הנדסת ג'ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Summary

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Abstract

חומרים סינטטיים ידועים ליזום סיבוכים קליניים כגון דלקת, היצרות, וזיהומים כאשר מושתלים כתחליף כלי דם. קולגן כבר בשימוש נרחב למגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים, והוא נחשב אלטרנטיבה חוקית לחומרים סינטטיים בשל ההתאמה הביולוגית הטבועה בו (כלומר, antigenicity הנמוך, דלקת, ותגובות רעילות לתאים). עם זאת, התכונות מכאניות מוגבלות ויד-היכולת הנמוכה הקשורות של ג'ל קולגן שהקשו על השימוש בם כחומרי פיגום להנדסת רקמות וכלי דם. לכן, את הרציונל מאחורי עבודה זו היה ראשון להנדס ג'ל קולגן cellularized לגיאומטריה בצורת צינור והשני כדי לשפר את תאי שריר חלק הארגון מחדש של מטריצה ​​מונע קולגן כדי להשיג רקמות נוקשה מספיק כדי להיות מטופלים.

האסטרטגיה שתוארה כאן מבוססת על ההרכבה הישירה של קולגן ותאי שריר חלק (לבנות) בcyli 3Dגיאומטריה ndrical עם השימוש בטכניקת דפוס. תהליך זה דורש תקופת התבגרות, שבמהלכו בונה בתרבית bioreactor בתנאי סטטי (ללא אילוצים מכאניים דינמיים חיצוניים שימושיים) במשך שבועות 1 או 2. "Bioreactor סטטי" מספק סביבה מנוטרת ומבוקרת סטרילי (pH, טמפרטורה, חילוף גזים, אספקת חומרי מזון ופינוי פסולות) לבונה. במהלך תקופת התרבות, מדידות עובי בוצעו על מנת להעריך את שיפוץ מונע תאים של מטריצת קולגן, וצריכה וייצור חומצת החלב שיעורי גלוקוז נמדדו כדי לפקח על תאי פעילות המטבולית. לבסוף, תכונות מכאניות וviscoelastic הוערכו למבנים צינוריים וכתוצאה מכך. לשם כך, פרוטוקולים ספציפיים וידע ממוקד (מניפולציה, מרתק, עובד בסביבת התייבשות, וכן הלאה) פותחו כדי לאפיין את הרקמות מהונדסות.

Introduction

הנדסת רקמות כלי דם חוזה אסטרטגיות שונות שמטרת הייצור של כלי מהונדסים, כוללים שתלים מבוססים על פיגומים סינטטיים, כלי דם רקמות מהונדסות מבוסס גיליון תא (TEBVs), ומטריצה ​​תאית (ECM) TEBVs מבוסס רכיבים. בין גישות אלה, פולימרים סינטטיים תערוכה תכונות מכאניות טובות, אבל חולקים חסרון משותף כפי שהם חסרי פעילות ביולוגית ^1. השיטה מבוססת גיליון תא מאפשרת הייצור של תחליפי כלי דם מהונדסים עם תכונות מכאניות גבוהות, אבל את הזמן הנדרש כדי לייצר שתלים כזה הוא כ -28 שבועות ^2. biopolymers הטבעי של ECM, כגון קולגן, אלסטין, הפיברין ³ או שילוב שלהם, יישאר חומרי תקן זהב עבור פיגומים להנדסת רקמות. זה בעיקר מהסיבה שחומרים אלה יש התאמה ביולוגית טובה בדרך כלל בעת היותו מסוגל לגרום לתגובות הסלולר תפקודיות ^4-5. בין אלה biopolymerים, סוג אני קולגן הוא אחד של חלבון עומס הרב והבולט ביותר של ECM ברקמות רבות כגון עור, כלי דם וגידים. עבודה נרחבת נערכה על התכונות מכאניות של קולגן ^6-8, אבל יש כבר כמה מחקרים רק על שיפוץ סלולארי של ג'ל קולגן במהלך התבגרות סטטי. שיפוץ סלולרי מתייחס לשינויים המבניים של מטריצת קולגן הנגרמת על ידי תאים שיכולים להשפיע על היציבות של סיבי קולגן הרשת ^9. כפיגום טבעי, כמויות גדולות היחסי של הסוג אני קולגן יכולות להיות מבודדות, מעוקרות ומאוחסנות ממקורות כגון גידי עכברוש זנב ¹⁰ שונים. הבנת אינטראקציות הסלולר עם קולגן והתנהגויות מכאניות כללית בנושא של פיגומי cellularized קולגן (בונה) היא צעד חיוני לבניית רקמות. יכול להיות מעובד TEBVs מבוסס קולגן על ידי ישירות ערבוב תאים עם קולגןבמהלך הכנת ג'ל ומעוצבת נוסף לצורות ספציפיות כגון צינורי ומישוריים ^11. תאי כלי דם בתוך ג'לי להתרבות וסוג לשפץ אני קולגן ^12. לכן, שיטה זו עוקפת את הצורך בmacroporosity הספציפי שמייצג את אחד מהנושאים המשמעותיים בפיתוח של פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות. עם זאת, החסרונות העיקריים של ג'ל קולגן הם התכונות מכאניות שלהם נמוכות בהשוואה לחומרים סינטטיים ^13.

