JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

Abstract

למרות הזמינות של טיפול וחיסון, שחפת (שחפת) נשאר אחד הזיהומים החיידקיים הקטלניים הנפוצים ביותר בעולם. מאז כמה עשורים, ההתפרצות הפתאומית של זנים עמידים לתרופות מרובות ונרחבות היא איום רציני על השליטה בשחפת. לכן, חיוני לזהות מטרות ומסלולים חדשים קריטיים עבור הסוכן הסיבתי של השחפת, שחפת Mycobacterium (Mtb) ולחפש כימיקלים חדשניים שיכולים להפוך לתרופות שחפת. גישה אחת היא להקים שיטות המתאימות למסכים הגנטיים והכימיים של ספריות בקנה מידה גדול המאפשרות חיפוש מחט בערימת שחת. למטרה זו, פיתחנו בדיקה פנוטיפית המסתמכת על זיהוי של Mtb שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תאים מארחים בעלי תווית פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית. בדיקה זו במבחנה מאפשרת כימות מבוסס תמונה של תהליך הקולוניזציה של Mtb לתוך המארח היה אופטימיזציה עבור פורמט microplate 384-well, אשר מתאים למסכים של siRNA-, תרכובת כימית- או Mtb מוטציה ספריות. התמונות מעובדות לאחר מכן לניתוח רב-פרמטרי, המספק הסקת מסקנות על הפתוגנזה של Mtb בתוך תאים מארחים.

Introduction

בין הפתוגנים זיהומיות המתעוררים המתעוררים מחדש שדווחו בשנים האחרונות, שחפת Mycobacterium (Mtb) מחזיק מקום בולט להיות אחראי על 1.4 מיליון מקרי מוות ו 8.7 מיליון זיהומים חדשים בשנת 2011 (דו"ח שחפת גלובלית 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). למרות הזמינות של טיפולים multidrug, מספר האנשים הנגועים עדיין במגמת עלייה ועמיד multidrug (MDR) כמו גם עמידים לתרופות נרחב (XDR) Mtb מתפשטים במהירות בכל רחבי העולם1. יתר על כן, כאשר לוקחים בחשבון את נוכחותם של אנטיגנים Mtb, ברור כי שליש מהאוכלוסייה העולמית נחשב נגוע סמוי על ידי Mtb. סטטיסטית, במקרה אחד מתוך עשרה, יש אבולוציה לקראת הצורה הפעילה של המחלה עם הסימפטומים הקליניים הבאים2. לכן, אמצעים חדשים להילחם Mtb נדרשים בדחיפות. בהקשר זה, פיתחנו מבחנה פנוטיפית ויזואלית במבחנה המסתמכת על ניטור פלישת Mtb וכפל לתאים מארחים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית אוטומטית3. ההתאמה של הבדיקה בלוחות מיקרוטיטר 384-גם בשילוב עם רכישת תמונה אוטומטית וניתוח, אפשר תוכן גבוה / תפוקה גבוהה הקרנה (HC / HTS) של ספריות בקנה מידה בינוני של תרכובות, siRNAs ומוטנטים חיידקיים. ההקרנה של ספריית RNAi רחבת הגנום בבדיקה פנוטיפית זו אפשרה ובכך לזהות את הגורמים המארחים העיקריים המעורבים בסחר Mtb ושכפול תאיים, אלא גם את ההבהרה של מסלולים מארחים המנוצלים על ידי bacillus פקעת. הסתגלות נוספת של בדיקה פנוטיפית מסוימת זו הייתה לזיהוי גורמים חיידקיים החיוניים להתמדה תוך-פאגוזומלית של Mtb. לדוגמה, מעצר התבגרות phagosome נחשב לאחד המנגנונים העיקריים המאפשרים את הישרדותו ושכפולו של Mtb במקרופג'. ניטור של לוקליזציה תת תאית של מוטציות נוקאאוט Mtb בתאים פלואורסצנטי שכותרתו חומצית מותר לזיהוי של גנים חיידקיים המעורבים בתהליך ההישרדות4. לבסוף, הדמיה בתכולת גבוהה של Mtb מציעה גם שיטה מצוינת לכמת יעילות התרופה לעיכוב תופעות שונות כמו צמיחת חיידקים תאיים3. בסך הכל, סוג זה של תפוקה גבוהה phenotypic assay מאפשר האצת גילוי סמים נגד שחפת ואת הנתונים שנאספו על ידי גישות שונות אלה לתרום להבנה טובה יותר של מניפולציה המארח המופעל על ידי Mtb.

