סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Summary

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Abstract

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Introduction

תאי הכבד סינוסי האנדותל (LSECs) הם מאוד תאי האנדותל מובחנים המרפדים את הקיר של סינוסואידה הכבד. LSECs הם מחוררים עם fenestrations ש- diaphragmed עישון, transcellular נקבוביות 50-250 ננומטר בקוטר. עד 20% מהשטח של LSECs מכוסה על ידי fenestrations, שהם בדרך כלל בקבוצות של עשרות עד מאות נקראים צלחות מסננת ^1-3 (איור 1). Fenestrations לאפשר העברה של פלזמה וnanosubstrates בין הדם וhepatocytes, יצירת מערכת אולטרה סינון יעילה ביותר. Fenestrations הם מבנים דינמיים - שניהם בגודל ו / או מספר ניתן לשנות בתגובה למצבים שונים פיסיולוגיים, תרופות, ומחלות. לדוגמא, fenestrations גדול יותר בצם מאשר במדינה נמאס ^4; 2-די-iodoamphetamine מגדיל מספר אשנוב; ^5,6 וירידה בגודל ובמספר fenestrations לכל תא מתרחש במדינות הזדקנות ומחלות רבות ^7-13 . מדידה מדויקת של הגודל ומספר fenestrations חשובה להבנה כיצד מורפולוגיה LSEC מושפעת מחלה שונות, רעילה, ומדינות פיסיולוגיות; ההשפעה שלהם על תפקוד כבד; ולפיתוח אשנוב-ויסות התערבויות טיפוליות ^1.

המחקר של fenestrations קשה. הקוטר של fenestrations נמצא מתחת לרזולוציה של מיקרוסקופ אור הרגילה, כך במיקרוסקופ אלקטרונים רק בעבר תצפית באמצעות שני בLSECs רקמת כבד או מתורבתת שלם היה אפשרי. מיקרוסקופ האלקטרונים הסורקים (SEM) יש בתדירות הגבוהה ביותר נעשה שימוש כדי ללמוד גודל אשנוב, תדירות ונקבובית (אחוז קרום LSEC שהוא מחורר ידי fenestrations) כי SEM מאפשר התצפית של שטחים גדולים של פני השטח האנדותל והמדידה של אלפים, אם לא עשרות אלפים fenestrations. למרות השירות שלה, את התוצאות המדווחים מSEM מבוססות מחקרים לפרמטרים LSEC כגון גודל אשנוב, מספר, תדירות ונקבובית להשתנות במידה רבה בספרות (טבלת 1).

Fenestrations וצלחות מסננת הן מבנים שבריריים שחוזה, לשבור, להתרחב או להתגבש במהלך הכנת דגימה, יש צורך בעיבוד ובכך הקפיד לשמור על שלמותם. לחץ זלוף גבוה ^14; osmolarity שגויה של מקבע ומאגרים ^15; קיבעון לקוי או קיבעון זמן; ומהירות של התייבשות לאחר קיבוע-וייבושם בכל תחומי העיבוד לSEM שעשוי לייצר חפצים המפריעים לשימור ultrastructure (איור 2). אובדן fenestrations ('defenestration') והצטמקות אשנוב יכול להתרחש כתוצאה מקיבעון עני, וכתוצאה מכך קוטר אשנוב מופחת ונקבובי תא. שיטות כדי לשפר את השימור של דגימות לניתוח SEM תוארו בעבר ^15-17 ותידוננהכאן עם טיפים נוספים על איך לשפר את שימור דגימה. המטרות העיקריות של שימור הדגימה הן להסיר דם מsinusoids כך את פני השטח של LSEC ניתן דמיינו וכדי למנוע נזק LSEC משני בלחץ גבוה או קיבעון מתעכב. זלוף הכבד השלם של מקבע דרך וריד הפורטל הוא השיטה המועדפת לקיבוע כבד. כפי שתואר בפירוט במקום אחר ^16,18 זלוף חייבת להתבצע בלחץ נמוך (למשל 10 סנטימטר של H ₂ 0), כדי למנוע חפצי זלוף הקשורים ללחץ ונזק לLSEC, בא לידי ביטוי בדרך כלל פערים גדולים כמו בקרום התא. עם זאת, לעתים קרובות ניתן להשיג קיבעון סביר באמצעות זלוף מחט של ביופסית כבד מבני האדם ובעלי חיים, כפי שתואר בפירוט במקום אחר ^19. טכניקה זו כרוכה בהזרקה ישירות מקבעת לתוך הרקמה עד דם סמוק מתוך המדגם והרקמות היא מוצקות וקבוע. קיבוע של דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים צריך להיות Performed מהר ככל האפשר הבא הפסקת זרימת דם למניעת שינויי ultrastructural מתרחשים כתוצאה מתהליכי הכבדים autolytic מאוד מהירים.