במחקר זה, רקמת קיימא עם חלוקה הומוגנית של תאים תוכננה על ידי ערבוב ישיר של קולגן עם תאים בתהליך צעד אחד. "Bioreactors סטטי" שימש לשבועות 1 או 2 של התבגרות סטטי של ג'ל קולגן cellularized (ללא אילוצים מכאניים דינמיים חיצוניים מיושמים). במהלך התרבות, שיפוץ מטריצת קולגן התרחש, ובכך לספק מיגון למבנים. יתר על כן, מבנים אלה היו ready שיועבר למסתובב קיר bioreactor והאנדותל הומוגנית הושג. בנוסף, בעבודה זו בפרוטוקול בדיקות מכאני ספציפי גם הציע לספק גישה חדשנית מתאימה באפיון התכונות מכאניות של רקמות רכות צינורי.

לסיכום, עבודה זו מציגה שיטה לייצור המהיר במבחנה וההתבגרות של רקמות וכלי דם, כי הם חזקים מספיק כדי להיות מטופלים לא רק לאפיונים ביולוגיים ומכאניים, אלא גם לאוויר נוסף מכאני בbioreactor דינמי, הנחשב לקריטי צעד בהתחדשות של רקמות.

Protocol

1. ייצור והרכבה של bioreactor סטטי

1. המצאה של המאגר
   1. הכן 50 מיליליטר צינורות צנטריפוגה כמאגר מדיום התרבות לbioreactor.
   2. לעשות שתי יציאות על ידי קידוח שני חורים בקטרים ​​5 מ"מ על 20 מ"מ מהתחתית והחלק העליון של המאגר, בהתאמה. לאחר מכן הכנס שני אבזרי luer בצינורות סיליקון אורך 5 מ"מ. קיבוע אבזרי luer אלה דרך חורים, ולאטום את כל קשרים עם דבק סיליקון כיתה רפואית.
   3. הכנס מסנן 0.22 מיקרומטר ליציאה העליונה של המאגר (איור 1 א).
   4. הכנס מחץ luer ליציאה התחתונה של המאגר (איור 1 א).
2. עצרת mandrel כובע
   1. לקדוח חור בקוטר 4.5 מ"מ במרכז הכובע מאוורר של צינור המאגר מבלי לפגוע בקרום המסנן המכסה את חורי האוורור.
   2. הכן בר מערבבים (קוטר = 4.5 מ"מ, אורך = 100 מ"מ) כmandrel למבנה.
   3. הכן שני פקקי סיליקון חרוטי (אורך = 10 מ"מ, קוטר חור באמצע = 4.5 מ"מ).
   4. להרכיב את mandrel והכובע (מורכב mandrel הכובע) כמתואר באיור 1.
      1. קיבוע mandrel לתוך החור. הכנס את 2 פקקים מעל mandrel כך שהכובע מצויד ביניהם. להתאים את המיקום של mandrel כך שאורכו שימושי הוא 78 מ"מ.
      2. החל פריימר ולאחר מכן דבק סיליקון כיתה רפואית למשטחים שיהיו במגע לפני שהצטרפו לכובע ופקקי סיליקון חרוטי יחד. הסר את הדבק העודף על הכובע.
   5. תן לו להתייבש בטמפרטורת חדר למשך 1-3 ימים.
3. המצאה של גזה-אוחז
   1. הכן 3 צינורות סיליקון (צינור 1: קוטר פנימי = 6.4 מ"מ, אורך = 5 מ"מ; צינור 2: קוטר = 6.4 מ"מ, אורך = 10 מ"מ, וצינור 3: קוטר = 3.1 מ"מ, אורך = 12 מ"מ).
   2. להרכיב את הגזה-אוחז כלתארד באיור 1 ג.
      1. צינור Cut 1 לאורך זמן, ולפתוח אותו על צינור 2. היצמד אותם יחד עם דבק סיליקון.
      2. חותך גזה סטרילי כירורגי 5 סנטימטרים x 7 גיליון סנטימטר, ואז לגלגל בחוזקה הגזה מעל הצינור 3 בצד הארוך של הגזה. הכנס את 1-צינור 2 מורכב צינור על הגזה.
      3. להוסיף דבק סיליקון להישאר ביחד הגזה, מורכב צינור 1 צינור 2 וCut צינור 3. הגזה באורך של 8 מ"מ.
4. הרכבה ועיקור
   1. להרכיב מורכב mandrel-כובע והגזה-האחיזה, כמתואר באיור 2.
      1. מעיל mandrel עם גריז כיתה רפואי (איור 2 א). מניחים את הגזה להתמודד על mandrel (איור 2). מרחק אוחז בשווי קבוע של 35 מ"מ אחד מהשני.
      2. הכן עובש צינור על ידי הסרת החלק התחתון של מזרק 10 מיליליטר באמצעות מסור שולחן (אורך = 8 מ"מ סופי) ( איור 2).
   2. הכנס את התבנית על ההרכבה מצוידת להתמודד-הגזה mandrel הכובע (מורכב דיור עובש), העובש על פקק סיליקון (איור 2 ג) הולם הצמד.
   3. החיטוי המאגר ומורכב דיור-עובש.
      הערה: היזהר להחזיק בפקק סיליקון בחוזקה בעת הכנסת העובש כדי למנוע הניתוק שלה.