Protocol

1. הקרנת siRNA בגנום בעל תפוקה גבוהה

הקרנה שבוצעה במודל אנושי מסוג II pneumocytes A549 קו התא על זיהום עם Mtb H37Rv המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). הליך זה מתואר באיור 1א.

  1. Resuspend ספריית siRNA מיובש המאוחסן לוחות אמא (96-באר צלחות) עם 1x siRNA חוצץ להגיע לריכוז של 4 מיקרומטר, ולאחר מכן להעביר 10 μl של התערובת לתוך צלחת בת 384-well (צלחת הבת 1).
  2. הוסף 10 μl של חיץ 1x siRNA בצלחת הבת 1 כדי לדלל siRNA על ידי 2-פי 2. לאחר ההשעיה מחדש של siRNA, הצלחות אטומות באטם אלומיניום קלוף וניתן לאחסן אותן ב-20 °C (6 חודשים) לפחות 6 חודשים ועד 2-3 שנים, אך זמן האחסון עשוי להשתנות בהתאם להמלצות היצרן של ספריית siRNA.
  3. לדלל siRNAs בצלחת הבת 1 לתוך צלחת הבת 2 כדי להגיע לריכוז של 500 ננומטר. לאחר ההשעיה מחדש של siRNA, הצלחות אטומות באטם אלומיניום קלוף וניתן לאחסן אותן ב-20 °C (6 חודשים) לפחות 6 חודשים ועד 2-3 שנים, אך זמן האחסון עשוי להשתנות בהתאם להמלצות היצרן של ספריית siRNA.
  4. לפני השימוש, להפשיר את צלחת הבת 2 בטמפרטורת החדר.
  5. קח 2.5 μl של siRNA מצלחת הבת 2 ומניחים לתוך צלחת 384-wellsay.
  6. באותה צלחת 384-wellsay בשלב 1.5, להוסיף 2.5 μl שליטה שלילית וחיובית siRNA לבארות שלהם בהתאמה.
  7. לדלל את reagent transfection ב 1x D-PBS כדי להניב פתרון מספיק כדי לספק 0.1 μl transfection reagent בכל באר מראש את פתרון transfection מדולל בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  8. הוסף 7.5 μl של תערובת פתרון reagent / PBS transfection לכל באר בצלחת ההסתערות והדגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הוסף 40 μl של תאים A549 (1,500 תאים / טוב) מושעה RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS). לשמור על תאים לתקופה של 3 יום דגירה ב 37 °C (69 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2. תאים אלה מתחלקים כל 24 שעות, ולכן כ -12,000 תאים נמצאים בבארות שלושה ימים לאחר ההחלקה.
  10. לשטוף בת שבועיים GFP-ביטוי Mtb H37Rv תרבות החוצה עם D-PBS (חינם מ MgCl2 ו CaCl2) על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות להשליך את הכביסה. חזור על שלב זה 3x. (עבור GFP-Mtb H37Rv תנאי תרבות ראה פרוטוקול 3).
  11. להשעות את גלולת חיידקים ב 10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו decant במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר אגרגטים חיידקיים משקעים.
