ninguna información sobre el mecanismo molecular de la actividad citotóxica del fármaco ^2.

Protocolo

1. Preparación de la V (V) complejo (Figura 2); ¹⁸ conducta pasos 1.1 a 1.4 en una caja de guantes, si una caja de guante no está disponible, vaya a la alternativa pasos 2 (2.1 a 2.6).
   1. Disolver 0,42 mmol de los ligandos H ₂ L en THF seco y agregarlo a una solución en agitación de cantidades equivalentes de VO (O i Pr) ₃ en THF.
   2. Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 min, y eliminar los volátiles a vacío.
   3. Añadir hexano frío y quitarlo al vacío. Un polvo de color púrpura oscuro se debe obtener en un rendimiento cuantitativo.
   4. Pesar 8 mg del compuesto obtenido en un vial Eppendorf. Vaya directamente al paso 3.
2. Preparar el complejo V (V) utilizando una línea Schlenk.
   1. Disolver 0,42 mmol del ligando H ₂ L en THF seco en un matraz de Schlenk seco con una tapa de septo, se unen a una línea de Schlenk y se aplica entornos de vacío / gas inerte (N ₂ o Ar) alterna; se recomienda aplicar tres sUCH rondas y esperar 2-5 minutos en las etapas de vacío.
   2. Añadir THF seco mediante una jeringa a través del tapón de septo.
   3. Añadir cantidades equivalentes de VO (O i Pr) ₃ en una solución de THF, que había sido preparado de manera similar enganchando un matraz de Schlenk seco adecuado a la línea, la aplicación de un entorno inerte y la adición de los reactivos a través de una jeringa de la solución de vanadio a la de el ligando.
   4. Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 min y eliminar los volátiles a vacío, y si no es una preocupación de los productos inestables, tipo Schlenk de realizar la destilación de los volátiles bajo atmósfera inerte, el uso de flujo de gas inerte para unir el material de vidrio se requiere que había sido secado previamente .
   5. Añadir hexano frío y quitarlo al vacío. Un polvo de color púrpura oscuro se debe obtener en un rendimiento cuantitativo.
   6. Pesar 8 mg del compuesto obtenido en un vial Eppendorf.
3. Preparación de Ti (IV) complejo (Figura 2); ²⁸ conducta pasos 3.1 a 3.3 en una caja de guantes, si una caja de guantes no está disponible, ajustar las medidas alternativas analizadas para el análogo de vanadio (paso 2), que emplean una línea Schlenk lugar.
   1. Disolver 0,35 mmol del ligando H ₂ L en THF seco y agregarlo a una solución en agitación de cantidades equivalentes de Ti (O i Pr) ₄ en THF.
   2. Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 h. Eliminar los compuestos volátiles a vacío para dar un producto amarillo con un rendimiento cuantitativo.
   3. Pesar 8 mg del compuesto obtenido en el vial Eppendorf.
4. Preparación de las células HT-29 placa de 96 pocillos
   1. Cultura HT-29 células en un matraz de 75 cm ² con medio RPMI-1640 que contiene 1% de penicilina / antibióticos estreptomicina, 1% de L-glutamina, y suero bovino fetal al 10% (FBS), a 37 ° C con 5% de CO ₂ .
   2. Retire el medio cuando las células HT-29 alcanzan la confluencia máxima (90-100%, cada 3-4 días sin subcultura). Lavar con 1 mlde tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) solución y retírela.
   3. Añadir 1 ml de tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) de la solución e incubar durante 5 min.
   4. Separar las células HT-29 del matraz y añadir 10 ml del medio para desactivar la actividad de la tripsina. Transferir 5 ml de la mezcla de células a un tubo.
   5. Use la pipeta para transferir unas gotas de la mezcla de las células en la cámara de mostrador. La cámara de contador incluye 5 x 5 plazas.
   6. Contar las células en 5 cuadrados representativos usando un microscopio: los 4 cuadrados en las esquinas y la que está en el medio.
   7. Calcula el importe estimado de las células presentes. Suma las celdas en las 5 plazas representativas y dividir por 20.
   8. Divida 0.6 por el resultado de la etapa 4.7. El número recibido es la cantidad de mezcla de células requerido por placa. Este cálculo se refiere a una placa que contiene 0,6 x 10 ⁶ células (9000 células por pocillo).
   9. Use la pipeta para transferir la cantidad de mezcla de células requerido por ptarde (tal como se calcula en la sección 4.8) y añadir 13,2 ml del medio (200 l por pocillo × 66 pozos).
   10. Añadir la mezcla a placas de 96 pocillos con una pipeta de 11 canales (200 l por pocillo, 6 líneas, 66 pozos en total). Un pozo de cada línea debe permanecer vacío para el control blanco.
   11. Incubar la placa a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 24 horas para permitir que las células se unan a la placa.
5. La inserción de los compuestos
   1. Añadir 200 l (o diferente cantidad de acuerdo con el intervalo de concentración deseada) de THF seco a 8 mg de cada compuesto pesado como se describe en el paso 1.4 (o 2.6) o 3.3. Pesar 8 mg del ligando H ₂ L, también.
   2. Diluir cada solución de compuesto adicional mediante la adición de 60 l de THF en 9 viales Eppendorf diferentes.
   3. Con una pipeta de 60 l de la mezcla en la sección 5.1 a la primera vial Eppendorf, se resuspende y la transferencia de 60 l al siguiente vial, y así sucesivamente hasta 10 concentraciones diferentes son Obtained (incluyendo la mezcla de los padres en la sección 5.1).
   4. Diluir 20 l de cada concentración en THF con 180 l de medio.
   5. Preparar una solución de control con sólo THF; 20 l de THF con 180 l de medio en cada medición.
   6. Añadir 10 l de la solución resultante (incluyendo el control de THF), a cada pocillo que ya contiene 200 l de la solución antes mencionada de las células en el medio para dar concentraciones finales de compuesto de hasta 200 mg / L (el intervalo de concentración puede ser cambiado de acuerdo con la actividad del compuesto).
   7. Usted puede observar algo de precipitación a la concentración más alta aplicada en función de la solubilidad del compuesto.
   8. Repita cada medición de los compuestos (3x 3 líneas en la placa del mismo compuesto); cada línea contiene: células tratadas con el compuesto en 10 concentraciones diferentes, 1 pocillo que contiene células tratadas con disolvente solo para el control y 1 bien sin células para blanco de control.
   9. Incubar la placa cargada durante 3 días a 37 ° C en el 5% atmósfera de CO _2.
6. Medición de la citotoxicidad utilizando el ensayo MTT
   1. Preparar la solución de MTT mediante la adición de 1 g de polvo de MTT a una solución de medio RPMI-1640 200 ml sin rojo de fenol. La solución madre se pueden dividir para tubos de 15 ml y se almacenan en -20 ° C.
   2. Añadir 20 l de solución de MTT a cada pocillo con una pipeta de 11 canales (excepto a los pocillos de control de blanco sin las células de la etapa 4.10), e incubar la placa durante 3 h adicionales.
   3. Retire la solución del medio de cada pocillo.
   4. Añadir 200 l de isopropanol a cada pocillo para disolver el formazano. Agitar la placa durante 0,5 horas hasta que se alcanza la homogeneidad.
   5. Medir la absorbancia a 550 nm para 200 l de la solución mencionada anteriormente mediante un espectrofotómetro lector de microplacas.
   6. Repita cada medición (que incluye 3 repeticiones, consulte el paso 5.8) en 3 días diferentes.
   7. Calcular tél porcentaje de viabilidad celular mediante la deducción del valor de absorbancia de control en blanco del valor medido, dividiendo el resultado por la absorbancia del valor de control de disolvente THF y multiplicando por 100%.
   8. Calcular los valores de _CI50 usando el software GraphPad Prism (o equivalente).
   9. El IC ₅₀ reportado es el promedio de todos los valores de _CI50 recogidos en al menos tres días diferentes, y el valor de error es la desviación estándar.

