Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Zusammenfassung

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Einleitung

Die Lebersinus Endothelzellen (LSECs) sind sehr differenzierte Endothelzellen, die die Wand des hepatischen Sinusoid auszukleiden. LSECs mit Fensteranordnungen, die nicht-blendete perforiert Poren trans 50-250 nm Durchmesser. Bis zu 20% der Oberfläche des LSECs durch Fensterungen, die üblicherweise hunderte genannten Siebböden ^1-3 (Figur 1) werden in Gruppen von zehn bedeckt. Fensteranordnungen ermöglichen die Übertragung von Plasma und nanosubstrates zwischen Blut und Hepatozyten, die Schaffung eines hocheffiziente Ultrafiltrationssystem. Fensteranordnungen sind dynamische Strukturen - sowohl ihrer Größe und / oder Anzahl kann als Reaktion auf verschiedene physiologische Zustände, Drogen und Krankheit verändert werden. Zum Beispiel sind Fensterungen im nüchternen größer als im gesättigten Zustand ^4; 2-Di-iodoamphetamine erhöht Fensternummer; ^5,6 und eine Reduktion der Größe und Anzahl von Fensteranordnungen pro Zelle in Alterung und viele Krankheitszustände ^7-13 auftritt . Genaue Messung der Größe und Anzahl von Fensteranordnungen ist wichtig für das Verständnis, wie LSEC Morphologie wird durch verschiedene Krankheiten, toxische und physiologischen Zuständen beeinflusst; ihre Auswirkungen auf die Leberfunktion; und für die Entwicklung von Fenster modulierenden therapeutischen Interventionen ^1.

Das Studium der fenestrations ist schwierig. Der Durchmesser der Fensteranordnungen unterhalb der Auflösung der herkömmlichen Lichtmikroskopie, so bisher nur Beobachtung mittels Elektronenmikroskopie sowohl in intakten Lebergewebe oder Zucht LSECs möglich war. Das Rasterelektronenmikroskop (SEM) wurde am häufigsten verwendet, um Fenstergröße, die Frequenz und die Porosität (der Prozentsatz der LSEC Membran, die durch Fensterung perforiert ist) zu studieren, weil SEM ermöglicht die Beobachtung von großen Flächen der endothelialen Oberfläche und Messung von Tausenden wenn nicht Zehntausende von Fensteranordnungen. Trotz seiner Nützlichkeit, die Ergebnisse, die sich aus gemeldet werden SEM-basierte Studien fürLSEC Parameter wie Fenstergröße, die Anzahl, die Häufigkeit und die Porosität variieren weithin in der Literatur beschrieben (Tabelle 1).

Fensteranordnungen und Siebplatten sind fragile Strukturen Vertrag zu brechen, erweitern oder zusammenwachsen während der Probenvorbereitung ist somit schonende Verarbeitung benötigt, um ihre Integrität zu bewahren. Erhöhte Perfusionsdruck ^14; falsche Osmolarität der Fixiermittel und Puffer ^15; unzureichende Fixierung oder Fixierungszeit; und die Geschwindigkeit der Postfixierung Entwässerung und Trocknung sind alle Bereiche der Verarbeitung für SEM, die Artefakte, die mit der Erhaltung der Ultrastruktur eingreifen (Figur 2) erzeugen kann. Verlust Fensterungen ("Fenstersturz) und Fensterung Schrumpfung als Folge der schlechten Fixierung auftreten, was zu einer verringerten Durchmesser und Fensterung Zellporosität. Methoden, um den Erhalt von Proben für die REM-Analyse zu verbessern zuvor ^15-17 beschrieben und diskutiert werdenhier mit zusätzlichen Tipps, wie Sie Probekonservierung zu verbessern. Die Hauptziele der Probenkonservierung sind, um Blut von der Sinusoide entfernen, so dass die Oberfläche der LSEC visualisiert und LSEC Schäden die durch Hochdruck oder verzögerte Fixierung zu vermeiden. Ganze Leberperfusion Fixiermittel über die Pfortader ist die bevorzugte Methode für Leberfixierung. Wie im Detail beschrieben, an anderer Stelle muß ^16,18 Perfusion bei niedrigem Druck durchgeführt werden (beispielsweise 10 cm H ₂ 0) in den druckbedingten Artefakte Perfusion und Beschädigungen des LSEC vermeiden, typischerweise manifestiert sich als große Lücken in der Zellmembran. Jedoch können angemessenen Fixierung häufig mittels Nadel Perfusion von Leberbiopsien von Menschen und Tieren gewonnen werden, wie an anderer Stelle beschrieben ^19. Diese Technik beinhaltet das direkte Einspritzen Fixiermittel in das Gewebe, bis Blut aus der Probe gespült und das Gewebe fest und fixiert. Fixation von Proben für die Elektronenmikroskopie braucht perf seinORMED möglichst schnell nach Beendigung des Blutflusses zu ultrastrukturelle Veränderungen als Folge der Lebern extrem schnelle autolytische Prozesse zu verhindern.

