Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

Resumo

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Resumo

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Introdução

As células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) são altamente diferenciadas, células endoteliais que revestem a parede da sinusóide hepática. LSECs são perfuradas com fenestrações que são não-diaphragmed, transcelular poros de 50-250 nm de diâmetro. Até 20% da superfície é coberta por LSECs fenestrações, que são geralmente em grupos de dezenas a centenas chamadas placas de peneira ^1-3 (Figura 1). Fenestrações permitir a transferência de plasma e nanosubstrates entre o sangue e hepatócitos, a criação de um sistema de ultrafiltração é altamente eficiente. Fenestrações são estruturas dinâmicas - tanto o seu tamanho e / ou o número pode ser alterado em resposta a vários estados fisiológicos, de drogas, e doença. Por exemplo, fenestrations são maiores no jejum do que no estado alimentado ^4; 2-di-iodoamphetamine aumenta número fenestration; ^5,6 e uma redução no tamanho e número de fenestrações por célula ocorre em envelhecimento e muitos estados doença ^13/7 . A medição precisa do tamanho e número de fenestrações é importante para a compreensão de como LSEC morfologia é influenciado por várias doenças, tóxicos e estados fisiológicos; o seu impacto sobre a função hepática; e para o desenvolvimento de moduladores fenestra�o intervenções terapêuticas ^1.

O estudo de fenestrações é difícil. O diâmetro das fenestrações se encontra abaixo da resolução da microscopia óptica convencional, de modo que anteriormente apenas a observação por microscopia de electrões, tanto em tecido do fígado ou cultivadas LSECs intactos tem sido possível. O microscópio eletrônico de varredura (SEM) tem sido mais frequentemente utilizado para estudar tamanho fenestration, a frequência ea porosidade (a percentagem de membrana LSEC que é perfurado por fenestrations) porque SEM permite a observação de grandes áreas de superfície endotelial e medição de milhares, se não dezenas de milhares de fenestrações. Apesar de sua utilidade, os resultados que são relatados a partir de estudos baseados SEM-paraLSEC parâmetros como o tamanho fenestra�o, número, frequência e a porosidade pode variar amplamente na literatura (Quadro 1).

Fenestrações e pratos perfurados são estruturas frágeis que contrato, quebram, dilatam ou se aglutinam durante a preparação de amostras, processamento, assim, o cuidado é necessário para preservar a sua integridade. A pressão de perfusão elevada ^14; osmolaridade incorreto do fixador e buffers ^15; fixação inadequada ou fixação do tempo; e velocidade de desidratação pós-fixação e secagem são todas as áreas de processamento para SEM que podem produzir produtos manufacturados que interferem com a preservação da ultraestrutura (Figura 2). Perda de fenestrações ('defenestration') e fenestra�o encolhimento pode ocorrer como resultado de má fixação, resultando na redução de diâmetro e porosidade fenestra�o célula. Métodos para melhorar a conservação de amostras para análise em MEV foram descritos anteriormente ^15-17 e será discutidoaqui com dicas adicionais sobre como melhorar a preservação da amostra. Os principais objectivos da preservação espécime são para remover o sangue dos sinusóides, de modo que a superfície do LSEC pode ser visualizado e para evitar danos ou LSEC de alta pressão ou fixação retardada. Perfusão do fígado inteiro de fixador através da veia portal é o método preferido para a fixação hepática. Tal como descrito em pormenor noutro ^16,18 perfusão deve ser efectuada a baixa pressão (por exemplo, 10 cm de H ₂ 0) para evitar artefactos relacionados com a pressão de perfusão e os danos para a LSEC, tipicamente manifestada como grandes lacunas dentro da membrana celular. No entanto, muitas vezes fixação razoável pode ser obtido utilizando a agulha de perfusão de biópsias de fígado de seres humanos e animais, tal como descrito em detalhe noutro local ^19. Esta técnica envolve a injeção diretamente fixador para o tecido até que o sangue é liberado para fora da amostra eo tecido é firme e fixo. Fixação de amostras para a microscopia de electrões tem de ser perfORMED tão rapidamente quanto possível a seguir à interrupção do fluxo de sangue para evitar alterações ultra-estruturais que ocorrem como resultado dos processos fígados autoliticas extremamente rápidas.

Nós também apresentamos um método de análise de imagem que minimiza a inclusão de artefactos, e padroniza a medição das fenestrações. Variação na seleção de senóides para micrografias, análise de imagens de artefatos, e medição de área celular para porosidade e fenestration frequência levaram a grandes discrepâncias nos resultados publicados. A abordagem padronizada de avaliação e medida de fenestrações e os requisitos mínimos para a apresentação dos dados não tenham sido claramente abordada na literatura anteriormente ^4,10,20-31.