Resultados

Los complejos se prepararon sobre la base de los procedimientos establecidos ^18,28 y su pureza se puede evaluar mediante análisis de RMN y elemental.

Los datos recibidos desde el ensayo de MTT se analizaron para evaluar la citotoxicidad del compuesto ^18,21. En primer lugar, se realiza la resta del valor de absorbancia de control en blanco de todos los otros valores. En segundo lugar, el valor de control de disolvente de THF se establece en 100% de viabilidad, como no s...

Discusión

El método descrito en este manuscrito combina síntesis química con ensayo de viabilidad celular biológica. Al igual que con cualquiera de los métodos biológicos relativos a las células viables, es de vital importancia para trabajar en una campana laminar, y mantener las condiciones estériles, incluyendo el uso de disolventes orgánicos estériles. También, la preparación y el almacenamiento de los medicamentos basados ​​en metales hidrolíticamente inestable deben llevarse a cabo bajo condiciones inertes, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Hexane AR	Gadot	830122313	Dried using a solvent drying system
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38
Isopropanol AR	Gadot	830111370
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
MTT	Sigma-Aldrich	M5655-1G
Penicillin/streptomycin antibiotics	Biological Industries	03-031-1B
RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine	Sigma-Aldrich	R8758
RPMI without phenol red	Biological Industries	01-103-1A
Tetrahydrofuran (THF) AR	Gadot	830156391	dried using a solvent drying system
Ti(OiPr)4	Sigma-Aldrich	205273-500ML	moisture sensitive
Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-052-1B
VO(OiPr)3	Sigma-Aldrich	404926-10G	moisture sensitive
Equipment
12-channel pipette 30-300 μl	Thermo Scientific
12-channel pipette 5-50 μl	Finnpipette
75 cm2 flask	NUNC	156472
96-well plate with lid (flat bottom)	NUNC	167008
CO2 Incubator	Binder	APT.line C150
Counter chamber	Marienfeld-Superior	650030
Eppendorf vial	KARTELL
Glove box	M. Braun
Laminar flow hood	ADS LAMINAIRE	OPTIMALE 12
Microplate reader spectrophotometer	Bio-Tek	El-800
Microscope	Nikon	Eclipse TS100
Pipette 20-200 μl	Finnpipette
Pipette 5-50 μl	Finnpipette