Un metodo standardizzato per l'analisi delle cellule epatiche sinusoidali endoteliali e loro fenestrazioni da microscopia elettronica a scansione

Riepilogo

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Abstract

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Introduzione

Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) sono altamente cellule endoteliali differenziate che rivestono la parete della sinusoide epatica. LSECs sono perforate con finestrature che non sono diaframmato, transcellulare pori 50-250 nm di diametro. Fino al 20% della superficie di LSECs è coperto da fenestrations, che sono di solito in gruppi di decine o centinaia chiamati piatti forati ^1-3 (Figura 1). Fenestrations consentono il trasferimento di plasma e nanosubstrates tra sangue e epatociti, creando un sistema di ultrafiltrazione altamente efficiente. Fenestrazioni sono strutture dinamiche - sia la loro dimensione e / o il numero può essere modificato in risposta a vari stati fisiologici, farmaci e malattie. Ad esempio, finestrature sono più grandi nel digiuno che a stomaco pieno ^4; 2-di-iodoamphetamine aumenta numero finestratura, ^5,6 e una riduzione delle dimensioni e del numero di finestrature per verifica delle cellule in invecchiamento e molte malattie stati ^7-13 . La misurazione accurata delle dimensioni e del numero di finestrature è importante per capire come LSEC morfologia è influenzata da vari malattia, tossico, e gli stati fisiologici; il loro impatto sulla funzionalità epatica; e per sviluppare fenestrazione-modulante interventi terapeutici ^1.

Lo studio delle finestrature è difficile. Il diametro di finestrature si trova sotto la risoluzione della microscopia ottica convenzionale, così precedenza solo osservazione usando microscopia elettronica sia in tessuto epatico o coltivate LSECs intatte stato possibile. Il microscopio elettronico a scansione (SEM) è stato più frequentemente usato per studiare dimensioni fenestrazione, frequenza e porosità (la percentuale di membrane LSEC che è perforata da fenestrations) perché SEM consente l'osservazione di grandi aree della superficie endoteliale e la misurazione di migliaia, se non decine di migliaia di finestrature. Nonostante la sua utilità, i risultati che sono riportati dagli studi SEM-based perParametri LSEC come le dimensioni fenestrazione, numero, frequenza e porosità variano ampiamente in letteratura (Tabella 1).

Fenestrazioni e piatti forati sono strutture fragili tale contratto, si rompono, si dilatano o fondono durante la preparazione dei campioni, quindi attenzione a trattamento è necessario per preservare la loro integrità. Elevata pressione di perfusione ^14; errata osmolarità del fissativo e buffer ^15; fissazione inadeguata o fissazione tempo; e la velocità di post-fissazione disidratazione ed essiccamento sono tutte le aree di elaborazione per SEM che possono produrre manufatti che interferiscono con la conservazione di ultrastruttura (Figura 2). Perdita di fenestrations ('defenestration') e finestratura restringimento può verificarsi come risultato di fissaggio poveri, con conseguente riduzione di diametro finestratura e porosità cellule. Metodi per migliorare la conservazione di campioni per analisi SEM sono stati descritti precedentemente ^15-17 e verranno discussiqui con ulteriori suggerimenti su come migliorare la conservazione dei campioni. I principali obiettivi della conservazione del campione sono per rimuovere sangue dai sinusoidi modo che la superficie del LSEC può essere visualizzata e per evitare danni LSEC sia da alta pressione o fissazione ritardata. Tutta la perfusione del fegato di fissativo attraverso la vena porta è il metodo preferito per il fissaggio del fegato. Come descritto in dettaglio altrove ^16,18 perfusione deve essere effettuata a bassa pressione (ad esempio 10 cm H ₂ 0) per evitare artefatti perfusione relativi alla pressione e danni al LSEC, tipicamente manifesta come grandi lacune all'interno della membrana cellulare. Tuttavia, la fissazione ragionevole spesso può essere ottenuto utilizzando ago perfusione di biopsie epatiche da esseri umani e animali, come descritto in dettaglio altrove ^19. Questa tecnica comporta l'iniezione direttamente fissativo nel tessuto fino sangue viene lavata dal campione e il tessuto è ferma e fissa. Fissazione dei campioni per la microscopia elettronica deve essere perfORMED più rapidamente possibile dopo la cessazione del flusso di sangue per prevenire cambiamenti ultrastrutturali si verificano a seguito dei processi fegati autolitici estremamente rapidi.