Wir stellen auch ein Verfahren zur Bildanalyse, die der Aufnahme von Artefakten minimiert, und vereinheitlicht die Messung von Fensteranordnungen. Variation bei der Auswahl der Sinuskurven für Mikroaufnahmen, Bildanalyse von Artefakten, und die Messung der Zellbereich für Porosität und Fensterfrequenz haben große Unterschiede in veröffentlichten Ergebnissen geführt. Eine Standardmethode zur Bewertung und Messung der Fensteranordnungen und der Mindestanforderungen für die Datendarstellung nicht eindeutig in der Literatur bisher ^4,10,20-31 gerichtet.

Protokoll

HINWEIS: Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren werden entsprechend der lokalen Gesetzgebung erfolgen. Unsere Arbeit wird von der Sydney Lokale Gesundheit Bezirk Animal Welfare Committee genehmigt. Die zulässigen Verfahren werden in dem Projekt-Lizenz Dokumentation beschrieben und folgen Richtlinien, die das Wohlbefinden des Tieres jederzeit zu gewährleisten. Achten Sie darauf, die Einhaltung der Rechtsvorschriften über Tierversuche des Landes, in dem die Arbeit ausgeführt wird.

1. Protokoll zur Herstellung von EM Fixative

1. Für 100 ml Fixiermittel, bereiten Para durch Zugabe von 2 g Paraformaldehyd Pulver zu 25 ml destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben, Hitze bis 65 ° C unter ständigem Rühren mit einem Magnetrührer.
   HINWEIS: Glutaraldehyd, Para und Natriumcacodylatpuffer sind alle gefährlichen Substanzen und müssen immer in Abzug, behandelt werden.
2. Wärme bei 65 ° C für 2 Minuten, dann abkühlen lassen. Falls erforderlich, fügen Sie Natronlauge dropwise unter Rühren zu Lösung vollständig zu löschen.
   HINWEIS: Natriumhydroxid ist gefährlich, mit Vorsicht handhaben.
3. 10 ml EM Sonderschaft Glutaraldehyd, 50 ml von 0,2 M Natriumcacodylatpuffer und 2 g Saccharose und rühren mit Magnetrührer. 2 ml von 1,0 M CaCl _2.
4. Auf pH 7,4 vor der Herstellung Lösung auf 100 ml mit destilliertem Wasser. Die endgültige Fixiermittel enthält 2,5% Glutaraldehyd, 2% Paraformaldehyd, 2 mmol CaCl _2, 2% Saccharose in 0,1 M Cacodylatpuffer. Stellen Sie sicher, dass die Gesamt Osmolalität 440 mOsmol / L. Verwenden Sie innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung.