  12. לאסוף את supernatant חיידקי ולמדוד OD600 (OD600 צריך להיות בין 0.6-0.8) ו GFP-פלואורסצנטיות (ערך RFU) באמצעות קורא microplate כדי לקבוע את ריכוז החיידקים. חשב את titer של המתלה באמצעות קו רגרסיה הפניה המציג ערך RFU = f (ערך CFU) שנוצר לפני הניסוי על תרבות אחרת שהוכנה באותם תנאים. הכן השעיה חיידקית המכילה 2.4 x 106 חיידקים / מ"ל, אשר מתאים ריבוי של זיהום (MOI) של 5.
  13. הסר את המדיום בצלחת 384-wellsay ולהוסיף 25 μl של השעיה חיידקית שהוכנה טרי.
  14. דגירה צלחת 384-wellsay ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות באווירה המכילה 5% CO2.
  15. הסר את המדיום בעדינות לשטוף את התאים עם בינוני RPMI בתוספת 10% FBS 3x.
  16. כדי להרוג את החיידקים החוץ תאיים הנותרים, לטפל בתאים עם 50 μl של מדיום RPMI-FBS טרי המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר של אמיקצין ב 37 °C (70 °F) במשך 1 שעות באטמוספרה המכילה 5% CO2.
  17. הסר את amikacin המכיל בינוני ולהוסיף 50 μl של בינוני RPMI טרי בתוספת 10% FBS. דגירה צלחת 384-wellsay ב 37 °C (60 °F) במשך 5 ימים באווירה המכילה 5% CO2.
  18. לפני רכישת התמונה, להוסיף 10 μl של מוכן טרי 30 מיקרוגרם / מיליליטר של DAPI ב PBS (ריכוז סופי 5 מיקרוגרם / מיליליטר) ואת הדגירה במשך 10 דקות ב 37 °C (70 °F).
  19. טען את הלוח למיקרוסקופ קונפוקל אוטומטי.
    figure-protocol-3467
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  20. הגדר את פרמטרי החשיפה. הקלט פלואורסצנטיות DAPI באמצעות לייזר עירור 405 ננומטר עם מסנן פליטה 450 ננומטר ופלואורסצנטיות GFP באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר עם מסנן פליטה 520 ננומטר.
    figure-protocol-3929
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-4208
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  21. בחר את הבאר ואת השדות בכל באר שיש לרכוש, אשר נקראים לאחר מכן פרמטרי פריסה ושכבת משנה.
    figure-protocol-4583
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-4862
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  22. צור את קובץ הניסוי באמצעות הפרמטרים משלבים 1.20 ו- 1.21 והפעל את הרכישה האוטומטית.
    figure-protocol-5234
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-5513
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  23. העבר תמונות לשרת מרוחק.
    figure-protocol-5826
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  24. הערך תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. זהה גרעיני תאים מערוץ DAPI באמצעות אלגוריתם לזיהוי גרעינים והאזור החיידקי מערוץ GFP באמצעות אלגוריתם מאפייני עוצמת פיקסלים (איור 4A).