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Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos que envolvam a utilização de animais são realizados de acordo com a legislação local. Nosso trabalho é aprovado pela Comissão Distrital de Saúde Bem-Estar Animal da Sydney Local. Os procedimentos autorizados estão descritas na documentação da licença do projeto e seguir as orientações que garantam o bem-estar do animal em todos os momentos. Assegurar o cumprimento da legislação sobre experimentação animal do país onde o trabalho é realizado.

1. Protocolo para Preparando EM Fixative

1. Para 100 ml de fixador, preparar paraformaldeído por adição de 2 g de paraformaldeído em pó a 25 ml de água destilada em um balão de Erlenmeyer de calor, a 65 ° C, agitando constantemente com um agitador magnético.
   NOTA: O glutaraldeído, paraformaldeído e tampão cacodilato de sódio são todas as substâncias perigosas e devem sempre ser manuseados em fumehood.
2. Aquece-se a 65 ºC durante 2 min, em seguida, deixa-se arrefecer. Se necessário, adicionar solução de hidróxido de sódio dropwise agitando para limpar solução completamente.
   NOTA: hidróxido de sódio é perigoso, manusear com cuidado.
3. Adicionar 10 ml de estoque de glutaraldeído grau EM, 50 ml de tampão de cacodilato de sódio 0,2 M e 2 g de sacarose e agita-se com um agitador magnético. Adicionar 2 ml de 1,0 M de _CaCl2.
4. Ajustar a pH 7,4 antes da solução até perfazer 100 ml com água destilada. O fixador final contém de 2,5% de glutaraldeído, paraformaldeído a 2%, 2 mmol _CaCl2, 2% de sacarose em tampão de cacodilato 0,1 M. Certifique-se de que a osmolaridade total é de 440 mOsmol / L. Use dentro de 24 horas de preparação.

2. Fixação de Perfusão do Fígado

1. Tampão de perfusão quente e fixador de 35-37 ºC. A temperatura correcta do tampão exsanguinação e fixador ajuda a assegurar a integridade do tecido.
2. Anestesiar o animal com uma injecção intraperitoneal única de 50 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina.
3. Uma vez que o animal está sobanestesia profunda, avaliada pela retirada da pata traseira e cauda pitada, uma incisão Y é feito com uma tesoura sem corte terminou em abdômen do animal para expor a veia hepática e portal.
   NOTA: Certifique-se de que o equipamento está limpo para evitar a contaminação das amostras com microorganismos e detritos geral que será facilmente visto em SEM.
4. Amarrar duas suturas muito soltas em torno da veia porta proximal para o fígado, o outro mais distalmente para o fígado.
5. Canular a veia porta com uma cânula de tamanho apropriado IV (18 G para ratos, 22 G para ratos) suturas .Aperte para garantir cânula.
6. Começar a perfusão com solução salina tamponada com fosfato aquecido a 37 ° C, e a uma pressão de 10 cm de H ₂ 0. Entre 5 e 20 ml de PBS, é geralmente necessária para desangrar o fígado.
   NOTA: Não para permitir que as bolhas de ar a entrar no fígado através dos tubos ligados à cânula, como eles induzem artefactos secundárias a embolização e pressão; Danos nos hepatócitos, sinusoids e fenestrações LSEC ocorre se a pressão de perfusão é demasiado elevada.
7. Cortar a veia cava abdominal e torácica para permitir que o tampão para sair livremente a partir do fígado. Isso evita danos alta contra-pressão para LSECs.
8. Uma vez que o fígado é livre de sangue, substitua com PBS EM fixador e perfundir durante aproximadamente 5 minutos, até que o fígado é endurecido e muito pálido.
9. Descontinuar a perfusão e cortar o fígado fixado em 1-2 ^mm3 blocos usando um bisturi afiado.
10. Tecido pós-fix em EM fixador para 24-72 horas a 4 ºC.
    NOTA: Em geral, underfixation causa mais artefatos do que com excessiva fixação.
11. Mudar fixador seguinte período pós-correção para tampão cacodilato de sódio 0,1 M para armazenamento a 4 ºC.
    NOTA: As amostras armazenadas desta forma será preservado por um período significativo de tempo (até 12 meses), a fixação secundária no entanto oportuno e exame é recomendado para melhores resultados.

3. Agulha Perfusion

NOTA: fixação da agulha é uma variante da fixação de perfusão que envolve a injecção de fixador directamente no tecido do fígado de biópsia. O objectivo é que o fixador para ser liberado através dos vasos sanguíneos, a fim de desangrar-los e expor todo o bloco de tecido para fixador. Cuidados devem ser tomados para manter a pressão de injecção de baixa pressão para evitar ferimentos ^18,19.