2. Perfusionsfixierung der Leber

1. Warm Perfusionspuffer und Fixiermittel zu 35 bis 37 ºC. Die richtige Temperatur des Puffer Ausbluten und Fixiermittel hilft Gewebeintegrität zu gewährleisten.
2. Betäuben des Tieres mit einer einzelnen intraperitonealen Injektion von 50 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin.
3. Sobald das Tier untertiefe Narkose, von der hinteren Gliedmaßen und Schwanz Rückzug Prise beurteilt wird ein Y Schnitt mit stumpfen Enden Schere im Tierleib, die Leber und Pfortader freizulegen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Ausrüstung sauber, um eine Kontamination von Proben mit Mikroorganismen und allgemeinen Schmutz, die sich leicht auf SEM zu sehen sein wird zu vermeiden.
4. Binden zwei sehr lose Fäden um die Pfortader einer proximal der Leber, der andere weiter distal in die Leber.
5. Kanülieren die Pfortader mit einer entsprechend dimensionierten IV Kanüle (18 G für Ratten, 22 G für Mäuse) .Tighten Nähte Kanüle zu sichern.
6. Beginnen Perfusion mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 37 ºC und bei einem Druck von 10 cm H ₂ 0. Zwischen 5 und 20 ml PBS ist in der Regel erforderlich, um die Leber exsanguinate.
   HINWEIS: Nicht, damit Luftblasen, um die Leber durch die an der Kanüle, wie sie veran Artefakte sekundär zu Embolisation und Druck verbunden Rohre geben; Schäden an den Hepatozyten sinusoids und LSEC fenestrations tritt auf, wenn die Perfusion Druck zu hoch ist.
7. Trennen die Bauch- und Brust Hohlvene, damit der Puffer frei von der Leber zu verlassen. Dies verhindert, dass hohe Gegendruck Schäden an LSECs.
8. Sobald die Leber ist frei von Blut, ersetzen PBS mit EM Fixiermittel und perfundieren ca. 5 Minuten, bis die Leber ist gehärtet und sehr blass.
9. Unterbrechen Sie die Perfusion und schneiden Sie die feste Leber in 1-2 mm ³ Blocks mit einem scharfen Skalpell.
10. Post-fix Gewebe in EM Fixiermittel für 24-72 h bei 4 ºC.
    HINWEIS: In der Regel verursacht underfixation mehr Artefakte als overfixation.
11. Ändern Sie folgende Fixierungs post-fix Zeitraum auf 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für Lagerung bei 4 ºC.
    HINWEIS: Proben auf diese Weise gespeichert werden für einen längeren Zeitraum (bis zu 12 Monate), aber rechtzeitige sekundäre Fixierung erhalten bleiben und Prüfung für die besten Ergebnisse empfohlen.

3. Nadel Perfusion

HINWEIS: Needle Fixierung ist eine Variante der Perfusionsfixierung die Injektion direkt in Fixativ biopsiert Lebergewebe handelt. Ziel ist es, für Fixiermittel, um durch die Blutgefäße, um sie exsanguinate und setzen alle der Gewebeblock zu Fixativ gespült werden. Ist darauf zu achten, um den Einspritzdruck niedrig, um den Druck zu vermeiden Verletzungen ^18,19 zu halten.

1. Nehmen Sie ein kleines Stück Leber aus dem Tier oder Gegenstand und spülen in Kochsalzlösung, Blut und Schmutz zu entfernen.
2. Zeichnen Sie die physiologische Kochsalzlösung in die Spritze mit einer feinen Nadel (typischerweise eine Insulinspritze) ausgestattet.
3. Spritzen Sie die Kochsalzlösung sehr langsam in die Leber, bis Blut aus dem Gewebe gespült. Mehrfachinjektionen erforderlich.
4. Zeichnen Sie die EM Fixiermittel in eine andere Spritze mit einer feinen Nadel (typischerweise eine Insulinspritze) ausgestattet.
5. Spritzen Sie die Fixiermittel sehr langsam in die Leber, bis es hart und tan in Farbe wird. Mehrfacheinspritzungs erforderlich sein.
6. Schneiden Sie die festen Leber in 1-2 mm ³ Blocks mit einem scharfen Skalpell. Inkubieren EM Fixativ für 24 bis 72 h 4 ° C. Vor Beginn der Sekundärfixation 3 mal in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer waschen.

4. Vorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie

1. Waschprobe 3 mal in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer. Um Lipide zu beheben, senden Sie fixieren die Probe in 2% Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für 2 Stunden.
   HINWEIS: Gründliches Waschen ist sehr wichtig, wie Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid Quer reagieren und Artefakte auf SEM.
2. Spülen der Proben in zunehmenden Konzentrationen von Ethanol zur Dehydratisierung begonnen. Erste Spülung in 50% Ethanol für 5 Minuten; dann 3-mal für 5 min mit 70% Ethanol; Spülen 3 mal für 5 min mit 90% Ethanol; Spülen 2 mal für 5 Minuten in 100% Ethanol; und schließlich 2 mal Spülen für 10 Minuten in 100% Ethanol (Molekularsieb).
3. Entfernen Sie das gesamte Ethanol aus den Proben und ersetzen Sie mit Hexamethyldisilazan (HMDS) in Abzug, und lassen für 10 Minuten. HMDS Entfernen von Gewebeproben und verdampfen lassen.
   HINWEIS: HMDS ist stark hygroskopisch, wenn kalt daher erlauben, RT, bevor Sie zur abschließenden Entwässerungsschritt zu erreichen.
4. Optional montieren Sie die Proben sofort oder legen Sie sie in einem Exsikkator, bis bereit, für SEM montieren.

