走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法

要約

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

要約

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

概要

肝類洞内皮細胞（のLSEC）は、高度の肝正弦波の壁を覆う内皮細胞を分化されます。のLSECを非diaphragmedある穿孔で穿孔され、経細胞は、直径50〜250 nmの細孔。のLSECの表面の最大20％が篩板^1-3（ 図1）と呼ばれる数十〜数百のグループに通常は穿孔によって覆われています。開窓は非常に効率的限外濾過システムを作成し、血液と肝細胞との間にプラズマとnanosubstratesの転送を可能にします。開窓は動的構造である - それらのサイズおよび/または数の両方は、種々の生理学的状態、薬物、および疾患に応じて変更することができます。例えば、開窓は摂食状態⁴よりも絶食が大きいです。 2ジヨードアンフェタミンは開窓の数を増加させ^、5,6および細胞あたり穿孔のサイズおよび数の減少は、加齢および多くの疾患状態^7-13で起こります。穿孔のサイズと数の正確な測定は、LSECの形態は、種々の疾患、毒性、および生理学的状態に影響される方法を理解するために重要です。肝機能に及ぼす影響。および開発するための治療的介入^1を開窓を調節。

開窓の研究は困難です。開窓の直径は、両方の無傷の肝臓組織または培養のLSECに電子顕微鏡を用いて、先にのみ観察が可能であった、従来の光学顕微鏡の解像度の下にあります。走査型電子顕微鏡（SEM）は、最も頻繁に、SEMは、数千の内皮表面と測定の大部分の観察を可能にするために開窓サイズ、周波数及び気孔率（開窓によって穿孔さLSEC膜の割合）を研究するために使用されていますそうでない場合は数十開窓の何千もの。その有用性にもかかわらず、結果がために、SEMベースの研究から報告されますこのような開窓大きさ、数、周波数および多孔性などのLSECのパラメータは、文献（ 表1）に大きく異なります。

開窓とふるい板は、契約、ブレーク拡張または試料調製中に合体壊れやすい構造であり、このように慎重な処理は、それらの整合性を維持するために必要とされます。上昇灌流圧^14;固定液およびバッファ¹⁵の誤った浸透圧;不十分な固定または固定時間。とポストの固定、脱水、乾燥の速度は超微細構造の保存（ 図2）と干渉アーティファクトを生成することができるSEMのための処理のすべての領域です。開窓の損失（「窓外放出 '）と開窓収縮が減少し開窓径および細胞間隙率で、その結果、貧困層の固定の結果として発生する可能性があります。 SEM分析のための試料の保存性を向上させる方法は、先に^15-17に記載されていると説明されますここでは、試料の保存性を改善する方法についての追加のヒントを。試料保存の主な目標は、LSECの表面を可視化することができるように、正弦波から血液を除去し、高圧または遅延固定のいずれかからLSECの損傷を回避するためです。門脈を介して固定液の全肝灌流は、肝臓固定するための好ましい方法です。詳細に説明したように他の場所で^16,18灌流が低圧で行われなければならない（例えば、H ₂ 0 10 cm）のLSECに圧力関連灌流遺物や損傷を回避するためには、典型的には、細胞膜における内などの大きなギャップを明らかに。他の箇所¹⁹で詳細に説明したようしかし、合理的な固定は、多くの場合、ヒトおよび動物の肝生検の針灌流を使用して得ることができます。血液試料からフラッシュされるまで、この技術は、直接組織に固定液を注入することを含むと組織がしっかりと固定されています。電子顕微鏡用試料の固定はPERFする必要があります肝臓極めて迅速自己分解プロセスの結果として生じる微細構造の変化を防止するための血流の停止後、できるだけ速やかにormed。

我々は、アーチファクトの混入を最小限に抑え、かつ開窓の測定を標準化する画像解析の方法をも提供します。多孔性および開窓周波数について顕微鏡写真用正弦波の選択の変化、アーティファクトの画像解析、およびセル面積の測定は、公表された結果の主な相違につながっています。開窓とデータ表示のための最小要件の評価および測定のための標準化されたアプローチは、明らかに以前^4,10,20-31文献で ​​扱われていません。

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プロトコル

注：動物の使用を含むすべての手順は現地の法律に従って行われます。私たちの仕事はシドニー現地保健地区動物福祉委員会によって承認されています。許可された手順は、プロジェクトのライセンスのドキュメントに記載されており、すべての回で、動物の福祉を確保するためのガイドラインに従っています。作業が行われている国の動物実験に関する法律の遵守を確認してください。