כמו כן, אנו מציגים שיטה של ​​ניתוח תמונה שממזער את ההכללה של חפצים, וסטנדרטיזציה מדידת fenestrations. וריאציה בבחירת sinusoids לmicrographs, ניתוח תמונה של חפצים, ומדידה של שטח תא לתדר נקבוביות ואשנוב הובילו לפערים גדולים בתוצאות שפורסמו. גישה סטנדרטית להערכה ומדידה של fenestrations ודרישות מינימום להצגת נתונים שלא טופלה באופן ברור בספרות בעבר ^4,10,20-31.

Protocol

הערה: כל הנהלים הקשורים לשימוש בבעלי החיים מתבצעות בהתאם לחקיקה המקומית. העבודה שלנו היא אושרה על ידי ועדת בעלי החיים בריאות המחוזית סידני המקומי הרווחה. הנהלים אפשרו מתוארים בתיעוד רישיון פרויקט ולעקוב אחר הנחיות שתבטחנה את שלומם של בעלי החיים בכל העת. להבטיח עמידה בחקיקה על ניסויים בבעלי חיים במדינה שבן העבודה נעשית.

1. פרוטוקול להכנת EM מקבע

1. לשל מקבע 100 מיליליטר, להכין paraformaldehyde על ידי הוספת 2 גרם של אבקת paraformaldehyde 25 מיליליטר מים מזוקקים בבקבוק חרוטי, חום עד 65 מעלות צלזיוס, תוך ערבוב עם בוחש מגנטי כל הזמן.
   הערה: Glutaraldehyde, paraformaldehyde וחיץ cacodylate נתרן כל חומרים מסוכנים וחייב תמיד להיות מטופלים בfumehood.
2. חום על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לאחר מכן להתקרר. במידת הצורך, להוסיף dropw פתרון נתרן הידרוקסידיISE תוך ערבוב כדי לנקות פתרון לחלוטין.
   הערה: נתרן הידרוקסידי הוא מסוכן, לטפל בזהירות.
3. להוסיף 10 מיליליטר של glutaraldehyde מניית הכיתה EM, 50 מיליליטר של חיץ cacodylate 0.2 M נתרן ו -2 גרם של סוכרוז ומערבבים עם בוחש מגנטי. הוסף 2 מיליליטר של 1.0 M CaCl _2.
4. התאם לpH 7.4 לפני קבלת פתרון עד במים מזוקקים 100 מיליליטר. מקבע הסופי מכיל glutaraldehyde 2.5%, Paraformaldehyde 2%, 2 mmol CaCl _2, 2% סוכרוז במאגר M 0.1 cacodylate. ודא שosmolality הכולל הוא 440 mOsmol / L. השתמש בתוך 24 שעות של הכנה.