הערה: פרוטוקול זה מותאם במיוחד כדי לחקור את ההשפעה של השתקת גנים על צמיחת Mtb תאיים. Mtb הוא חיידק בצמיחה איטית אשר מתחלק כל 20 שעות בתנאים אופטימליים. לאחר 5 ימים לאחר ההדבקה כמות Mtb חוץ תאי עדיין נמוך בהיעדר תמוגה התא ולא השפיע על איכות הניתוח. פרוטוקול זה חייב להיות אופטימיזציה במונחים של אורך הטיפול האנטיביוטי וזמן הדגירה כדי להיות מותאם מסכי siRNA באמצעות חיידקים בצמיחה מהירה כמו Mycobacteria smegmatis ו Escherichia coli כי הם שוחררו בהרחבה יכול להדביק תאים חדשים.

2. הקרנה תרכובת בתפוקה גבוהה

ההקרנה בוצעה על Mtb H37Rv תאים מארחים נגועים. הליך זה מתואר באיור 1B.

  1. להפשיר את צלחות אמא 384-באר המכיל את הספרייה המורכבת solubilized ב DMSO 100%. העבר 0.5 μl של תרכובות צלחות בת 384-well המכיל 10 μl של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS.
  2. לשטוף בת שבועיים GFP-ביטוי Mtb H37Rv תרבות החוצה עם D-PBS (חינם מ MgCl2 ו CaCl2) על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות להשליך את הכביסה. חזור על שלב זה 3x (עבור GFP-Mtb H37Rv תנאי תרבות ראה פרוטוקול 3).
  3. להשעות את גלולת חיידקים ב 10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו decant במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר אגרגטים חיידקיים משקעים.
  4. לאסוף את supernatant חיידקי ולמדוד OD600 (OD600 צריך להיות בין 0.6-0.8) ו GFP-פלואורסצנטיות (ערך RFU) באמצעות קורא microplate. חשב את titer של המתלה באמצעות קו רגרסיה הפניה המציג ערך RFU = f (ערך CFU) שנוצר לפני הניסוי. ריכוז אופייני הוא 1 x 108 חיידקים / מיליליטר.
  5. קציר 6 יום מקרופאגים אנושיים ראשוניים ישנים ב 4 x10 5 תאים / מיליליטר ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 50 ng /ml רקומביננטי אנושי M-CSF (עבור תאי מונוציט דם היקפיים אנושיים טיהור ובידול מקרופאגים ראה פרוטוקול 4).
  6. דגירה את התאים הראשיים מדולל עם bacilli ב MOI שונים, החל 1-5, בהשעיה עם רעידות קלות ב 90 סל"ד במשך 2 שעות ב 37 °C (69 °F).
  7. לשטוף את התאים הנגועים על ידי צנטריפוגה ב 350 x g כדי להסיר את החיידקים חוץ תאיים. לאחר כל שלב צנטריפוגה, resuspend גלולה ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS. חזור על שלב זה 2x.
  8. להשעות את התאים הנגועים ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו amikacin ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר ולהדגיר את ההשעיה עם טלטול קל במשך 1 שעה ב 37 °C (67 °F).
  9. הסר את מדיום תרבית התא המכיל amikacin על ידי צנטריפוגה ב 350 x g ולשטוף את התאים הנגועים עם מלא RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו 50 ננוגרם / מיליליטר M-CSF אנושי רקומביננטי. חזור פעם אחת.
  10. הוסף 40 μl של השעיית מקרופאגים נגועים באותה צלחת מבחנים בשלב 2.1, אשר כבר מכיל 10 μl של דילולים מורכבים. הריכוז הסופי של DMSO בכל באר הגיע כעת 1%.
  11. דגירה צלחות assay במשך 5 ימים ב 37 °C (60 °F) באווירה המכילה 5% CO2.
  12. הכתים את התאים החיים בצבע פלואורסצנטי אדום-רחוק חדיר לתאים.
  13. טען את הלוח למיקרוסקופ קונפוקל אוטומטי.
    figure-protocol-9216
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  14. הגדר את פרמטרי החשיפה. רשום פלואורסצנטיות אדומה רחוקה באמצעות לייזר עירור 640 ננומטר עם מסנן פליטה 690 ננומטר ופלואורסצנטיות GFP באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר עם מסנן פליטה 520 ננומטר.
    figure-protocol-9685
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-9964
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  15. בחר את הבאר ואת השדות בכל באר שיש לרכוש, אשר נקראים לאחר מכן פרמטרי פריסה ושכבת משנה.
    figure-protocol-10339
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-10618
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  16. צור את קובץ הניסוי באמצעות הפרמטרים משלבים 2.14 ו- 2.15 והפעל את הרכישה האוטומטית.
    figure-protocol-10990
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-11269
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  17. העבר תמונות לשרת מרוחק.
    figure-protocol-11582
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  18. הערך תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. זהה אזור תאים מערוץ אדום רחוק באמצעות אלגוריתם מאפייני עוצמת פיקסל ואזור חיידקי מערוץ GFP באמצעות אלגוריתם מאפייני עוצמת פיקסלים (איור 4B).

