Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

Resumo

Um método para a síntese de titânio e vanádio anticancerígenos agentes sensíveis ao ar é descrito, juntamente com a avaliação da sua actividade citotóxica no sentido de linha de células de cancro humano por o Ensaio MTT.

Resumo

De titânio (IV) e vanádio (V) são complexos de agentes anticancerígenos altamente potentes. Um desafio na sua síntese refere-se à sua instabilidade hidrolítica, pelo que a sua preparação deve ser conduzida sob uma atmosfera inerte. Avaliação da actividade anti-cancerígena destes complexos pode ser alcançado através do ensaio MTT.

O ensaio com MTT é um ensaio colorimétrico baseado na viabilidade de redução enzimática da molécula de MTT para formazan, quando ele é exposto a células viáveis. O resultado da redução é uma mudança de cor da molécula de MTT. As medições de absorvância em relação a um controlo de determinar a percentagem de células cancerosas remanescentes viáveis ​​após o seu tratamento com diversas concentrações de um composto de ensaio, que é traduzido para a actividade anti-cancerígena composto e os seus valores de IC _50. O MTT é amplamente comum em estudos de citotoxicidade devido à sua precisão, rapidez e simplicidade relativa.

Aqui nós preenviado um protocolo detalhado para a síntese de medicamentos à base de ar de metal sensível e de medições de viabilidade de células, incluindo a preparação de placas celulares, a incubação dos compostos com as células, medições de viabilidade usando o ensaio de MTT, e determinação dos valores de IC _50.

Introdução

A quimioterapia ainda é um dos principais cursos de tratamentos utilizados na clínica para várias doenças cancerosas, e, assim, grande quantidade de pesquisa é conduzida em todo o mundo com o objetivo de desenvolver novas e melhores drogas anticâncer. Tais estudos principalmente começar no nível químico, com a concepção e preparação de compostos, seguido de avaliação biológica das propriedades citotóxicas in vitro. A viabilidade celular pode ser avaliada por vários ensaios que fornecem informações sobre a actividade celular ^1-2.

A cisplatina é um exemplo de um complexo de platina que é largamente utilizado como um fármaco quimioterapêutico, que é considerado um tratamento eficaz principalmente para testiculares e ovarianos cancros ^3-4. No entanto, a sua gama de atividade estreito e efeitos colaterais graves desencadear estudos de outros complexos de metais de transição potente ^5-8. Entre outros, de titânio (IV) e vanádio (V) os complexos apresentaram resultados promissores de actividade elevada e reduzidatoxicidade ^9-16. Ti (IV) foram os primeiros a entrar em ensaios clínicos após a cisplatina, devido a essas propriedades, no entanto, eles não conseguiram os ensaios devido a dificuldades de formulação e instabilidade hidrolítica. Há, portanto, uma necessidade atual para desenvolver melhores derivados destes complexos metálicos que podem combinar alta atividade anticâncer com resistência à água ^15,17-21.

Um desafio para a preparação de Ti (IV) e V (V) refere-se a complexos de a instabilidade hidrolítica dos reagentes precursores e, portanto, a atmosfera inerte deve ser mantida. A preparação de Ti (IV) e V (V) os compostos é realizado sob N ₂ ou Ar condições em uma caixa de luvas ou usando técnicas de linha Schlenk.

Um método comum para a avaliação da actividade anti-cancro baseia-se em MTT (3 - (4,5-dimetiltiazolil) -2,5-) ensaio. Este ensaio é um ensaio colorimétrico de viabilidade que foi apresentada, em 1983, por Mosmann^22. É extremamente bem estudada e caracterizada, e considera-se altamente eficiente quando se avalia a eficácia de novos compostos citotóxicos devido à sua precisão, rapidez, e sua capacidade de ser aplicada em diversas linhas celulares. Este ensaio de viabilidade é baseado na mudança de cor da molécula MTT quando ele é exposto a células viáveis. A medição da absorbância, a qual é proporcional ao número de células viáveis ​​e, em comparação com controlos não tratados, permite a avaliação da capacidade de inibição do crescimento celular do composto testado.

O teste colorimétrico de MTT é conduzido num formato de placa de 96 poços ^23. As células podem exigir pré-incubação dos poços antes da adição da droga testada. Os tempos de pré-incubação pode variar de 0-24 horas de acordo com as propriedades da linha celular. As células são normalmente expostas ao fármaco durante 24-96 horas, dependendo da actividade do fármaco. Solução de MTT é então adicionado às células tratadas, em que o gritoow MTT é reduzido a formazano púrpura por uma variedade de enzimas mitocondriais e citosólicas que são operacionais em células viáveis ​​(Figura 1) ^24. A molécula de MTT não é reduzido por células mortas e células vermelhas do sangue (células metabolicamente inactivas), as células de baço (células em repouso) e linfócitos estimulados com concanavalina A (células activadas) ^22. Depois de 3-4 horas de incubação com MTT os precipitados formazana. A formação do formazano começa após 0,5 horas de incubação, mas para melhores resultados, é melhor para expor as células à MTT durante pelo menos 3 h ^22. Consequentemente, o meio de cultura é removido e o formazano é dissolvido num solvente orgânico, de preferência isopropanol, ^25, apesar de DMSO também pode ser usado ^26. A eliminação do meio é crucial para a obtenção de resultados precisos desde vermelho de fenol, que é amplamente comum em meio de crescimento, e precipitando proteínas pode interferir com a medição de absorção ^25. Quando a formasolução zan atinge homogénea, a absorvância da solução é medida utilizando um espectrofotómetro leitor de microplacas. A absorvância a 550 nm é directamente proporcional ao número de células na gama de 200-50,000 células por cavidade, e, assim, quantidades muito pequenas de células pode ser detectado ^22. A absorvância indica a quantidade de células viáveis ​​que permaneceram após o tratamento com a droga, e é comparada com a absorvância de células de controle que não foram expostas ao fármaco. Análise dos resultados por software apropriado proporciona a _IC50 (concentração de inibição, 50%) e os seus valores com base em erros estatísticos de várias repetições da medição.

O MTT é amplamente comum em estudos de citotoxicidade para a triagem de novos compostos anti-cancerígenos, devido a sua precisão e simplicidade relativa. No entanto, quando se utiliza o ensaio de MTT, que é dependia da reacção enzimática, deve-se considerar que os vários inibidores de enzimas pode afectar a redução de MTT umd levar a resultados falsos ^27. Além disso, o ensaio de MTT não fornece qualquer informação sobre o mecanismo molecular da actividade citotóxica do fármaco ^2.

Protocolo

1. Preparação do V (V) complexo (Figura 2); ¹⁸ conduta passos 1,1-1,4 em um porta-luvas, se um porta-luvas não está disponível, pule para a alternativa passos 2 (2,1-2,6).
   1. Dissolve-se 0,42 mmol de os ligandos H ₂ L de THF seco e adiciona a uma solução em agitação de quantidades equivalentes de VO (OiPr) ₃ em THF.
   2. Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min e remover os voláteis sob vácuo.
   3. Adicionar hexano frio e removê-lo sob vácuo. Um pó de cor púrpura escura deve ser obtido com um rendimento quantitativo.
   4. Pesar 8 mg do composto obtido em um frasco de Eppendorf. Ir para o passo 3.
2. Prepare o complexo V (V) utilizando uma linha Schlenk.
   1. Dissolve-se 0,42 mmol do ligando com H ₂ L de THF seco, num balão de Schlenk seco com uma tampa de septo, se ligar a uma linha de Schlenk e aplicar ambientes de vácuo / gás inerte _(N2 ou Ar) alternadas, recomenda-se a aplicação de três such rodadas e esperar 2-5 minutos sobre os estágios de vácuo.
   2. Adicionar THF seco através de uma seringa através da tampa de septo.
   3. Adicionar quantidades equivalentes de VO (OiPr) ₃ em uma solução de THF, o qual tinha sido preparado de modo semelhante ligando um balão de Schlenk seco adequado para a linha, a aplicação de um ambiente inerte e adicionando os reagentes através de uma seringa a partir da solução de vanádio ao do o ligando.
   4. Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 15 min e remover os voláteis sob vácuo e, se houver um problema de produtos instáveis, executar tipo Schlenk de destilação dos produtos voláteis sob uma atmosfera inerte; utilizar o fluxo de gás inerte, para fixar o material de vidro necessário que tinha sido pré-seca .
   5. Adicionar hexano frio e removê-lo sob vácuo. Um pó de cor púrpura escura deve ser obtido com um rendimento quantitativo.
   6. Pesar 8 mg do composto obtido em um frasco de Eppendorf.
3. Preparação do Ti (IV) (Figura ^2), sendo que ²⁸ conduta passos 3,1-3,3 em um porta-luvas, se um porta-luvas não está disponível, ajuste as etapas alternativas discutidas para o análogo de vanádio (passo 2) que empregam uma linha Schlenk vez.
   1. Dissolve-se 0,35 mmol do ligando com H ₂ L de THF seco e adiciona a uma solução em agitação de quantidades equivalentes de Ti (O i Pr) ₄ em THF.
   2. Agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Remover os voláteis sob vácuo para se obter um produto amarelo com um rendimento quantitativo.
   3. Pesar 8 mg do composto obtido em Eppendorf frasco.
4. Preparação de células HT-29 placa de 96 poços
   1. Cultura células HT-29 em de 75 cm ² balão com meio RPMI-1640 que contém 1% de penicilina / estreptomicina antibióticos, 1% de L-glutamina, e 10% de soro fetal bovino (FBS), a 37 ° C com 5% de CO ₂ .
   2. Remova o meio quando as células HT-29 a confluência máxima (90-100%, a cada 3-4 dias sem subcultura). Lava-se com 1 mlsolução de tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) e removê-lo.
   3. Adicionar 1 ml de tripsina (0,25%) de solução / EDTA (0,05%) e incubar durante 5 min.
   4. Retire as células HT-29 do frasco e adicionar 10 ml do meio de desativar a atividade de tripsina. Transferir 5 ml da mistura de células para um tubo.
   5. Usar uma pipeta para transferir algumas gotas da mistura de células em câmara de contador. A câmara de contador inclui 5 x 5 quadrados.
   6. Contar as células em 5 quadrados representativos utilizando um microscópio: as quatro quadrados nos cantos e aquele que está no meio.
   7. Calcule a quantidade estimada de células presentes. Soma as células nos 5 quadrados representativos e dividir por 20.
   8. Divida 0,6 pelo resultado do passo 4.7. O número recebido é a quantidade de mistura de células é necessária por placa. Este cálculo refere-se a uma placa que contém 0,6 x 10 ⁶ células (9000 células por poço).
   9. Use pipeta para transferir a quantidade de mistura de células necessária por pfinal (como calculado na secção 4.8) e adicionar 13,2 mL de meio (200 ul por poço × 66 poços).
   10. Adicionar a mistura a placa de 96 poços com uma pipeta de 11 canais (200 ul por poço, 6 linhas, 66 cavidades no total). Um bem de cada linha deve permanecer vazio para o controle em branco.
   11. Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 24 horas para permitir que as células se fixem à placa.
5. A inserção dos compostos
   1. Adicionar 200 mL (ou quantidade diferente de acordo com o intervalo de concentração desejada) de THF seco, a 8 mg de cada composto pesados, como descrito no passo 1.4 (ou 2,6) ou 3,3. Pesar 8 mg do ligando H ₂ L, também.
   2. Diluir cada solução composto ainda pela adição de 60 mL de THF em 9 tubos Eppendorf diferentes.
   3. Com uma pipeta de 60 uL da mistura na secção 5.1 para o primeiro frasco de Eppendorf, e ressuspender a transferência de 60 uL para a próxima frasco, e assim por diante até 10 concentrações diferentes são obtained (incluindo a mistura de pai na seção 5.1).
   4. Dilui-se 20 ul de cada concentração em THF com 180 ul de meio.
   5. Prepara-se uma solução de controlo com apenas THF, 20 mL de THF, com 180 mL de meio em cada medição.
   6. Adicionar 10 ml da solução resultante (incluindo o controlo de THF), a cada poço, que já contém 200 ul da solução de células no meio acima referido para dar as concentrações finais do composto de até 200 mg / L (a gama de concentração pode ser alterado de acordo com a atividade composto).
   7. Pode observar alguma precipitação na maior concentração aplicada, dependendo da solubilidade do composto.
   8. Repetir a cada medição das 3x compostos (3 linhas na placa do mesmo composto); cada linha contém: células tratadas com o composto em 10 concentrações diferentes, uma bem contendo células tratadas apenas com dissolvente para o controlo e um poço sem células para branco controle.
   9. Incubar a placa carregada durante 3 dias a 37 ° C em 5% de _CO2.
6. Medição da citotoxicidade utilizando o teste de MTT
   1. Preparar a solução de MTT através da adição de 1 g de MTT em pó a uma solução de meio RPMI-1640 de 200 ml, sem vermelho de fenol. A solução-mãe pode ser dividido para tubos de 15 mL e armazenado em -20 ° C.
   2. Adicionar 20 ul de solução de MTT a cada poço utilizando uma pipeta de 11 canais (excepto aos poços de controlo em branco, sem as células do passo 4.10), e incuba-se a placa durante 3 horas adicionais.
   3. Remover a solução de meio de cada poço.
   4. Adicionar 200 mL de isopropanol a cada cavidade para dissolver o formazano. Agita-se a placa, durante 0,5 horas até que a homogeneidade é alcançada.
   5. Medir a absorvância a 550 nm para 200 ul da solução acima referida por um espectrofotómetro leitor de microplacas.
   6. Repita cada medida (que inclui 3 repetições, veja o passo 5.8) em 3 dias diferentes.
   7. Calcule tele percentagem de viabilidade celular, deduzindo o valor de absorvência de controlo em branco a partir do valor medido, dividindo o resultado pela absorvância do valor de controlo de solvente THF e multiplicando por 100%.
   8. Calcular os valores de _IC50 utilizando o software GraphPad Prism (ou equivalente).
   9. O IC ₅₀ é reportado a média de todos os valores de IC ₅₀ recolhidos em, pelo menos, três dias diferentes, e o valor de erro é o desvio padrão.