2. זלוף קיבוע של כבד

1. מאגר חם זלוף ומקבע ל35-37 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה הנכונה של חיץ exsanguination ומקבע עוזרת להבטיח את שלמות רקמה.
2. לטשטש את החיה עם זריקת intraperitoneal אחת של 50 מ"ג / קילוגרם קטמין ו5 מ"ג / קילוגרם Xylazine.
3. ברגע שבעלי החיים נמצאים תחתהרדמה עמוקה, שהוערכה על ידי נסיגת גפיים אחוריות וקמצוץ זנב, חתך Y הוא עשה עם מספריים קהים הסתיים בבטנו של בעל החיים כדי לחשוף את הווריד הכבד ופורטל.
   הערה: ודא שהציוד הוא נקי, כדי למנוע זיהום של דגימות עם מיקרואורגניזמים וכללי פסולת שניתן לראות בקלות על SEM.
4. לקשור שני תפרים רופפים מאוד מסביב לוריד הפורטל הפרוקסימלי אחד בכבד, יותר האחרים distally אל הכבד.
5. Cannulate וריד השער עם צינורית בגודל המתאימה IV (18 G לחולדות, 22 G לעכברים) תפרי .Tighten לאבטח צינורית.
6. להתחיל זלוף עם נאגר מלוח פוספט חימם עד 37 מעלות צלזיוס, ובלחץ של 10 סנטימטרים של H ₂ 0. בין 5 ל 20 מיליליטר של PBS נדרש בדרך כלל ללגרום לדימום מחודש הכבד.
   הערה: אל תאפשר לבועות אוויר להיכנס הכבד דרך הצינורות מחוברים לצינורית כפי שהם לגרום לחפצים משניים לאמבוליזציה ולחץ; נזק לhepatocytes, סיnusoids וfenestrations LSEC מתרחש אם לחץ זלוף הוא גבוה מדי.
7. לנתק את הווריד נבוב בטן ובית חזה על מנת לאפשר לחיץ כדי לצאת באופן חופשי מהכבד. זה מונע נזק בחזרה בלחץ גבוה לLSECs.
8. ברגע שהכבד הוא ללא דם, להחליף PBS עם מקבע EM וינקב עבור כ 5 דקות, עד שהכבד קשוח ומאוד חיוור.
9. להפסיק זלוף ולחתוך את הכבד הקבוע ל1-2 מ"מ ³ בלוקים באמצעות אזמל חד.
10. רקמה שלאחר תיקון במקבע EM ל24-72 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: באופן כללי, underfixation גורמת יותר מאשר חפצי overfixation.
11. לשנות מקבע הבאים תקופה שלאחר תיקון לחיץ 0.1 cacodylate M נתרן לאחסון ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: דוגמאות מאוחסנות בדרך זו תישמר לתקופה משמעותית של זמן (עד 12 חודשים), קיבעון המשני בזמן זאת ובדיקה מומלצת לתוצאות הטובות ביותר.

3. המחט Perfusion

הערה: קיבוע מחט הנו נגזר של קיבעון זלוף שכרוך בהזרקה של מקבע ישירות לתוך רקמת כבד ביופסיה. המטרה היא למקבע להיות סמוקה דרך כלי הדם כדי לגרום לדימום המחודש ולחשוף את כל גוש הרקמה למקבע. יש להקפיד לשמור על לחץ הזרקה נמוך, כדי למנוע פגיעה בלחץ ^18,19.

1. הסר חתיכה קטנה של כבד מבעלי החיים או הנושא ולשטוף בתמיסת מלח כדי להסיר דם ופסולת.
2. לצייר מלח הרגיל למצויד במחט עדינה מד (בדרך כלל מזרק אינסולין) מזרק.
3. להזריק המלוח מאוד לאט לתוך הכבד עד דם סמוק מהרקמה. זריקות מרובות ייתכן שתידרש.
4. צייר את מקבע EM למצויד במחט עדינה מד (בדרך כלל מזרק אינסולין) מזרק אחר.
5. הזרק מקבע מאוד לאט לתוך הכבד עד שהוא הופך קשה ושיזוף בצבע. הזרקה מרובהים עשוי להידרש.
6. חותך את הכבד הקבוע ל1-2 מ"מ ³ בלוקים באמצעות אזמל חד. דגירה במקבעת EM ל24-72 שעות 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים ב 0.1 חיץ cacodylate M נתרן לפני תחילת קיבעון המשני.

4. הכנה לסריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

1. מדגם לשטוף 3 פעמים במאגר cacodylate 0.1 M נתרן. כדי לתקן שומנים, לאחר לתקן את המדגם ב 2% tetroxide אוסמיום במאגר cacodylate 0.1 M נתרן לשעה 2.
   הערה: שטיפה מלאה היא מאוד חשובה כמו צלב tetroxide glutaraldehyde ואוסמיום להגיב וליצור חפצים על SEM.
2. יש לשטוף את הדגימות בהגדלת ריכוזים של אתנול להתחיל התייבשות. שטיפה ראשונה באתנול 50% במשך 5 דקות; 3 פעמים ולאחר מכן ל5 דקות עם 70% אתנול; לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות עם 90% אתנול; לשטוף 2 פעמים במשך 5 דקות ב 100% אתנול; ולבסוף לשטוף 2 פעמים במשך 10 דקות ב 100% אתנול (מסננת מולקולרית).
3. הסר את כל אתנול מהדגימות ולהחליף עם hexamethyldisilazane (HMDS) בfumehood ולהשאיר למשך 10 דקות. הסר HMDS מדגימות הרקמה ולאפשר להתאדות.
   הערה: HMDS הוא hygroscopic מאוד כאשר קר ולכן מאפשרים להגיע RT לפני השימוש לצעד התייבשות סופי.
4. לחלופין, הר הדגימות באופן מיידי או להכניס אותם לתוך תא ייבוש עד מוכן לעלות לSEM.