EM固定剤を調製するための1プロトコル

1. 固定液100mlを、磁気撹拌機で絶えず撹拌しながら、三角フラスコに蒸留水25ミリリットル、65ºCの熱パラホルムアルデヒド粉末2gを添加することによって、パラホルムアルデヒドを準備します。
   注：グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびカコジル酸ナトリウム緩衝液は、すべての有害物質であり、常に換気フード内で処理する必要があります。
2. 2分間65ºCの熱は、その後冷却します。必要に応じて、水酸化ナトリウム溶液を加えるdropwISE完全に透明な溶液に、撹拌しながら。
   注：水酸化ナトリウムは危険です、取り扱いに注意して。
3. EMグレードの株式のグルタルアルデヒドの10ミリリットル、50の0.2Mカコジル酸ナトリウム緩衝液mlのショ糖の2グラムを追加し、マグネチックスターラーで攪拌します。 1.0 M CaCl ₂を2ミリリットルを追加します。
4. 蒸留水で100mlにソリューションを構成するに先立ってpHを7.4に調整します。最終的な固定液は、2.5％のグルタルアルデヒド、2％パラホルムアルデヒド、2ミリモルのCaCl _2、0.1 Mカコジル酸緩衝液中の2％スクロースを含有します。総浸透圧が440ミリオスモル/ Lであることを確認してください。準備の24時間以内に使用してください。

肝臓の2灌流固定

1. 37ºC - 35ウォーム灌流緩衝液および固定液。放血バッファおよび固定液の正確な温度は、組織の整合性を確保するのに役立ちます。
2. を50mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジンの単回腹腔内注射で動物を麻酔し。
3. 動物は、下になったら後肢の引っ込めと尾のピンチによって評価深麻酔は、Yの切開は、肝臓と門脈を露出させるために、動物の腹部の平滑末端のはさみで作られています。
   注：その機器が容易にSEMで見られます微生物や一般破片と試料の汚染を回避するために、クリーンであることを確認してください。
4. 他のより遠位の肝臓に、肝臓に門脈の周りに1近位に2つの非常に緩い縫合糸を結びます。
5. （マウス用のラットで18 G、22 G）適切なサイズIVカニューレとカニューレを確保する.Tighten縫合糸を門脈にカニューレを挿入。
6. リン酸緩衝生理食塩水で灌流を開始37ºCに加温し、そしてH _{2 O}の10cmの圧力で行われます。 PBSの5〜20mlを、通常肝臓に放血するために必要とされます。
   注：気泡は、彼らが塞栓と圧力に二次的アーティファクトを誘導するようにカニューレに接続されたチューブを介して肝臓に入力できるようにしないでください。肝細胞の損傷、SI灌流圧が高すぎるnusoidsとLSECの開窓が発生します。
7. バッファは肝臓から自由に出ることができるように、腹部と胸部大静脈を切断。これは、のLSECに高い背圧による損傷を防止します。
8. 肝臓は血液の自由になると、EM固定剤を含むPBSを交換し、肝臓が硬化して非常に薄いされるまで、約5分間灌流。
9. 灌流を中止し、1に固定された肝臓をカット-鋭いメスを用いて2mmの³ブロック。
10. 4ºCで72時間 - 24 EM固定剤でポストフィックス組織。
    注：一般的に、underfixationはoverfixation以上のアーティファクトを引き起こします。
11. 4ºCで保存、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液に接尾期間以下の固定液に変更します。
    注：この方法で保存された試験片は（12ヶ月まで）かなりの時間のために保存されます、しかし、タイムリーな二次固定と検査は最良の結果を得るために推奨されています。

3.ニードルPerfusion

注：ニードル固定は、直接生検肝組織に固定液を注入することを含む灌流固定の変形です。目的は、それらを放血し、固定液に組織ブロックのすべてを露出させるために、血管を通ってフラッシュする固定剤のためのものです。ケアは、圧力傷害^18,19を回避するために低い注入圧力を保つように注意しなければなりません。