Resultados

Os complexos foram elaboradas com base em procedimentos estabelecidos ^18,28 e sua pureza pode ser avaliada por análise de RMN e elementar.

Os dados recebidos a partir do ensaio de MTT é analisada para avaliar a citotoxicidade do composto ^18,21. Em primeiro lugar, a subtracção do valor de absorvência de controlo em branco a partir de todos os outros valores é realizada. Em segundo lugar, o valor de controlo de solvente THF é definida como 100% de viabilidade, como...

Discussão

O método descrito neste manuscrito combina a síntese química, com ensaio de viabilidade de células biológicas. Tal como acontece com todos os métodos biológicos em matéria de células viáveis, é fundamental para o trabalho em uma capa laminar, e manter condições estéreis, incluindo o uso de solventes orgânicos estéreis. Além disso, a preparação e armazenamento de medicamentos à base de metal hidroliticamente instável deve ser realizado sob condições inertes, para o qual devem ser utilizadas técnic...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Hexane AR	Gadot	830122313	Dried using a solvent drying system
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38
Isopropanol AR	Gadot	830111370
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
MTT	Sigma-Aldrich	M5655-1G
Penicillin/streptomycin antibiotics	Biological Industries	03-031-1B
RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine	Sigma-Aldrich	R8758
RPMI without phenol red	Biological Industries	01-103-1A
Tetrahydrofuran (THF) AR	Gadot	830156391	dried using a solvent drying system
Ti(OiPr)4	Sigma-Aldrich	205273-500ML	moisture sensitive
Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-052-1B
VO(OiPr)3	Sigma-Aldrich	404926-10G	moisture sensitive
Equipment
12-channel pipette 30-300 μl	Thermo Scientific
12-channel pipette 5-50 μl	Finnpipette
75 cm2 flask	NUNC	156472
96-well plate with lid (flat bottom)	NUNC	167008
CO2 Incubator	Binder	APT.line C150
Counter chamber	Marienfeld-Superior	650030
Eppendorf vial	KARTELL
Glove box	M. Braun
Laminar flow hood	ADS LAMINAIRE	OPTIMALE 12
Microplate reader spectrophotometer	Bio-Tek	El-800
Microscope	Nikon	Eclipse TS100
Pipette 20-200 μl	Finnpipette
Pipette 5-50 μl	Finnpipette