בונה וסטטי התבגרות מבוססות ג'ל קולגן 2. תאי שריר חלק הנדסה

1. בונת הנדסה
   1. להרחיב תאים חזירי אב העורקים שריר חלק (pSMCs) ב175 סנטימטר ² צלוחיות תרבות מלאות 20 מיליליטר של מדיום התרבות השלמה המורכב מהנשר בינוני השתנה Dulbecco בתוספת 10% (V / V) בסרום חזירי (PS), 10% (V / V ) בסרום שור עוברי (FBS), 1% (V / V) פניצילין, סטרפטומיצין (עט-דלקת).
   2. ב≈90 מפגש%, לנתק pSMCs (מעבר 2-4) על ידי הסרת מדיום התרבות מבקבוק של pSMCs, הוסיף 5 מיליליטר של תמיסת טריפסין (1x בפתרון פוספט שנאגרו מלוח, PBS), ודוגר במשך 10 דקות (ט = 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 100% לחות).
   3. Resuspend pSMCs בריכוז של 4 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר במדיום התרבות השלם.
   4. הכן פתרון קולגן כמתואר ¹⁰ בעבר.
      1. לחלץ ולאסוף חבילות קולגן מגידי עכברוש זנב בפתרון PBS.
      2. העבר את סיבי הקולגן בהמשך לאצטון (5 דקות), 70% isopropanol (V / V) (5 דקות) וחומצה אצטית (0.02 N, 48 שעות, 4 ° C) פתרונות.
      3. למזג את הפתרון צמיג והקפאה ב -20 ° C במשך 3 ימים.
      4. Lyophilize הפתרון הקפוא להשיג ספוגים קולגן.
      5. Solubilize ספוגים קולגן לפתרון חומצה אצטית (0.02 N) בריכוז של 4 גרם / L וצנטריפוגות ב 29581 כוח גרם במשך 45 דקות.
      6. לעקר את פתרון קולגן באמצעות תהליך דיאליזה נגד של שלאחר מכןolutions של חומצה אצטית (0.02 N, 1 שעה), כלורופורם 1% (V / V, 1 שעה) וחומצה אצטית (0.02 N פתרון, סטרילי שונה בכל 2 ימים בשבוע 1).
      7. לאסוף את פתרון קולגן סטרילי (4 g / L) במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים.
   5. הכן ג'ל קולגן cellularized כפי שמוצג באיור 3.
      1. הכן 50 מיליליטר של תמיסת חיץ סטריליים על ידי ערבוב 35 מיליליטר של DMEM (5x), 4 מיליליטר של HEPES (1 N), 3 מיליליטר של NaOH (1 N) ב 8 מיליליטר של מים ללא יונים סטרילי.
      2. הכן תאים ותערובת ג'ל קולגן במכל ממוקם בקרח על ידי ערבוב של 50% (V / V) של פתרון קולגן סטרילי (4 g / L של חומצה אצטית 0.02 N) עם 25% (V / V) של פתרון חיץ ו -25% (V / V) של ההשעיה של pSMCs במדיום התרבות השלם.
   6. מדוד את ה- pH של התערובת ולהבטיח שזה בין 7.0 ו -7.4.