הערה: פרוטוקול זה יכול להיות מותאם להקרנת ספריית מוטנטים Mtb על ידי החלפת תרכובות על ידי מוטנטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי (מוטציה אחת טובה / אחת) (איור 1C, ראה גם ברודין ואח '. 4). מוטציות פלואורסצנטיות הן הזרע הראשון בארות (20 μl של השעיה חיידקית לכל באר). חיידקים הם התאוששו לאחר מכן על ידי 30 μl של השעיית תאים. לאחר צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 1 דקות, הצלחת היא דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO2. זמן הדגירה ו- MOI תלויים במהלך ההסמכה. לדוגמה, עבור הדמיה של אירועים תאיים מוקדמים כגון חומציות phagosome, התאים יכולים להיות נגועים במשך 2 שעות עם MOI החל 1-20. Lysosomes מוכתמים באמצעות צבע Lysotracker ב 2 μM עבור 1.5 שעות ב 37 °C (69 °F) באווירה המכילה 5% CO2 ולאחר מכן קבוע עם 10% פורמלין או 4% paraformaldehyde (PFA). תמונות קונפוקל נרכשות ולבסוף מנותחות באמצעות סקריפטים לניתוח תמונה הכוללים אלגוריתמים מתאימים לזיהוי ליזוזומים ולוקליזציה תת-תאית4.

3. חלבון פלואורסצנטי ירוק המבטא שחפת מיקובקטריום H37Rv (GFP-H37Rv) תנאי תרבות

עבור אחסון לטווח ארוך, GFP-H37Rv הוקפאו D-PBS (סביב 1 x 108 mycobacteria לכל בקבוקון).

  1. Resuspend בקבוקון אחד קפוא של GFP-H37Rv בבקבוקון ארלנמייר המכיל 50 מ"ל של 7H9 מרק בינוני בתוספת העשרה OADC מידלברוק 10%, גליצרול 0.5%, Tween-80 0.05%, והיגרומיצין B (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
  2. דגירה 8 ימים ב 37 °C (69 °F).
  3. מדוד OD600 של תרבות GFP-H37Rv.
  4. לדלל את התרבות GFP-H37Rv כדי להשיג OD600 = 0.1 טרי 7H9 מרק בינוני בתוספת מידלברוק OADC העשרה 10%, גליצרול 0.5%, Tween-80 0.05% ו Hygromycin B (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
  5. דגירה GFP-H37Rv ב 37 °C (77 °F) במשך 8 ימים נוספים לפני השימוש עבור ההסתעפות.

4. טיהור תאי מונוציט בדם היקפי אנושי מדם שלם או הכנת מעיל באפי

  1. לדלל את כיס הדם 2x ב 1x D-PBS (ללא MgCl2 ו CaCl2) המכיל 1% FBS.
  2. בודדו את המונוציטים לפי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות Ficoll ב- 400 x g למשך 20 דקות.
  3. אסוף את המונוציטים המבודדים.
  4. לשטוף את המונוציטים 3x עם 1x D-PBS (ללא MgCl2 ו CaCl2) המכיל 1% FBS על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לרכז את התאים עד 1 x 107 תאים / מיליליטר.
  6. לטהר מונוציטים באמצעות חרוזי CD14 מגנטיים על פי פרוטוקול היצרן (ראה חומרים).
  7. לאחר טיהור CD14-monocytes, זרע את התאים ב 1.5 x 106 תאים / מיליליטר ב RPMI 1640 משלים עם 10% FBS ו 40 ng/ml של האדם מקרופאגים מושבה מגרה פקטור (hM-CSF) ודגר במשך 4 ימים ב 37 °C (60 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2.
  8. לאחר 4 ימים להחליף את המדיום עם טרי RPMI 1640 השלים עם 10% FBS ו 40 ng/ml של hM-CSF ו דגירה במשך 2 ימים ב 37 °C (67 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2.
  9. לאחר 6 ימים, התאים יכולים לשמש לבדיקה.