Presentiamo anche un metodo di analisi di immagine che minimizza l'inclusione di manufatti, e standardizza la misurazione di finestrature. Variazione nella selezione di sinusoidi per micrografie, analisi di immagine di manufatti, e misurazione della superficie cellulare per porosità e fenestrazione frequenza hanno portato a grandi discrepanze nei risultati pubblicati. Un approccio standardizzato per la valutazione e la misurazione delle finestrature ei requisiti minimi per la presentazione dei dati non sono stati chiaramente affrontato nella letteratura in precedenza ^4,10,20-31.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono effettuate secondo la legislazione locale. Il nostro lavoro è approvato dal Distretto Sanitario Comitato il benessere degli animali Sydney locale. Le procedure consentite sono descritte nella documentazione di licenza del progetto e seguire le linee guida che garantiscono il benessere degli animali in ogni momento. Garantire il rispetto della normativa in materia di sperimentazione animale del paese in cui viene eseguito il lavoro.

1. Il protocollo per la preparazione EM Fixative

1. Per 100 ml di fissativo, preparare paraformaldeide aggiungendo 2 g di paraformaldeide in polvere a 25 ml di acqua distillata in una beuta, calore a 65 ° C, mescolando continuamente con un agitatore magnetico.
   NOTA: glutaraldeide, paraformaldeide e tampone cacodilato sodio sono tutte le sostanze pericolose e devono sempre essere trattati in fumehood.
2. Il calore a 65 ° C per 2 minuti poi lasciar raffreddare. Se necessario, aggiungere una soluzione di idrossido di sodio dropwISE mescolando per cancellare completamente la soluzione.
   NOTA: idrossido di sodio è pericoloso, maneggiare con cura.
3. Aggiungere 10 ml di qualità EM magazzino glutaraldeide, 50 ml di tampone cacodilato 0,2 M di sodio e 2 g di saccarosio e mescolare con agitatore magnetico. Aggiungere 2 ml di 1,0 M CaCl _2.
4. Regolare a pH 7,4, prima di effettuare la soluzione a 100 ml con acqua distillata. Il fissativo finale contiene 2,5% di glutaraldeide, 2% paraformaldeide, 2 mmol CaCl _2, 2% di saccarosio in 0,1 M tampone cacodilato. Assicurarsi che il Osmolalità totale è 440 mOsmol / L. Utilizzare entro 24 ore di preparazione.