5. Montage

Hinweis: Die korrekte Probenmontage wird die Anzahl der klar abgegrenzten Sinuskurven für die Analyse unter SEM zur Verfügung zu maximieren.

1. Beschriften Sie die Basis der Metall SEM Stubs und gelten doppelseitigen leitfähigen Kohlenstoff-Band an der Spitze der Stichleitungen.
2. Visualisieren Proben unter Verwendung eines Binokular, die Oberfläche mit den besten Sinusoide zur nachfolgenden SEM identifizieren. Ort, der Oberfläche nach oben auf dem Kohlenstoffbandoberfläche der Stichleitung.
3. Stick Exemplare fest mit dem Stummel, sind nun bereit für die Proben Sputterbeschichtung.

ove_title "> 6. Coating

HINWEIS: Die Beschichtung der Probe mit einem feinen Film aus leitfähigem Metall (Gold oder Platin) in ein Zerstäubungsbeschichter Gründen der Probe und schützt sie vor Schäden durch den Elektronenstrahl. Wenn die Beschichtung zu dick Strukturen von Interesse können verdeckt werden.

1. Platz Stummel in die Vakuumkammer der automatischen Fein Zerstäubungsbeschichter, Set-Modus, um die Drehung und automatische Sputterbeschichtung für 45 sec. Verwenden Platinbeschichtung für feinere Details, aber Gold ist ebenfalls geeignet.
2. Eine dünne Schicht aus Kohlenstofffarbe auf die Außenflächen der Leberproben angebracht, dabei nicht zur Beschichtung der sinusförmigen Oberflächen.
3. Sobald die Proben mit Platin beschichtet und Kohlenstoff Farbe getrocknet sind sie bereit für die Beobachtung auf der SEM. Proben können in einem Exsikkator gelagert werden.

7. Mit dem Rasterelektronenmikroskop

1. Platz Exemplaren in Rasterelektronenmikroskop und Rück Mikroskop Vakuum.
2. Mit Standard-Mikroskop Betriebsverfahren zur Visualisierung von Proben durch, beginnend bei geringer Vergrößerung, die schrittweise Erhöhung Vergrößerung.
3. Stellen Sie sicher, das Mikroskop in geeigneter Weise für die Arbeitsabstand, Punktgröße und Astigmatismus angepasst.
4. Überprüfen Sie zur Fixierung Integrität. Wenn der LSEC ist meist frei von Lücken und enthält fenestrations Mess 30-250 nm Durchmesser dies in der Regel darauf hin, dass die Probenvorbereitung erfolgreich war.
5. Wenn die Sinuskurven sind voll von Lücken oder ohne Fensteranordnungen der Probenvorbereitung nicht erfolgreich war oder eine signifikante Pathologie. In diesem Fall schneiden die Probe mit einer sehr feinen Rasierklinge, und die Schnittflächen neu beschichtet und für die erfolgreiche Festsinuskurven analysiert.
6. Bei ca. 15.000-20.000 facher Vergrößerung wählen Flach LSEC Oberflächen, die frei von Schmutz mit guter Fixierung und wo die Fensteranordnungen deutlich sichtbar sind (in der Regel, die mindestens 10 Fensteranordnungen sind).
7. Bilder von mindestens 10 Sinuskurven zu speichern pro Leber, aus verschiedenen Bereichen der Blöcke unter Verwendung von mindestens zwei Blöcken pro Leber. Probenahme 10 Mikroaufnahmen bei 15.000 - 20.000-facher Vergrößerung pro Tier ist in der Regel ausreichend für die Quantifizierung der Fensteranordnungen, um stellvertretend für die gesamte Leber.

8. Analyse

HINWEIS: ImageJ-Software, die von der NIH kostenlos heruntergeladen werden kann wird verwendet, um Fensterdurchmesser und Frequenz (Quantifizierung www.imagej.nih.gov/ij ).