   7. יוצקים בעדינות 9 מיליליטר של תערובת תאים-ו- קולגן לדיור המורכב שהוזכר לעיל / עובש (שלב 1.4.3, איור 3A-B ).
   8. תן לו להגליד בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 מתחת למכסת מנוע תרבית תאים (איור 3).
2. התבגרות בסטטי bioreactor
   1. להסיר את התבנית (איור 3 ג) ולהעביר בזהירות את המבנה למאגר, המכיל 35 מיליליטר של מדיום התרבות (איור 3D).
   2. דגירה המבנה (C T = 37 מעלות, 5% CO _2, 100% לחות) במצב אנכי לשבועות 1 או 2 של התבגרות סטטי.
   3. התקן מצלמת אינטרנט (אטומה כדי להבטיח בידוד) בתוך האינקובטור מול המבנה.
   4. לשנות את מדיום התרבות כל 2 ימים על ידי aspirating הבינוני הישנה מנמל מחץ luer מחדש מילוי המאגר עם כמות שווה של מדיום תרבות הטרי.
3. מדידה של העובי ומטבולית פעילות של SMCs-קולגן בונה במהלך סטטי תרבות ג'ל מבוסס
   1. מניחים את interferometer לייזר הסריקה לcultu התאמחדש מכסה המנוע ולהעיף אותו מהמצב האנכי למצב האופקי באמצעות פלס.
   2. העבר את bioreactor למכסה מנוע תרבית תאים ולהסיר את המבנה מהמאגר.
   3. העבר את המבנה (עדיין רכוב על mandrel) למסלול של קרן הלייזר, ולמקם אותו בקפדנות orthogonally ביחס לציר האלומה (כפי שמוצג באיור 4).
   4. קראו את הערך מוצג על המסך של interferometer לייזר הסריקה, מקביל לקוטר החיצוני של המבנה.
   5. לחשב את עובי הקיר של המבנה המבוסס על הקוטר החיצוני והפנימי שלה (כלומר קוטר mandrel).
      הערה: חזור על השלבים 2.3.1 ל2.3.5 כל שעה לשעת 12 הראשונה ולאחר מכן בכל שעה 24.
   6. השתמש 1 מיליליטר של מדיום התרבות הישן (שנדגמו בעת שינוי מדיום התרבות, צעד 2.2.4) למדידת ריכוזי חומצת החלב וסוכר בעם מנתח גז דם.
   7. השתמש 1 מיליליטר שלמדיום תרבות טרי כרמת בסיס למדידות ריכוזי גלוקוז וחומצת החלב ^14.
      הערה: חזור על השלבים 2.3.6 ו2.3.7 כל 2 ימים לאחר שינוי התרבות בינוני.
4. לבנות קציר לCcharacterizations מכאני והביולוגי נוסף
   1. אחרי שבועות 1 או 2 של תקופת התבגרות סטטי, להעביר את bioreactor סטטי למכסה מנוע תרבית תאים.
   2. העבר בעדינות המבנה הבוגר מmandrel (נוסף וידאו 1) לצלחת פטרי 100 מ"מ קוטר המכילה 40 מיליליטר של מדיום תרבות הטרי (איור 5 ואיור 7 א).