5. הרכבה

הערה: הרכבת דגימה נכונה תהיה למקסם את מספר sinusoids מסומן בצורה ברורה לניתוח תחת SEM.

1. תווית הבסיס של ספחי SEM מתכת ולהחיל קלטת פחמן מוליך דו-צדדית לחלק העליון של הספחים.
2. דמיינו דגימות באמצעות מיקרוסקופ לנתח לזהות את פני השטח עם sinusoids הטוב ביותר עבור SEM שלאחר מכן. מניחים משטח שכלפי מעלה על פני השטח קלטת פחמן של הבדל.
3. דגימות מקל היטב לבדל, דגימות מוכנות לציפוי גמגום עכשיו.

> 6. ציפוי ove_title "

הערה: ציפוי הדגימה עם סרט משובח של מוליך מתכת (זהב או פלטינה) בטענת coater גמגום הדגימה ומגנה עליו מפני נזקי קרן האלקטרונים. אם הציפוי הוא מבנים עבים מדי של ריבית עשויים להיות מוסתרים.

1. ספחי מקום לתא הוואקום של coater גמגום קנס האוטומטי, להגדיר את המצב לסיבוב וציפוי גמגום אוטומטי במשך 45 שניות. השתמש ציפוי פלטינה לעדין המפרט, אבל הזהב מתאים גם.
2. למרוח שכבה דקה של צבע פחמן למשטחים החיצוניים של הדגימות כבד רכובים, נזהר שלא מעיל משטחי סינוסי.
3. ברגע שהדגימות מצופות בפלטינה וצבע פחמן התייבש הם מוכנים לתצפית על SEM. דוגמאות ניתן לאחסן בתא ייבוש.

7. שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני הסורק

1. מקום דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים סורק ולחזור מיקרוסקופ כדי ואקום.
2. באמצעות נהלי הפעלה מיקרוסקופ רגילים להדמיה של דגימות על ידי החל בהגדלה נמוכה, להגדיל בהדרגה הגדלה.
3. ודא מיקרוסקופ מותאם כראוי לעבודת מרחק, גודל נקודה ואסטיגמציה.
4. בדקו את שלמות קיבעון. אם LSEC הוא לרוב ללא תשלום מפערים ומכיל fenestrations מדידת 30-250 קוטר ננומטר זה בדרך כלל מצביע על כך שהכנת הדגימה הייתה מוצלחת.
5. אם sinusoids מלא של פערים או נטול fenestrations הכנת הדגימה לא הייתה מוצלחת או שיש פתולוגיה המשמעותית. במקרה זה, פורס את המדגם בסכין גילוח עדין מאוד, ומשטחי חיתוך שכבה על גבי שכבה ונותחו לsinusoids הקבוע בהצלחה.
6. בכ 15,000-20,000 × הגדלה לבחור משטחי LSEC שטוחים שהם ללא פסולת עם קיבעון טוב ובי fenestrations גלוי לעין (בדרך כלל מכיל לפחות 10 fenestrations).
7. לשמור תמונות של לפחות 10 sinusoids לכבד, מאזורים השונים של בלוקים, באמצעות לפחות שני רחובות לכבד. דגימת 10 micrographs ב15,000 - 20,000 × הגדלה לכל בעלי חיים היא בדרך כלל מספיק לכימות של fenestrations להיות נציג של כל הכבד.

8. ניתוח

הערה: תוכנת ImageJ אשר ניתן להוריד בחינם מNIH מנוצלת לכמת קוטר אשנוב ותדר (www.imagej.nih.gov/ij).