1. 動物または被験体から肝臓の小片を除去し、血液や破片を除去するために生理食塩水ですすいでください。
2. ファインゲージの針（典型的にはインスリン注射器）を取り付けたシリンジに通常の生理食塩水を描画します。
3. 血液が組織の外にフラッシュされるまで、肝臓に非常にゆっくりと生理食塩水を注入します。複数回の注射が必要な場合があります。
4. ファインゲージの針（典型的にはインスリン注射器）を取り付けた別のシリンジにEM固定剤を描画します。
5. それはハードで色は黄褐色になるまで肝臓に非常にゆっくりと固定液を注入します。頻回注射sが必要とされ得ます。
6. 鋭いメスを用いて2mmの³ブロック- 1に固定された肝臓をカット。 72時間4℃ - 24のためのEM固定剤でインキ​​ュベートします。二次固定を開始する前に、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で3回洗浄します。

走査型電子顕微鏡4.準備

1. 洗浄サンプル、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で3回。脂質を修正するには、ポストは2時間、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の2％四酸化オスミウムのサンプルを修正します。
   注：グルタルアルデヒドと四酸化オスミウムの交差反応し、SEMのアーティファクトを生成するように完全な洗浄は非常に重要です。
2. 脱水を開始するために、エタノールの濃度を増加さでサンプルをすすぎます。 5分間、50％エタノールで洗い流し、その後、70％エタノールで5分間3回、 90％のエタノールで5分間、3回すすぎ、 100％エタノールで5分間2回リンス。そして最後に100％エタノール（分子篩）中で10分間2回リンス。
3. サンプルからすべてのエタノールを除去と換気フードにヘキサメチルジシラザン（HMDS）と交換し、10分間のままにします。組織サンプルからHMDSを削除し、蒸発させます。
   注：したがって、最終脱水工程のために使用する前に室温に到達させるときに冷たいHMDSは非常に吸湿性です。
4. 必要に応じて、すぐにサンプルをマウントするか、SEMのためにマウントする準備ができるまでデシケーターに入れます。

5.取り付け

注：正しい試料取付は、SEMで分析のために利用可能な明確に線引き正弦波の数を最大化します。

1. 金属SEMスタブのベースにラベルを付け、スタブの先頭に両面導電性カーボンテープを適用します。
2. 後続のSEMのための最良の正弦波で表面を識別するために、解剖顕微鏡を用いて試料を可視化。スタブのカーボンテープ表面に上向きにその表面を置きます。
3. スティック片をしっかりとスタブに、標本は今スパッタコーティングの準備ができています。

ove_title "> 6。塗装

注：スパッタコーター敷地内に試料を導電性金属（金、プラチナ）の緻密な膜で試料を塗布し、電子ビームによる損傷から保護します。コー​​ティングが厚すぎると、目的の構造が隠されてもよいです。

1. 回転および45秒間自動スパッタコーティングにモードを設定する自動微細スパッタコーターの真空チャンバ内に配置スタブ。しかし、金にも適しており、細かいディテールのためにプラチナコーティングを使用してください。
2. 被覆するために、正弦波の表面を注意していないながら、取り付けられ肝臓検体の外部表面にカーボン塗料の薄い層を適用します。
3. 標本はプラチナでコーティングされており、炭素塗料が乾燥した後、彼らは、SEMの観察の準備ができています。サンプルをデシケーター中で保存することができます。

前記走査型電子顕微鏡を使用して

1. 場所は、走査型電子顕微鏡に標本や真空に顕微鏡を返します。
2. 低倍率で開始することによって試料の可視化のための標準的な顕微鏡の操作手順を使用して、徐々に倍率を増加させます。
3. 顕微鏡は、距離、スポットサイズと非点収差を操作するための適切に調整されていることを確認。
4. 固定の整合性をチェックします。 LSECは、隙間からほとんどが無料で、30測定開窓が含まれている場合 - これは、一般的に試料作製に成功したことを示す250 nmの直径を。
5. 正弦波は、ギャップの完全または開窓を欠いている場合には、試料調製は成功していないか、重大な病状があります。この場合には、非常に微細なかみそりの刃でサンプルをスライスし、切断面は、重ね塗りし、正常に固定された正弦波を分析しました。
6. 約15,000〜20,000倍の倍率で良好な定着と開窓が明確に（表示されている場合に典型的には、少なくとも10開窓を含むとデブリのない平らなLSECの表面を選択）。
7. 肝臓あたり少なくとも二つのブロックを使用して、ブロックの異なる領域から、肝臓あたり少なくとも10正弦波の画像を保存します。 15,000で10顕微鏡写真をサンプリング - 開窓の定量化は、肝臓全体の代表であるために、動物あたり20,000倍の倍率は、一般的に十分です。