3. מכאני אפיון של המבנים באורך וכיוונים היקפיים

1. התקן את ניסיוני ההגדרה המורכבת ממייקרו-המכאני הבוחן מצויד בתא עומס 5 או 10 N ואמבט המכיל PBS על 37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על הדגימותתנאים לא פסאודו-פיסיולוגי (איור 6).
2. לאזן את תא העומס וextensometer.
   הערה: איזון הוא פונקציה המשולבת בבוחן מייקרו-המכאני המורכב באיפוס ערך ההארכה מוצג וערך העומס מוצג בעת לא מדגם הוא רכוב על מכונת. פונקציה זו מאפשרת הגדרת ההתייחסות לשתי המדידות.
3. התקנת המבנים צינוריים על המנגנון המכני: כיוון אורך.
   הערה: בצע בדיקות עייפות אורך ישירות על המבנים צינוריים כולו. השתמש ב- בנה את בית מכשירים מרתקים להתחבר להתמודד הגזה של המבנים לתא העומס ולבסיס של האמבטיה PBS.
   1. הר צינורי לבנות על המכשירים מרתקים (איור 7), בעקבות הליך הקציר (סעיף 2.4).
   2. לעטוף את המכשירים מרתקים ואוחז הגזה יחד עם קלטת טפלון למניעת החלקה של כל אוחז הגזה במהלך הבדיקה.הר המדגם על בוחן מייקרו-המכאני (איור 7 ג).
4. התקנת המבנים בצורת הטבעת על המנגנון המכני: כיוון היקפי.
   הערה: בצע בדיקות עייפות היקפיות על דגימות בצורת טבעת מחולקים מהמבנים צינוריים. השתמש בשתי מוטות פלדת אל-חלד כאוחז להחזיק דגימות.
   1. הר צינורי לבנות על צינור פלסטיק כתמיכה מסומנת עם 5 פערי מ"מ (איור 7), לאחר הקציר (סעיף 2.4).
   2. חותך 10 מ"מ טבעות מהמבנה צינורי.
   3. מדוד את האורך של הדגימה באמצעות קליפר ורניה לניתוחים נוספים.
   4. הר הדגימה בצורת הטבעת על פסי נירוסטה של בוחן מייקרו-המכאני (איור 7 ג). הקפד למקם את הדגימה במרכז הסורגים.
      הערה: צינור הפלסטיק במערכת חיתוך הצעד 3.4.1 וכפי שמוצג באיור 7 משמש כדי למנוע נזק למבנה במהלך חיתוך.
5. בדיקת עייפות על מבנים בכיוון האורך או היקפי.
   1. למתוח את המבנה לאורך מד הראשוני שלה.
   2. לשמור על המבנה בתפקיד זה במשך 10 דקות בסביבה מדומה פיזיולוגית.
   3. החל 10% מתח מחזורי של האורך הראשוני מד (30 מחזורים) למבנה של 5% שיעור מתח / sec.
   4. חזור על שלב 3.5.3 בצעדים מצטברים של 10% מתח מחזורי עד כישלון של המדגם.
      הערה: השימוש בסביבה מדומה פיזיולוגית דורשת לקחת בחשבון את הציפה והאינרציה של המערכת מרתקת המשפיעות על המדידה של העומס המופעל.
   5. רשום את הרקע כדלקמן:
      1. להזיז את מסגרת העומס לאורך מד הראשוני.
      2. חזור על צעדי 3.5.3 ו3.5.4 ללא כל מדגם רכוב, ושמירה על המכשירים מרתקים מחוברים לתא העומס (רק 1 מחזור הוא requiאדום).

4. Luminal Endothelialization של מבנים

הערה: לאחר ביצוע פרוטוקול הקציר (סעיף 2.4), בונה לעמוד טיפול להיות מותקנים בסיבוב קיר bioreactor לendothelialization נוסף.

1. מסתובב קיר bioreactor עיצוב
   1. לקדוח חור בקוטר 4.5 מ"מ במרכז הכובע מאוורר של צינור המאגר מבלי לפגוע בקרום המסנן המכסה את חורי האוורור.
   2. קיבוע mandrel (קוטר = 4.5 מ"מ, אורך = 40 מ"מ) לתוך החור ולתקן את mandrel כמתואר בשלב 1.1.2.
   3. הכן שתי תמיכת סיליקון בצורת C לקוטר החיצוני המבנה = 14 מ"מ; קוטר פנימי = 8 מ"מ).
   4. מקם מנוע מסתובב בקצה אחד של סיבוב קיר bioreactor והשפעה על הצד שני (איור 8 ב).
2. Endothelialization הלום
   1. להרחיב umbilic אדםאל וריד תאי האנדותל (HUVECs) ב 25 סנטימטר ² צלוחיות תרבות עם 5 מיליליטר של מדיום תרבות M199 בתוספת 10% (V / V) PS, 10% (V / V) FBS, 1% (V / V) עט-דלקת בצלחת פטרי בתוך חממה (C T = 37 מעלות, 5% CO _2, 100% לחות) עד מפגש 90%.
   2. הכן 1.5 מיליליטר של פתרון ציפוי חלבון למבנה הנדרש להידבקות תא אופטימלית על ידי דילול תערובת החלבונים להתרכז 10.5 ng / ml במדיום תרבית תאי אנדותל סרום ללא.
   3. מדוד את אורכו של המבנה באמצעות קליפר ורניה.
   4. לחשב את V luminal הנפח ושטח luminal של המבנה כ: V = D _ב ² L / 4 ו= D _בL בהתאמה (כאשר D הוא _בקוטר הפנימי המתאים לקוטר mandrel, וL הוא אורכו של המבנה).
   5. מקם את המבנה במרכז מאגר ביצוע הליך הקצירה (סעיף 2.4).השתמש תמיכת סיליקון בצורת C כדי לתקן את המבנה בשני הקצוות למאגר (איור 8).
   6. מלא את המאגר עם 35 מיליליטר של מדיום התרבות.
   7. מלא 75% מהיקף luminal המחושב של המבנה (V) עם פתרון ציפוי חלבון מוכן בשלב 4.2.2. סגור את שני הגפיים של המבנה, כדי למנוע כל דליפה של פתרון ציפוי חלבון (איור 8 א).
   8. להרכיב את מערכת bioreactor מסתובב קיר בתוך מכסה המנוע תרבית תאים.
   9. מניחים את bioreactor באינקובטור 37 ° C ולהתחיל את הסיבוב של bioreactor ב4.02 x 10 ^-5 כוח g עבור שעה 1 כדי לאפשר ציפוי luminal כפי שמוצג באיור 8 ב.
   10. פתח את הגפיים העליונים של המבנה ולשאוב את פתרון ציפוי חלבון מלומן.
   11. לנתק HUVECs (מעבר 2-3) על ידי הסרת מדיום התרבות מהבקבוק של HUVECs והוספת 3 מיליליטר של פתרון טריפסין (1x PBS). אניncubate במשך 5 דקות (ט = 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 100% לחות).
   12. Resuspend HUVECs בריכוז של 4 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר במדיום תרבות M199 בתוספת.
   13. בתוך מכסה המנוע תרבית תאים, זרע HUVECs ללומן של המבנה עם צפיפות של 1,000 תאים / ² סנטימטר ^15. סגור את הגפיים העליונים של המבנה, כדי למנוע כל דליפה של פתרון HUVECs.
   14. דגירה המבנים (ט = 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 100% לחות) ארח לסיבוב הקיר bioreactor (איור 8 ב) והתרבות עבור 2 ימים ברוטציה קבועה של כוח 4.02 x 10 ^-5 גרם.
   15. לקצור את המבנה לאחר 2 ימים של תרבות בתנאים סטריליים ולהכין אותו לאפיון ביולוגי נוסף כמפורט בסעיף 2.4.