1. Remover um pequeno pedaço de fígado do animal ou objecto e enxaguar em solução salina para remover o sangue e detritos.
2. Desenhar a solução salina normal para a seringa equipada com uma agulha de calibre fino (tipicamente uma seringa de insulina).
3. Injectar a solução salina muito lentamente para o fígado até que o sangue é empurrado para fora do tecido. As injecções múltiplas pode ser necessária.
4. Desenhar o fixador EM de outra seringa equipada com uma agulha de calibre fino (tipicamente uma seringa de insulina).
5. Injectar o fixador muito lentamente para o fígado até que se torne difícil e tan na cor. Injecção múltiplas pode ser necessária.
6. Corte o fígado fixado em 1-2 ^mm3 blocos usando um bisturi afiado. Incubar em fixador EM para 24 - 72 h a 4 ° C. Lavar 3 vezes em tampão cacodilato de sódio 0,1 M antes de iniciar a fixação secundário.

4. Preparação para Microscopia Eletrônica de Varredura

1. Lavar amostra 3 vezes em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M. Para corrigir lipídios, pós fixar a amostra em 2% de tetróxido de ósmio em tampão cacodilato de sódio 0,1 M durante 2 h.
   NOTA: Completo de lavar roupa é muito importante como cross glutaraldeído e tetróxido de ósmio reagir e gerar artefatos em SEM.
2. Lavar as amostras em concentrações crescentes de etanol, para se iniciar a desidratação. Primeira lavagem em etanol a 50% durante 5 minutos; em seguida, 3 vezes durante 5 min com 70% de etanol; lavar três vezes durante 5 min com 90% de etanol; lavar duas vezes durante 5 min em etanol a 100%; e finalmente lavar duas vezes durante 10 min em etanol a 100% (crivo molecular).
3. Remover todo o etanol a partir das amostras e substituir com hexametildissilazano (HMDS) em fumehood e deixe por 10 min. Remover HMDS a partir das amostras de tecidos e deixa-se evaporar.
   NOTA: HMDS é altamente higroscópico quando frio, portanto, permitir atingir a TA antes de usar pela etapa final desidratação.
4. Opcionalmente, montar as amostras imediatamente ou colocá-los em um dessecador até que esteja pronto para montar para SEM.

5. Montagem

NOTA: montagem exemplar correto irá maximizar o número de sinusoids claramente delineados disponíveis para análise em MEV.

1. Rotular a base dos metais tocos SEM e aplicar fita de carbono condutora dupla face para o topo da tocos.
2. Visualizar amostras usando um microscópio de dissecação para identificar a superfície com as melhores sinusóides para subsequente SEM. Coloque a superfície para cima sobre a superfície da fita de carbono do topo.
3. Espécimes da vara firmemente ao topo, as amostras estão agora prontas para revestimento por pulverização.

ove_title "> 6. Revestimento

NOTA: O revestimento da peça com uma fina película de metal condutor (ouro ou platina) em um recinto sputter coater o modelo e protege contra danos provenientes de um feixe de elétrons. Se o revestimento é muito grosso estruturas de interesse pode ser obscurecida.

1. Coloque tocos na câmara de vácuo automática de revestidor por crepitação fina, para o modo de rotação e de revestimento por pulverização automático definido para 45 segundos. Use revestimento de platina para mais fino detalhamento, no entanto ouro também é adequado.
2. Aplicar uma fina camada de tinta de carbono para as superfícies externas das amostras de fígado montados, tomando cuidado para não revestir as superfícies sinusoidais.
3. Uma vez que as amostras são revestidas com platina e carbono tinta ter secado eles estão prontos para a observação sobre o SEM. As amostras podem ser armazenadas num exsicador.

7. Usando o Microscópio Eletrônico de Varredura

1. Lugar espécimes em microscópio eletrônico de varredura e microscópio para retornar vácuo.
2. Usando procedimentos operacionais padrão microscópio para visualização de espécimes dando início a uma ampliação baixa, aumentando gradualmente a ampliação.
3. Certifique-se o microscópio é ajustado apropriadamente para trabalhar a distância, tamanho de ponto e astigmatismo.
4. Verifique se há integridade fixação. Se o LSEC é na maior parte livre de lacunas e contém fenestrations medição 30-250 nm de diâmetro isso geralmente indicam que a preparação de amostras foi bem sucedida.
5. Se os sinusoids estão cheios de lacunas ou desprovido de fenestrações a preparação da amostra não foi bem sucedida ou se houver patologia significativa. Neste caso, cortar a amostra com uma lâmina de barbear muito fina, e as superfícies de corte recoberto e analisados ​​por sinusóides fixos com sucesso.
6. Em aproximadamente 15.000-20.000 × ampliação seleccionar LSEC superfícies planas que estão livres de detritos com boa fixação e onde as fenestrações são claramente visíveis (contendo tipicamente pelo menos 10 fenestrações).
7. Excepto imagens de pelo menos 10 por sinusóides do fígado, a partir de diferentes áreas dos blocos, utilizando, pelo menos, dois blocos por fígado. Amostragem 10 micrografias a 15.000 - 20.000 × ampliação por animal é geralmente suficiente para a quantificação de fenestrações para ser representativa de todo o fígado.