8.分析

注：NIHから無償でダウンロードすることができますImageJソフトウェアは、開窓径と周波数（定量化するために利用されるwww.imagej.nih.gov/ijを ）。

1. 画像を開くJと（ 画面は、1ショット ）画像に埋め込 ​​まれたスケールバーを使用してスケールを設定します。
2. ImageJの中のポリゴンツールを使用して、有窓とdefenestrated領域を含むLSECの全体の平坦な領域の周りにトレース。これは誤って気孔率を膨らまれるように、単にふるいプレートをトレースしません。 obscuriかもしれない細胞表面にあるデブリのいずれかの大規模な作品を除外NGの開窓。
3. 、開窓径を測定ラインツールを選択することにより、各開窓の最大直径を通る線をトレースして、ラインを測定するために「M」を押し、「D」永久に画像上に線を描画する（描きます）。この行は、開窓の直径として定義されます。線の長さは、現在のImageJ（ スクリーンショット2）の結果ボックスで利用できるようになります。
4. 250 nmのオーバーLSEC細胞質内で大きく穴であるすべてのギャップを測定し、同様に開窓。ギャップはギャップがまた、疾患および毒性の結果として発生する可能性がありますが、多くの場合、貧しい灌流または固定を反映した工芸品です。ギャップのデータは、後の分析における開窓パラメータの計算から除外されます。
5. 円形でないギャップの面積は、ギャップの周りトレースとImageJの上での面積を計算することによって計算されるべきです。
6. furtheためのExcelスプレッドシートにはImageJに結果ボックスからデータを貼り付けR解析。

9.計算

1. （ギャップは≥250 nmであるギャップを含まない）、すべての開窓径の平均開窓径=平均。
2. 開窓面積^=πR2、R、半径は、ギャップを含まない、個々の穿孔の直径（R = D / 2）から計算されます。
3. 気孔率^{（％）=（Σ（πR2）/}分析総面積-ギャップのΣ（面積=））（μmの^{2））×100。}
4. 開窓周波数=ギャップの（面積）（μmの^2） - Σ分析開窓/（総面積の合計数。

開窓データの10プレゼンテーション

注：開窓データの定量化を含め、可能な限りの資料は、以下の情報を含める必要があります。

1. 使用境界の直径は、典型的には、（開窓を定義するために何を確認するステートメントと開窓直径、NM 250）、開窓周波数（数個^/μm2）と空隙率（％） - 50との間。
2. ギャップが分析に含まれているかどうかを確認するステートメント、開窓直径肝臓、ブロック、イメージおよび穿孔の数の度数分布のグラフは、分析に含まれるべきです。

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結果

走査電子顕微鏡による低倍率での初期の可視化は、多くの大規模な肝血管および正弦波（ 図1A）を観察するのに十分な大き露出面積と肝臓試料の平らな面を明らかにする。実装スタブの正しい肝臓ブロック配置を確保することが、この理由（ 図1B）のために避けるべきである正弦波と肝臓のグリソン鞘の鮮明な画像を得るために必須です。倍率を大きくすると、肝臓...

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ディスカッション

正確かつ再現肝類洞内皮の状態を測定する能力は、これらの非常に特殊化した細胞の生物学を理解する上で重要なステップです。このような構造化照明顕微鏡³²などの新しい技術、原子間力顕微鏡³³とD-STORM（直接確率光学Reconstrucion顕微鏡^）34は、 インビトロでこれらの細胞の形態に関する重要な情報を付与しますが、SEMはにその構造を視覚化し、測定す?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% EM grade Glutaraldehyde	ProSciTech	C001	Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder	Sigma Aldrich	158127	Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder	Sigma Aldrich	C0250	Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016	Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide	ProSciTech	C011	Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute	Sigma Aldrich	459836	100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol	Labtech	EL5	Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	52619	Allow to reach room temperature before use
Cannulas	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape	ProSciTech	IA0201
Carbon Paint	ProSciTech	I003
Ketamine			Must be obtained under license
Xylazine			Must be obtained under license
Molecular Sieve	Sigma Aldrich	208647	Removes water from the 100 % Ethanol