2. Perfusione Fissazione di fegato

1. Buffer di perfusione Caldo e fissativo a 35-37 ° C. La corretta temperatura del buffer di dissanguamento e fissatore consente di garantire l'integrità dei tessuti.
2. Anestetizzare l'animale con una singola iniezione intraperitoneale di 50 mg / kg ketamina e 5 mg / kg xilazina.
3. Una volta che l'animale è sottoanestesia profonda, valutata con il ritiro degli arti posteriori e la coda pizzico, un'incisione Y è realizzato con blunt finito le forbici in addome dell'animale per esporre la vena del fegato e del portale.
   NOTA: Assicurarsi che le apparecchiature sia pulito per evitare la contaminazione dei campioni con microrganismi e detriti generale che sarà facilmente visibili sul SEM.
4. Tie due suture molto sciolto intorno alla vena porta uno prossimale al fegato, l'altra più distalmente al fegato.
5. Incannulare la vena porta con una cannula di dimensioni adeguate IV (18 G per i ratti, 22 G per topi) suture .Tighten per fissare cannula.
6. Iniziare perfusione con tampone fosfato salino riscaldato a 37 ° C e ad una pressione di 10 cm H ₂ 0. Tra 5 e 20 ml di PBS è solitamente richiesto di Exsanguinate fegato.
   NOTA: Non permettere bolle d'aria di entrare nel fegato attraverso i tubi collegati alla cannula come inducono artefatti secondari di embolizzazione e pressione; Danni ai epatociti, sinusoids e fenestrazioni LSEC si verifica se la pressione di perfusione è troppo alta.
7. Recidere il addominale e toracica vena cava per consentire il buffer per uscire liberamente dal fegato. Questo previene i danni schienale alto-pressione LSECs.
8. Una volta che il fegato è libera di sangue, sostituire PBS con EM fissativo e profumato per circa 5 minuti, fino a quando il fegato è indurito e molto pallido.
9. Interrompere la perfusione e tagliare il fegato fissato in 1-2 mm ³ blocchi con un bisturi affilato.
10. Post-fix tessuto EM fissante per 24-72 ore a 4 ° C.
    Nota: in generale, underfixation provoca più manufatti di overfixation.
11. Cambiare fissativo seguente periodo post-fix per 0,1 M di sodio tampone cacodilato per la conservazione a 4 ° C.
    NOTA: i campioni memorizzati in questo modo saranno conservati per un periodo di tempo significativo (fino a 12 mesi), la fissazione secondaria però tempestivo ed esame è raccomandato per i migliori risultati.

3. Ago Perfusion

NOTA: la fissazione Needle è una variante della fissazione perfusione che prevede l'iniezione di fissativo direttamente nel tessuto del fegato biopsia. L'obiettivo è per fissativo di essere lavato attraverso i vasi sanguigni in modo da Exsanguinate loro ed esporre tutto il blocco tessuto fissativo. Bisogna fare attenzione a mantenere la pressione di iniezione a bassa pressione per evitare lesioni ^18,19.

1. Rimuovere un piccolo pezzo di fegato da animali o soggetto e risciacquare in soluzione fisiologica per rimuovere il sangue e detriti.
2. Disegnare la soluzione fisiologica nella siringa con ago calibro fine (in genere una siringa da insulina).
3. Iniettare la soluzione salina molto lentamente nel fegato fino sangue viene lavata del tessuto. Iniezioni multiple possono essere richiesti.
4. Disegnare il fissativo EM in un'altra siringa con ago calibro fine (in genere una siringa da insulina).
5. Iniettare il fissativo molto lentamente nel fegato finché diventa dura e di colore marrone. Iniezione multiplas può essere richiesto.
6. Tagliare il fegato fissato in 1-2 ^mm3 isolati con un bisturi affilato. Incubare in EM fissante per 24-72 ore a 4 ° C. Lavare 3 volte in 0.1 M di sodio tampone cacodilato prima di iniziare la fissazione secondario.

4. Preparazione per microscopia elettronica a scansione

1. Lavare campione 3 volte in tampone cacodilato 0.1 M di sodio. Per risolvere i lipidi, posta fissare il campione in 2% tetrossido di osmio in tampone cacodilato 0.1 M di sodio per 2 ore.
   NOTA: Complete lavaggio è molto importante in quanto trasversale glutaraldeide e tetrossido di osmio reagiscono e producono manufatti in SEM.
2. Risciacquare i campioni in concentrazioni crescenti di etanolo per iniziare la disidratazione. Primo risciacquo in etanolo al 50% per 5 minuti; poi 3 volte per 5 min a 70% di etanolo; risciacquare 3 volte per 5 min con etanolo al 90%; risciacquare 2 volte per 5 min in 100% di etanolo; ed infine risciacquare 2 volte per 10 min in 100% di etanolo (setaccio molecolare).
3. Rimuovere tutti etanolo dai campioni e sostituirlo con esametildisilazano (HMDS) in fumehood e lasciar riposare per 10 minuti. Rimuovere HMDS dai campioni di tessuto e lasciate evaporare.
   NOTA: HMDS è altamente igroscopico freddo quindi permettono di raggiungere RT prima di utilizzare per la fase finale di disidratazione.
4. Opzionalmente, montare i campioni immediatamente o metterli in un essiccatore fino al momento di montare per SEM.

5. Montaggio

NOTA: il montaggio esemplare corretta massimizzerà il numero di sinusoidi chiaramente delineati disponibili per l'analisi sotto SEM.

1. Etichettare la base del metallo stub SEM e applicare nastro biadesivo carbonio conduttivo all'inizio degli stub.
2. Visualizzare campioni utilizzando un microscopio da dissezione per identificare la superficie con le migliori sinusoidi per la successiva SEM. Posizionare la superficie verso l'alto sulla superficie del nastro di carbonio dello stub.
3. Esemplari Stick fermamente allo stub, i campioni sono ora pronti per il rivestimento sputtering.

ove_title "> 6. Coating

NOTA: rivestimento il campione con una sottile pellicola di metallo conduttivo (oro o platino) in un terreno polverizzazione coater il campione e la protegge dai danni del fascio di elettroni. Se il rivestimento è troppo spessi strutture di interesse possono essere oscurate.

1. Posizionare stub nella camera a vuoto di multa dispositivo a induzione automatica polverizzazione, la modalità a rotazione e rivestimento in automatico sputtering fissati per 45 sec. Utilizzare il rivestimento di platino per dettagli più raffinati, ma l'oro è anche adatto.
2. Applicare un sottile strato di vernice di carbonio alle superfici esterne dei campioni di fegato montati, facendo attenzione a non ricoprire le superfici sinusoidali.
3. Una volta che i campioni sono rivestiti con platino e carbonio vernice è asciugata sono pronti per l'osservazione al SEM. I campioni possono essere conservati in un essiccatore.

7. Utilizzando il microscopio elettronico a scansione

1. Luogo campioni in microscopio elettronico a scansione e tornare al microscopio al vuoto.
2. Utilizzando le procedure operative standard per la visualizzazione al microscopio di campioni da iniziare con un ingrandimento basso, aumentando gradualmente l'ingrandimento.
3. Assicurarsi che il microscopio è regolato in modo appropriato per il lavoro a distanza, dimensione dello spot e l'astigmatismo.
4. Verificare l'integrità fissazione. Se la LSEC è per lo più priva di lacune e contiene fenestrazioni misura 30-250 nm di diametro questo sarebbe generalmente indicano che la preparazione dei campioni ha avuto successo.
5. Se le sinusoidi sono piene di lacune o privo di finestrature la preparazione del provino non ha avuto successo o non è significativa patologia. In questo caso, la fetta di campione con una lama di rasoio molto fine, e le superfici di taglio riverniciato e analizzati per sinusoidi fissi successo.
6. A circa 15.000-20.000 × ingrandimento selezionare superfici LSEC piane che sono privi di detriti con buon fissaggio e dove le finestrature sono chiaramente visibili (tipicamente contenente almeno 10 fenestrazioni).
7. Salvare immagini di almeno 10 sinusoidi per fegato, da diverse aree dei blocchi, utilizzando almeno due blocchi per il fegato. Campionamento 10 microscopio a 15.000 - 20.000 × ingrandimento per animale è generalmente sufficiente per la quantificazione di finestrature per essere rappresentativi dell'intero fegato.

8. Analisi

NOTA: Il software ImageJ che può essere scaricato gratuitamente dal NIH viene utilizzato per quantificare il diametro finestratura e frequenza ( www.imagej.nih.gov/ij ).

1. Apri immagine J e impostare la scala utilizzando la barra della scala incorporato nella foto (Screen shot 1).
2. Utilizzando lo strumento poligono ImageJ, tracce intorno a tutta la zona pianeggiante della LSEC comprese le aree fenestrate e defenestrato. Non basta tracciare i piatti forati in quanto ciò falsamente gonfiare porosità. Escludere i grandi pezzi di detriti che si trovano sulla superficie delle cellule che potrebbe essere obscurifenestrazioni ng.
3. Per misurare il diametro finestratura, tracciare una linea attraverso il diametro più lungo di ogni finestratura selezionando lo strumento linea, e premere il tasto "m" per misurare la linea, e "d" (disegnare) per disegnare in modo permanente la linea sull'immagine. Questa linea è definito come il diametro finestratura. La lunghezza della linea sarà ora disponibile nella casella dei risultati di ImageJ (Screen shot 2).
4. Misurare tutte le lacune che sono fori più grandi nel citoplasma LSEC oltre 250 nm, nonché finestrature. Lacune sono spesso artefatti riflettono scarsa perfusione o fissazione, tuttavia lacune anche possono verificarsi a seguito di malattie e tossicità. I dati di lacune saranno esclusi dal calcolo dei parametri fenestrazione tardi nell'analisi.
5. L'area di lacune che non sono circolare dovrebbe essere calcolato tracciando intorno le lacune e calcolando la loro area su ImageJ.
6. Incollare i dati dalla casella dei risultati in ImageJ in un foglio Excel per furtheanalisi r.

9. Calcoli

1. Media finestratura diametro = media di tutti i diametri di finestratura (non compresi i salti, dove le lacune sono ≥ 250 nm).
2. Fenestration zona = πr ^2, dove r, il raggio, si calcola dall'individuo diametro fenestrazioni (r = d / 2), ad esclusione di lacune.
3. Porosità (%) = (Σ (πr ²⁾ / superficie totale analizzata - Σ (area delle lacune =)) (micron ²⁾⁾ × 100.
4. Frequenza Fenestration = numero totale di finestrature / (superficie totale analizzata-Σ (area di lacune) (micron ^2).

10. Presentazione di Fenestration dati

NOTA: Quando è possibile, pubblicazioni tra cui la quantificazione dei dati finestratura dovrebbero includere le seguenti informazioni

1. Diametro Fenestration, con una dichiarazione che conferma ciò che i diametri di confine dove utilizzato per definire finestrature (tipicamentetra 50-250 nm), frequenza Fenestration (numero / micron ²⁾ e porosità (%).
2. Una dichiarazione che chiede di confermare le lacune sono state incluse nell'analisi, grafico di distribuzione di frequenza del diametro di finestratura e il numero di fegati, blocchi, immagini fenestrazioni dovrebbero essere inclusi nell'analisi.

Risultati

Visualizzazione iniziale a basso ingrandimento microscopio elettronico a scansione rivela una superficie piana del campione di fegato con una superficie esposta abbastanza grande da osservare molti grandi vasi epatici e sinusoidi (Figura 1A). Garantire il corretto posizionamento del blocco di fegato sulla matrice di montaggio è essenziale per ottenere immagini nitide di sinusoidi e la capsula di Glisson del fegato deve essere evitato per questo motivo (Figura 1B). Aumentando l'ingr...

Discussione

La capacità di precisione e riproducibilità misurare lo stato del fegato endotelio sinusoidale è un passo importante nella comprensione della biologia di queste cellule altamente specializzate. Le tecniche più recenti, come la microscopia strutturato illuminazione ^32, microscopia a forza atomica ³³ e d-STORM (diretta Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy) ³⁴ saranno di comunicare informazioni importanti per quanto riguarda la morfologia di queste cellule in vitro, ma S...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of material	Company	Catalogue Number	Comments
EM grade Glutaraldehyde	ProSciTech	C001	Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder	Sigma Aldrich	158127	Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder	Sigma Aldrich	C0250	Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016	Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide	ProSciTech	C011	Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute	Sigma Aldrich	459836	100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol	Labtech	EL5	Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	52619	Allow to reach room temperature before use
Cannulas	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape	ProSciTech	IA0201
Carbon Paint	ProSciTech	I003
Ketamine			Must be optained under licence
Xylazine			Must be obtained under licence
Molecular Sieve	Sigma Aldrich	208647	Removes water from the 100 % Ethanol