1. Bild öffnen J und stellen Sie die Waage mit der Maßstabsleiste im Bild (Screen shot 1) eingebettet ist.
2. Unter Verwendung der Polygon-Werkzeug in ImageJ, Spur um den gesamten flachen Bereich der LSEC einschließlich gefenstert und defenestrated Bereichen. Nicht nur verfolgen Sie die Siebplatten da dies fälschlich aufzublasen Porosität. Schließen alle großen Trümmerstücke, die auf der Zelloberfläche, die obscuri werden können, sindng Fensteranordnungen.
3. Zur Messung der Fensterdurchmesser, Spuren eine Linie durch den längsten Durchmesser jedes Fenster indem Sie das Linienwerkzeug aus und drücken Sie "m", um die Linie zu messen, und "d" (zu ziehen), um die Linie auf das Bild dauerhaft zu ziehen. Diese Linie wird als die Fensterdurchmesser. Die Länge der Leitung wird nun zur Verfügung stehen im Ergebnisfeld von ImageJ (Screen shot 2).
4. Messen alle Lücken, die größeren Löcher im LSEC Zytoplasma als 250 nm sowie fenestrations sind. Lücken sind oft Artefakte reflektierenden schlechter Durchblutung oder Fixierung jedoch Lücken können auch als Folge von Krankheit und Toxizität auftreten. Die Daten für die Lücken aus Berechnung der Fensterparameter später in der Analyse ausgeschlossen werden.
5. Der Bereich der Lücken, die nicht kreisförmig sind, sollten von Tracing um die Lücken und die Berechnung ihrer Fläche auf ImageJ berechnet werden.
6. Fügen Sie die Daten aus der Box in ImageJ Ergebnisse in eine Excel-Tabelle für further Analyse.

9. Berechnungen

1. Durchschnittliche Fensterdurchmesser = Durchschnitt aller Fenster Durchmesser (ohne Lücken, wo Lücken ≥ 250 nm).
2. Fläche = Fenestration pgr; r ^2, wobei r der Radius, von dem einzelne fenestrations Durchmesser (r = d / 2), ohne Lücken berechnet.
3. Porosität (%) = (Σ (& pgr; r ²⁾ / Gesamtfläche analysiert - Σ (Bereich der Lücken =)) (& mgr; m ²⁾⁾ × 100.
4. Fenestration Frequenz = Gesamtzahl der fenestrations / (Gesamtfläche analysierten-Σ (Bereich der Lücken) (& mgr; m ^2).

10. Präsentation der Fenestration Daten

Hinweis: Wann immer möglich, Publikationen, darunter die Quantifizierung von Fenster Daten sollten folgende Informationen enthalten

1. Fenestration Durchmesser, mit einer Erklärung bestätigt, was Grenzdurchmesser verwendet werden, um in dem Fensteranordnungen in der Regel zu definieren (zwischen 50 bis 250 nm), Fenestration Frequenz (Zahl / & mgr; m ²⁾ und die Porosität (%).
2. Eine Erklärung zur Bestätigung, ob Lücken in der Analyse, Frequenzverteilung Graph der Fensterdurchmesser und die Anzahl der Leber, die Blöcke, Bildern und Fensteranordnungen sollten in die Analyse einbezogen werden einbezogen.

Ergebnisse

Anfangs Visualisierung bei geringer Vergrößerung mit dem Rasterelektronenmikroskop zeigt, eine flache Oberfläche der Leber Probe mit einer exponierten Fläche groß genug, um viele große Lebergefäße und Sinusoide (Figur 1A) zu beobachten. Sicherstellen der korrekten Leberblock Platzierung auf der Montagestummel ist unerlässlich für den Erhalt von klaren Bildern der Sinusoide und die Glisson-Kapsel der Leber sollte aus diesem Grund (1B) vermieden werden. Erhöhen der Vergrößeru...

Diskussion

Die Fähigkeit, den Status der Lebersinus Endothel genau und reproduzierbar zu messen, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Biologie dieser hochspezialisierten Zellen. Neuere Techniken wie strukturierte Beleuchtung Mikroskopie ^32, Rasterkraftmikroskopie ³³ und d-STORM (direkte Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy) ³⁴ wichtige Informationen vermitteln über die Morphologie dieser Zellen in vitro, aber SEM bleibt die primäre Methode zur Visualisierung und Messung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of material	Company	Catalogue Number	Comments
EM grade Glutaraldehyde	ProSciTech	C001	Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder	Sigma Aldrich	158127	Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder	Sigma Aldrich	C0250	Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016	Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide	ProSciTech	C011	Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute	Sigma Aldrich	459836	100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol	Labtech	EL5	Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	52619	Allow to reach room temperature before use
Cannulas	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape	ProSciTech	IA0201
Carbon Paint	ProSciTech	I003
Ketamine			Must be optained under licence
Xylazine			Must be obtained under licence
Molecular Sieve	Sigma Aldrich	208647	Removes water from the 100 % Ethanol