תוצאות

הקרנת siRNA בגנום בעל תפוקה גבוהה

Mtb הוא מסוגל ליישב תאים חיסוניים במבחנה, כמו גם כמה תאים אפיתל ריאות אחרים. לדוגמה, Mtbהוא מסוגל להדביק ולפגוע בתאי אפיתל A549 המשמשים בדרך כלל כמודל עבור pneumocytes סוג אנושיII 5-7. Dectin-1 דווח כקולטן תא מארח מעורב ספיגת Mtb, תגובת proin...

Discussion

אנו מתארים כאן את השיטות הנדרשות לבדיקה פנוטיפית באמצעות זן Mtb H37Rv מבטא GFP כדי להדביק תאים מארחים בעלי תווית פלואורסצנטית, מה שהופך אותו מתאים למסכי תוכן גבוה / תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של תרכובות, בדיקות פלואורסצנטיות ומוטנטים Mtb. עבור כל פרוטוקול שתו?...

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

תמיכה כספית לעבודה זו סופקה על ידי הקהילה האירופית (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, מענק MM4TB n° 260872), סוכנות לאומית דה Recherche, פדר (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), ואת האזור נורד פאס דה קאלה. אנו מודים בהכרת תודה על הסיוע הטכני של גספר דלויסון, אליזבת ורקמייסטר, אנטונינו בונג'ובאני ופרנק לאפונט מפלטפורמת BICeL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
µclear-plate black, 384-wellGreiner Bio-One781091127.8/86/15 MM with Lid, TC treated
CellCarrier 384-well platePerkinElmer6007550Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated
V-bottom white, 384-well plateGreiner Bio-One781280 
sealing tape, breathable, sterileCorning3345 
Lipofectamine RNAiMaxLife Technologies13778150Transfection reagent
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich34943 
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010Cell culture medium
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2Life Technologies14190-091Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
Fetal bovine serumLife Technologies2610040-79 
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification
CD14 MicroBeads, humanMiltenyi130-050-201Purification of CD14+ Monocytes
Human M-CSF, premium gr. (1000 μg)Miltenyi130-096-493Macrophage Colony Stimulating Factor
LS ColumnsMiltenyi130-042-401Columns for CD14+ Monocytes isolation
Tween 80Euromedex2002-AMycobacteria culture
Glycerol high purity Euromedex50405-EXMycobacteria culture
 Middlebrook OADC enrichmentBecton-Dickinson211886Mycobacteria culture
7H9Becton-DickinsonW1701PMycobacteria culture
Versene 1xLife Technologies15040033Nonenzymatic cell dissociation solution
DAPILife TechnologiesD1306Nuclei dye
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570Nuclei dye
Syto60Life TechnologiesS11342Nuclei/cytoplasm dye
FormalinSigma-AldrichHT5014Cell fixation solution
siRNA targeting Dectin-1Santa-Cruzsc-63276 
*siGenome* Nontargeted siRNA pool DharmaconD-001206-14 
RifampicinSigma-AldrichR3501antibiotic
Isoniazid (INH)Sigma-AldrichI3377-50Gantibiotic
Hygromycin BLife Technologies10687-010antibiotic
AmikacinSigma-AldrichA1774antibiotic
Automated Confocal Microscope OPERAPerkinElmerImage acquisition
Columbus 2.3.1 Server DatabasePerkinElmerData transfer, storage, and analysis
Acapella 2.6 softwarePerkinElmerImage-based analysis
GraphPad Prism5 softwareGraphPadStatistical analysis
Excel 2010MicrosoftStatistical analysis

References

  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
  2. Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  3. Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
  4. Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
  5. Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
  6. Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
  7. McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
  8. Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  10. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
  12. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
  13. Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

83siRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved