Une méthode standardisée pour l'analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage

Résumé

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Résumé

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Introduction

Les cellules endotheliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) sont très différenciées des cellules endothéliales qui tapissent la paroi de la sinusoïde hépatique. LSECs sont perforées avec des fenestrations qui sont non diaphragmée, transcellulaire des pores de 50 à 250 nm de diamètre. Jusqu'à 20% de la surface de LSECs est couverte par fenestrations, qui sont habituellement en groupes de quelques dizaines à quelques centaines appelés plateaux perforés ^{1 à 3} (figure 1). Fenestrations permettent le transfert de plasma et nanosubstrates entre le sang et les hépatocytes, la création d'un système d'ultrafiltration est performant. Fenestrations sont des structures dynamiques - à la fois leur taille et / ou le numéro peuvent être modifiées en réponse à différents états physiologiques, les médicaments et la maladie. Par exemple, fenestrations sont plus grandes dans le jeun que dans l'état nourri ^4; 2-di-iodoamphétamine augmente numéro de fenestration; ^5,6 et une réduction de la taille et du nombre de fenestrations par cellule se produit au cours du vieillissement et de nombreux états pathologiques ^7-13 . La mesure précise de la taille et du nombre de fenestrations est important pour comprendre comment LSEC morphologie est influencé par diverses maladies, toxiques, et les états physiologiques; leur impact sur la fonction hépatique; et pour le développement de fenestration modulation des interventions thérapeutiques ^1.

L'étude de fenestrations est difficile. Le diamètre de fenestrations est inférieure à la résolution de la microscopie optique classique, de sorte que précédemment microscopie électronique d'observation en utilisant à la fois LSECs de tissus du foie ou de culture a été possible intactes. Le microscope électronique à balayage (MEB) a le plus souvent été utilisée pour étudier la taille de fenêtrage, de la fréquence et de la porosité (pourcentage de membrane LSEC qui est perforée par des fenestrations) car SEM permet l'observation de vastes zones de la surface de l'endothélium et la mesure des milliers, sinon des dizaines de milliers de fenestrations. Malgré son utilité, les résultats qui sont rapportés de SEM-basés pour des étudesLSEC paramètres tels que la taille de la fenestration, le nombre, la fréquence et la porosité varient largement dans la littérature (tableau 1).

Fenestrations et des plaques de tamis sont des structures fragiles de ce contrat, se brisent, se dilatent ou se unissent pendant la préparation de l'échantillon, le traitement ainsi minutieuse est nécessaire pour préserver leur intégrité. La pression de perfusion élevée ^14; osmolarité incorrecte du fixateur et tampons ^15; une mauvaise fixation ou la fixation du temps; et la vitesse de post-fixation déshydratation et séchage sont tous les domaines de la transformation des SEM qui peuvent produire des artefacts qui interfèrent avec la préservation de l'ultrastructure (Figure 2). La perte de fenestrations ('defenestration') et fenestration rétrécissement peut se produire à la suite d'une mauvaise fixation, ce qui entraîne diamètre réduit de fenêtrage et la porosité de la cellule. Méthodes pour améliorer la conservation des spécimens pour analyse SEM ont été décrits précédemment ^15-17 et seront discutésici avec des conseils supplémentaires sur la façon d'améliorer la conservation de l'échantillon. Les principaux objectifs de la préservation de l'échantillon sont pour enlever le sang des sinusoïdes de telle sorte que la surface de la LSEC peut être visualisé et pour éviter d'endommager LSEC soit de haute pression ou de la fixation retardée. Toute perfusion du foie de fixateur via la veine porte est la méthode préférée pour la fixation du foie. Comme décrit en détail ailleurs ^16,18 perfusion doit être effectué à basse pression (par exemple 10 cm de H ₂ 0) pour éviter les artefacts et les dommages liés à la pression de perfusion à l'LSEC, manifestent généralement que de grandes lacunes au sein de la membrane cellulaire. Toutefois, la fixation raisonnable peut souvent être obtenue en utilisant l'aiguille de perfusion biopsies du foie provenant d'humains et d'animaux, comme décrit en détail par ailleurs ^19. Cette technique consiste à injecter directement fixateur dans le tissu jusqu'à ce que le sang est évacuée de l'échantillon et le tissu est ferme et fixe. Fixation d'échantillons pour la microscopie électronique doit être perfOrmed aussi rapidement que possible après l'arrêt de la circulation sanguine pour éviter les changements ultrastructuraux survenant à la suite des foies des processus d'autolyse extrêmement rapides.

Nous présentons également une méthode d'analyse d'image qui réduit au minimum l'inclusion d'artefacts, et normalise la mesure de fenestrations. Variation dans la sélection des sinusoïdes pour microscopie, analyse d'images d'objets, et la mesure de la surface de la cellule pour la porosité et la fenestration fréquence ont conduit à des écarts importants dans les résultats publiés. Une approche normalisée pour l'évaluation et la mesure des fenestrations et les exigences minimales pour la présentation des données ne sont pas clairement abordée dans la littérature précédemment ^4,10,20-31.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures impliquant l'utilisation d'animaux sont réalisées conformément à la législation locale. Notre travail est approuvé par le Comité de santé du district Animal Welfare Sydney locale. Les procédures autorisées sont décrites dans la documentation de licence de projet et suivent des lignes directrices qui assurent le bien-être de l'animal en tout temps. Veiller au respect de la législation sur l'expérimentation animale du pays où le travail est effectué.

1. Protocole de préparation EM Fixative

1. Pour 100 ml de fixateur, préparer paraformaldéhyde en ajoutant 2 g de poudre de paraformaldéhyde à 25 ml d'eau distillée dans une fiole conique, la chaleur à 65 ° C, en remuant constamment avec un agitateur magnétique.
   NOTE: Glutaraldéhyde, le paraformaldéhyde et le tampon de cacodylate de sodium sont toutes les substances dangereuses et doivent toujours être manipulés dans hotte.
2. Chauffer à 65 ° C pendant 2 min puis laisser refroidir. Si nécessaire, ajouter la solution d'hydroxyde de sodium dropwise en remuant pour effacer solution complètement.
   NOTE: l'hydroxyde de sodium est dangereux, manipuler avec précaution.
3. Ajouter 10 ml de grade EM stocks glutaraldéhyde, 50 ml de tampon de cacodylate de sodium 0,2 M et 2 g de saccharose et remuer avec agitateur magnétique. Ajouter 2 ml de 1,0 M CaCl _2.
4. Ajuster à pH 7,4 avant de procéder à la solution jusqu'à 100 ml avec de l'eau distillée. Le fixateur final contient 2,5% de glutaraldéhyde, 2% de paraformaldehyde, 2 mmol CaCl _2, 2% de saccharose dans du tampon 0,1 M de cacodylate. Assurez-vous que l'osmolalité totale est de 440 mOsmol / L. Utiliser dans les 24 heures de préparation.

2. Fixation de perfusion hépatique

1. Tampon de perfusion chaud et fixatif à 35-37 ºC. La température correcte du tampon de exsanguination et fixateur aide à assurer l'intégrité des tissus.
2. Anesthésier l'animal avec une seule injection intraperitoneale de 50 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine.
3. Une fois que l'animal est en coursanesthésie profonde, évaluée par le retrait des membres postérieurs et pincement de la queue, une incision est faite avec Y contondants terminé ciseaux dans l'abdomen de l'animal pour exposer le foie et la veine porte.
   NOTE: Assurez-vous que le matériel est propre pour éviter la contamination des échantillons avec des micro-organismes et les débris générale qui seront facilement visibles sur SEM.
4. Attachez deux sutures très lâches autour de la veine porte une proximale pour le foie, l'autre plus distale pour le foie.
5. Cathétériser la veine porte avec une canule IV de taille appropriée (18 G pour les rats, 22 G pour les souris) sutures .Tighten pour garantir canule.
6. Commencer la perfusion avec une solution saline tamponnée au phosphate chauffé à 37 ° C, et sous une pression de 10 cm de H ₂ 0. Entre 5 et 20 ml de PBS sont habituellement exigés pour être exsangue le foie.
   REMARQUE: Ne pas permettre à des bulles d'air d'entrer dans le foie par les tubes reliés à la canule car ils induisent des artéfacts secondaires pour embolisation et de la pression; Dommages aux hépatocytes, sinusoids et fenestrations LSEC produit si la pression de perfusion est trop élevé.
7. Sectionner la veine cave abdominale et thoracique pour permettre au tampon pour sortir librement du foie. Ceci empêche des dommages haute-pression à LSECs.
8. Une fois que le foie est libre de sang, remplacer PBS avec EM fixateur et perfuser pendant environ 5 minutes, jusqu'à ce que le foie est durci et très pâle.
9. Cesser la perfusion et de couper le foie fixe dans 1 - 2 mm ³ blocs à l'aide d'un scalpel.
10. Tissus post-correctif dans EM fixatif pour les 24 - 72 h à 4 ºC.
    NOTE: En général, underfixation provoque plus que des objets overfixation.
11. Changer fixateur après la période post-correctif à sodium 0,1 M tampon cacodylate pour le stockage à 4 ºC.
    NOTE: Les échantillons stockés de cette manière seront conservés pour une période de temps significative (jusqu'à 12 mois), fixation secondaire mais en temps opportun et de l'examen est recommandé pour de meilleurs résultats.

3. Aiguille Perfusion

REMARQUE: fixation d'aiguille est une variante de fixation qui implique la perfusion de fixateur injection directement dans le tissu de biopsie du foie. L'objectif est de fixateur pour être rincée à travers les vaisseaux sanguins afin de les exposer toutes être exsangue et du bloc de tissu de fixateur. Des précautions doivent être prises pour maintenir la pression d'injection faible pour éviter les blessures de pression ^18,19.

1. Retirer un petit morceau de foie de l'animal ou de l'objet et rincer dans une solution saline pour éliminer le sang et les débris.
2. Dessiner la solution saline normale dans la seringue munie d'une aiguille de petit calibre (typiquement une seringue d'insuline).
3. Injecter la solution saline très lentement dans le foie jusqu'à ce que le sang est évacuée du tissu. Des injections multiples peuvent être nécessaires.
4. Dessinez le fixateur EM dans une autre seringue munie d'une aiguille de petit calibre (typiquement une seringue d'insuline).
5. Injecter le fixateur très lentement dans le foie jusqu'à ce qu'il devienne dur et de couleur beige. Injection multiples peut être nécessaire.
6. Couper le foie fixe dans 1 - 2 mm ³ blocs en utilisant un scalpel. Incuber dans EM fixatif pour les 24 - 72 h à 4 ° C. Laver 3 fois dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M avant le début de la fixation secondaire.

4. Préparation de la microscopie électronique à balayage

1. Laver échantillon 3 fois dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M. Pour fixer les lipides, après fixer l'échantillon dans 2% de tétroxyde d'osmium dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M pendant 2 heures.
   NOTE: Complete lavage est très important que croix glutaraldéhyde et tétroxyde d'osmium réagissent et génèrent des artefacts sur SEM.
2. Rincer les échantillons à des concentrations croissantes d'éthanol, à commencer la déshydratation. Rincer d'abord dans de l'éthanol à 50% pendant 5 minutes; puis 3 fois pendant 5 min avec 70% d'éthanol; rinçage trois fois pendant 5 min avec 90% d'éthanol; rincer deux fois pendant 5 min dans 100% d'éthanol; et enfin rincer deux fois pendant 10 minutes dans 100% d'éthanol (tamis moléculaire).
3. Retirez tout l'éthanol à partir des échantillons et le remplacer par de l'hexaméthyldisilazane (HMDS) en hotte et laisser reposer 10 min. Retirer HMDS à partir des échantillons de tissu et laisser évaporer.
   NOTE: HMDS est fortement hygroscopique froid donc permettre d'atteindre RT avant de l'utiliser pour l'étape finale de déshydratation.
4. Eventuellement, monter immédiatement les échantillons ou les placer dans un dessiccateur jusqu'au moment de monter pour la SEM.

5. Montage

NOTE: montage correct de l'échantillon sera de maximiser le nombre de sinusoïdes clairement délimitées disponibles pour l'analyse sous SEM.

1. Étiqueter la base des moignons métalliques SEM et appliquer du ruban double face conductrice carbone haut de la moignons.
2. Visualiser les échantillons en utilisant un microscope à dissection pour déterminer la surface avec les meilleurs pour les sinusoïdes SEM ultérieure. Placer cette surface vers le haut sur la surface du ruban de carbone du moignon.
3. spécimens de tenir fermement le talon, les échantillons sont maintenant prêts pour revêtement par pulvérisation.

ove_title "> 6. Revêtement

NOTE: Le revêtement des spécimen avec une fine pellicule de métal conducteur (or ou de platine) dans un Pulvérisateur cathodique motifs de l'échantillon et le protège des dommages causés par le faisceau d'électrons. Si le revêtement est trop épais structures d'intérêt peuvent être obscurcies.

1. La place talons dans la chambre à vide de pulvérisation coucheuse automatique amende, le mode à la rotation et de revêtement par pulvérisation automatique fixés pour 45 sec. Utilisation revêtement de platine pour des détails plus fins, mais l'or est également approprié.
2. Appliquez une fine couche de peinture de carbone sur les surfaces extérieures des échantillons de foie montés, en prenant soin de ne pas revêtir les surfaces sinusoïdales.
3. Une fois que les échantillons sont revêtus avec du platine et de la peinture de carbone a séché ce qu'ils soient prêts pour l'observation sur le SEM. Les échantillons peuvent être stockés dans un dessiccateur.

7. Utilisation du microscope électronique à balayage

1. Placer les échantillons dans un microscope électronique à balayage et retrouver le microscope à vide.
2. En utilisant des procédures d'exploitation de microscope standard pour la visualisation des spécimens en commençant à un faible grossissement, en augmentant progressivement grossissement.
3. Vérifiez que le microscope est ajusté de façon appropriée pour travailler la distance, la taille du spot et l'astigmatisme.
4. Vérifier l'intégrité de fixation. Si le LSEC est surtout exempt de lacunes et contient fenestrations de mesure de 30 à 250 nm de diamètre ce indiquerait généralement que la préparation des échantillons a été couronnée de succès.
5. Si les sinusoïdes sont pleines de lacunes ou dépourvu de fenestrations la préparation de l'échantillon n'a pas été couronnée de succès ou il ya pathologie importante. Dans ce cas, couper l'échantillon avec une lame de rasoir très fine, et les surfaces de coupe retraitées comme et analysés pour sinusoïdes fixes succès.
6. À environ 15.000-20.000 grossissement sélectionner surfaces LSEC plats qui sont exempts de débris avec une bonne fixation et où les fenestrations sont clairement visibles (typiquement contenant au moins 10 fenestrations).
7. Enregistrer des images d'au moins 10 sinusoïdes par le foie, à partir de différentes zones des blocs, en utilisant au moins deux blocs par le foie. Échantillonnage 10 micrographies à 15.000 - 20.000 grossissement par animal est généralement suffisante pour la quantification des fenestrations soit représentatif de l'ensemble du foie.

8. Analyse

REMARQUE: Le logiciel ImageJ qui peut être téléchargé gratuitement à partir du NIH est utilisé pour quantifier le diamètre de la fenestration et la fréquence ( www.imagej.nih.gov/ij ).

1. Ouvrir une image J et définir l'échelle en utilisant la barre d'échelle intégrée dans l'image (Capture d'écran 1).
2. Utilisation de l'outil de polygone dans ImageJ, trace autour de l'ensemble de la surface plane de la LSEC y compris les zones fenêtrées et défenestré. Ne vous contentez pas de retracer les plaques de tamis comme cela faussement gonfler porosité. Éliminer les gros morceaux de débris qui se trouvent sur la surface des cellules qui peuvent être obscurifenestrations Ng.
3. Pour mesurer le diamètre de la fenestration, tracer une ligne à travers le plus grand diamètre de chaque fenestration en sélectionnant l'outil de ligne, et appuyez sur "m" pour mesurer la ligne, et "d" (tirer) pour dessiner la ligne de façon permanente sur l'image. Cette ligne est définie comme le diamètre de la fenestration. La longueur de la ligne sera désormais disponible dans la zone de résultats de ImageJ (Capture d'écran 2).
4. Mesurer toutes les lacunes qui sont plus grands trous dans le cytoplasme LSEC plus de 250 nm, ainsi que des fenestrations. Les lacunes sont souvent objets reflétant une mauvaise perfusion ou la fixation, cependant lacunes peuvent également survenir à la suite de la maladie et la toxicité. Les données pour les lacunes sera exclu du calcul des paramètres de fenêtrage plus tard dans l'analyse.
5. La zone des lacunes qui ne sont pas circulaire devrait être calculée en traçant autour des lacunes et calculer leur surface sur ImageJ.
6. Collez les données de la boîte de résultats dans ImageJ dans un tableur Excel pour furtheanalyse de r.

9. Calculs

1. Fenestration diamètre moyen = moyenne de tous les diamètres de fenêtrage (non compris les lacunes, dont les lacunes sont ≥ 250 nm).
2. Zone de fenêtrage = πr ² où r, le rayon, est calculée à partir de l'individu fenestrations diamètre (r = d / 2), à l'exclusion des lacunes.
3. Porosité (%) = (Σ (πr ²⁾ / superficie totale analysée - Σ (zone de lacunes =)) (pm ²⁾⁾ x 100.
4. Fenestration fréquence = nombre total de fenestrations / (superficie totale analysée-Σ (domaine de lacunes) (pm ^2).

10. Présentation des données Fenestration

NOTE: Chaque fois que possible, des publications, y compris la quantification des données de fenêtrage doivent inclure les informations suivantes

1. Fenestration diamètre, avec une déclaration confirmant ce diamètres limites où utilisé pour définir fenestrations (typiquemententre 50 à 250 nm), la fréquence Fenestration (nombre / um ²⁾ et la porosité (%).
2. Une déclaration confirmant que des lacunes ont été inclus dans l'analyse, la distribution de fréquence graphique de diamètre de la fenestration et le nombre de foies, des blocs, des images et des fenestrations devrait être inclus dans l'analyse.

Résultats

La visualisation initiale à faible grossissement par microscopie électronique à balayage révèle une surface plane de l'échantillon de foie avec une zone exposée assez grand pour observer de nombreux grands vaisseaux du foie et des sinusoïdes (figure 1A). Assurer le placement de bloc de foie correcte sur le talon de montage est essentiel pour obtenir des images claires des sinusoïdes et la capsule de Glisson du foie devraient être évités pour cette raison (figure 1B). L&#...

Discussion

La capacité de mesurer de façon précise et reproductible l'état du foie endothélium sinusoïdal est une étape importante dans la compréhension de la biologie de ces cellules hautement spécialisées. De nouvelles techniques telles que la microscopie d'éclairage structuré ^32, microscopie à force atomique ³³ et d-STORM (directe stochastique optique reconstrucion Microscopy) ³⁴ seront de communiquer des informations importantes concernant la morphologie de ces cellules...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of material	Company	Catalogue Number	Comments
EM grade Glutaraldehyde	ProSciTech	C001	Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder	Sigma Aldrich	158127	Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder	Sigma Aldrich	C0250	Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016	Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide	ProSciTech	C011	Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute	Sigma Aldrich	459836	100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol	Labtech	EL5	Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	52619	Allow to reach room temperature before use
Cannulas	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape	ProSciTech	IA0201
Carbon Paint	ProSciTech	I003
Ketamine			Must be optained under licence
Xylazine			Must be obtained under licence
Molecular Sieve	Sigma Aldrich	208647	Removes water from the 100 % Ethanol