1. תמונה הפתוחה J ולהגדיר את היקף שימוש בסרגל קנה המידה המוטבע בתמונה (צילום המסך 1).
2. שימוש בכלי המצולע בImageJ, עקבות באזור השטוח של כל LSEC כוללים אזורי fenestrated וחלונות. פשוט לא זכר את צלחות המסננת כמו זה בטעות יהיה לנפח נקבוביות. תכלול כל חתיכות גדולות של פסולת שנמצאות על פני התא שעשויה להיות obscurifenestrations ng.
3. כדי למדוד קוטר אשנוב, לעקוב אחר קו בקוטר הארוך ביותר של כל אשנוב על ידי בחירה בכלי השורה, ולחץ על "M" כדי למדוד את הקו, ו" ד "(לצייר) למתוח את הקו בתמונה באופן קבוע. קו זה מוגדר כקוטר אשנוב. אורך הקו יהיה זמין כעת בתיבת תוצאות ImageJ (צילום מסך 2).
4. למדוד את כל הפערים שהם חורים גדולים יותר בציטופלסמה LSEC מעל 250 ננומטר, כמו גם fenestrations. פערים הם לעתים קרובות חפצים המשקפים זלוף העני או קיבעון, אולם פערים יכולים להתרחש גם כתוצאה ממחלה והרעילות. נתונים לפערים יהיו פטור מחישוב הפרמטרים אשנוב מאוחר יותר בניתוח.
5. האזור של פערים שאינם מעגליים צריך להיות מחושב על ידי התחקות סביב הפערים וחישוב השטח שלהם על ImageJ.
6. הדבק את הנתונים מתיבת התוצאות בImageJ לתוך גיליון אלקטרוני Excel למעיל-הפרווהניתוח r.

9. חישובים

1. קוטר ממוצע = אשנוב הממוצע של כל קטרי אשנוב (לא כוללים פערים, שבו פערים ≥ 250 ננומטר).
2. אשנוב אזור = πr ^2, שבו r, הרדיוס, מחושב מקוטר fenestrations הבודד (r = ד / 2) הפערים, לא כולל.
3. נקבוביות (%) = (Σ (πr ²⁾ / שטח כולל ניתח - אזור Σ (פערים =)) (מיקרומטר ²⁾⁾ × 100.
4. תדירות אשנוב = מספר כולל של fenestrations / (שטח כולל ניתח-Σ (שטח של פערים) (מיקרומטר ^2).

10. הצגת אשנוב נתונים

הערה: במידת האפשר, פרסומים כוללים כימות של נתונים אשנוב צריכים לכלול את הפרטים הבאים

1. קוטר אשנוב, עם הצהרה המאשר את מה שקטרי גבול שבו משמשים להגדרת fenestrations (בדרך כללבין 50-250 ננומטר), תדירות אשנוב (מספר / מיקרומטר ²⁾ ונקבובי (%).
2. הצהרה המאשרת אם פערים נכללו בניתוח, גרף התפלגות תדירות קוטר אשנוב והמספר של כבדים, בלוקים, תמונות וfenestrations צריך להיכלל בניתוח.

תוצאות

הדמיה ראשונית בהגדלה נמוכה על ידי סריקה מיקרוסקופי אלקטרונים מגלה משטח שטוח של דגימת הכבד בשטח חשוף גדול מספיק כדי להתבונן רבים כלי כבד גדולים וsinusoids (איור 1 א). הבטחת מיקום בלוק כבד נכון על בדל ההרכבה היא חיונית לקבלת תמונות ברורות של sinusoids והכמוסה של Glisson של ?...

Discussion

היכולת מדויקת וreproducibly למדוד את מעמדו של האנדותל סינוסי הכבד היא צעד חשוב בהבנת הביולוגיה של תאים מאוד מיוחדים אלה. טכניקות חדשות כגון מיקרוסקופיה המובנה התאורה ^32, מיקרוסקופיה כוח אטומית ³³ וד-STORM (ישיר סטוכסטיים אופטי Reconstrucion מיקרוסקופית) ³⁴ תהיה להקנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of material	Company	Catalogue Number	Comments
EM grade Glutaraldehyde	ProSciTech	C001	Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder	Sigma Aldrich	158127	Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder	Sigma Aldrich	C0250	Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016	Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide	ProSciTech	C011	Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute	Sigma Aldrich	459836	100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol	Labtech	EL5	Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	52619	Allow to reach room temperature before use
Cannulas	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape	ProSciTech	IA0201
Carbon Paint	ProSciTech	I003
Ketamine			Must be optained under licence
Xylazine			Must be obtained under licence
Molecular Sieve	Sigma Aldrich	208647	Removes water from the 100 % Ethanol