8. Análise

NOTA: O software ImageJ, que pode ser baixado gratuitamente a partir do NIH é utilizada para quantificar diâmetro fenestration e frequência ( www.imagej.nih.gov/ij ).

1. Abrir imagem J e definir a escala usando a barra de escala embutido na imagem (Screen shot 1).
2. Usando a ferramenta de polígono em ImageJ, traço em torno de toda a área plana do LSEC incluindo áreas fenestrados e defenestrado. Não basta traçar os pratos perfurados, pois isso vai falsamente inflacionar porosidade. Excluir qualquer grandes peças de detritos que estão na superfície celular, que pode ser obscurifenestrations GN.
3. Para medir o diâmetro fenestration, traçar uma linha através do maior diâmetro de cada fenestration selecionando a ferramenta de linha, e pressionar "m" para medir a linha, e "d" (empate) para desenhar de forma permanente a linha na imagem. Esta linha é definido como o diâmetro fenestra�o. O comprimento da linha de agora estará disponível na caixa de ImageJ de resultados (Screen shot 2).
4. Medir todos os espaços que são furos maiores no citoplasma LSEC superior a 250 nm, assim como fenestrações. As lacunas são muitas vezes artefatos que refletem má perfusão ou fixação, no entanto lacunas também pode ocorrer como resultado de uma doença e toxicidade. Os dados para as lacunas serão excluídos do cálculo dos parâmetros fenestration mais tarde na análise.
5. A área de lacunas que não são circulares deve ser calculada pelo traçado em torno das lacunas e calcular sua área em ImageJ.
6. Cole os dados da caixa de resultados em ImageJ em uma planilha do Excel para furtheanálise r.

9. Cálculos

1. Média fenestration diâmetro = média de todos os diâmetros fenestration (não incluindo as lacunas, onde as lacunas são ≥ 250 nm).
2. Área Fenestração = πr ^2, onde r, o raio, é calculado a partir do diâmetro fenestrações indivíduo (R = d / 2), não incluindo lacunas.
3. Porosidade (%) = (Σ (πr ²⁾ Área total analisado / - Σ (área de hiatos =)) ⁽² ^ M)) x 100.
4. Frequência Fenestration = número total de fenestrações / (área total analisado-Σ (área de lacunas) (mm ^2).

10. Apresentação de Dados Fenestration

NOTA: Sempre que possível, publicações, incluindo a quantificação de dados fenestration deve incluir as seguintes informações

1. Fenestration diâmetro, com uma declaração confirmando o que diâmetros de fronteira onde usado para definir fenestrations (tipicamenteentre 50-250 nm), Fenestração frequência (número / uM ²⁾ e a porosidade (%).
2. Uma indicação que confirma se lacunas foram incluídos na análise, gráfico de distribuição de frequências de diâmetro fenestra�o e o número de blocos, os fígados, imagens e fenestrações devem ser incluídos na análise.

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Resultados

Visualização inicial em baixa ampliação por microscopia eletrônica de varredura revela uma superfície plana da amostra do fígado com uma área exposta grande o suficiente para observar muitas grandes vasos hepáticos e sinusóides (Figura 1A). Assegurar a colocação de bloco de fígado correta na montagem stub é essencial para a obtenção de imagens claras dos sinusóides e cápsula do fígado do Glisson deve ser evitado por este motivo (Figura 1B). O aumento da ampliação pe...

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Discussão

A capacidade de medir de forma precisa e reprodutivelmente o estado do endotélio sinusoidal fígado é um passo importante na compreensão da biologia destas células altamente especializadas. Novas técnicas, como a microscopia de iluminação estruturada ^32, microscopia de força atômica e ³³ d-STORM (direto Stochastic Optical Reconstrucion Microscopia) ³⁴ irá transmitir informações importantes sobre a morfologia destas células in vitro, mas SEM continua a ser a principa...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% EM grade Glutaraldehyde	ProSciTech	C001	Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder	Sigma Aldrich	158127	Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder	Sigma Aldrich	C0250	Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016	Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide	ProSciTech	C011	Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute	Sigma Aldrich	459836	100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol	Labtech	EL5	Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	52619	Allow to reach room temperature before use
Cannulas	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape	ProSciTech	IA0201
Carbon Paint	ProSciTech	I003
Ketamine			Must be obtained under license
Xylazine			Must be obtained under license
Molecular Sieve	Sigma Aldrich	208647	Removes water from the 100 % Ethanol