תוצאות

עבודה זו מתארת ​​את הייצור של מבנים המבוסס על קולגן צינורי מהונדסים המכילים תאי כלי דם. כבר אחרי שעה 1 של gelation המוקדמת, תערובת תאים-ו- קולגן הורכבה ישירות בגיאומטרית צינור 3D, עם הקוטר החיצוני שווה לקוטר של התבנית המתאימה (כ -14 מ"מ). לאורך כל דרך התבגרות סטטי, מדידות חשפו את ההפחתה המהירה של הקוטר החיצוני של מבני cellularized צינורי, כפי שמוצגת בטבלה 1. הקוטר של ג'ל קולגן cellularized הצטמק של כ -60% מהערך הראשוני שלה לאחר יום 1 של תרבות סטטי, ו של כמעט 85% בתוך 7 ימים (משלימה וידאו 2). SMCs בתוך המבנים אחראים לנצפה מתכווץ והחיזוק המכני הקשורים, כתופעה זו אינה מתרחשת בפיגומי קולגן אינו cellularized. שים לב שאין שיפוע מכל סוג (תרמית, ביוכימי, מכאני, או אחר) יושם. תאי הכונןn דחיסה הביאה חומר עם צפיפות גדולה יותר קולגן שיכול להיות מטופלים ומאופקים לפניות מכאניות (וידאו נוסף 3 ו -4).

להתייחס שיפוץ מונע תאים לתכונות מכאניות וviscoelastic הכוללות, בדיקות עייפות בוצעו על המבנים (וידאו נוסף 5 ו -6). בדיקות אלה כללו רכיבה על אופניים במבנים (30 פעמים) בזנים שונים קבועים (10%, 20%, ו -30% מאורך מד ראשוני) ולהקליט את הלחץ כתגובה של המבנים לשידול המכני לאורך זמן. תוצאות הנציג למבנה אחד מוצגות באיור 9. המבנה עמד לחצים גבוהים יותר בכיוון האורך (75 kPa) מאשר בכיוון ההיקפי (16 kPa) כאשר נתון באותו טווח המתח (מתח) 30%. בינתיים, בכל מחזור, ערך שיא המתח הגיע לת"אמתח מרבי rgeted ירידה לאורך זמן. התנהגות זו אופיינית לנכסי viscoelastic הגבוהים שהפגינו בונה מבוססת קולגן אלה.

הפעילות הביולוגית של מבני cellularized הוערכה במהלך התבגרות סטטי. לפיכך, פעילות המטבולית של SMCs הוערכה על ידי מדידת צריכת גלוקוז וייצור חומצת החלב בתרבות סטטי. מדיום תרבות ידגם כל 2 ימים וגלוקוז וריכוזי חומצת החלב נמדדו באמצעות מנתח גז דם. העלייה המתמדת בצריכת גלוקוז וייצור חומצת החלב בשילוב להתכווצות החשובה של המבנים, מעידה על פעילות SMCs לאורך כל תרבות סטטי (איור 10).

היציבות המכנית המוגברת בשל שיפוץ מונע התא אפשרה המניפולציה של המבנים ותהליך endothelialization שלאחר מכן. צביעת Trichrome של האסון שבוצעה על מבני endothelializedהראה האנדותל הומוגנית מאוד. SMCs הציג מורפולוגיה ציר בצורה דמוית והופיע התפזר homogenously דרך הקיר, ואילו HUVECs הופיע התפשט גם בצד luminal (איור 11).

איור 1:. רכיבים של bioreactor סטטי bioreactor סטטי כלל 50 צינור שונה מיליליטר צנטריפוגות () וכובע מצויד mandrel (B). הצינור שימש כמאגר בינוני, והיה מצויד ביציאה למסנן 0.22 מיקרומטר, לחילוף הגזים, ומחץ, לדגימה בינונית ושינוי. הווה mandrel בכובע מאוורר אפשר הייצור של מבנים בצורת צינור. הגזה-אוחז (C) תוכנן ומפוברק כדי לתמוך gelation של המבנים מעל mandrel. יתר על כן, אלהאוחז אפשר בונה להיות מטופלים לאחר התבגרות סטטי ולהיות קבועה למנגנון המכני. הקוטר החיצוני של mandrel היה 4.7 מ"מ.

איור 2: הרכבה של bioreactor סטטי הרכבת שלבים של bioreactor לפני העיקור.. הגזה-אוחז היה רכוב על mandrel () במרחק קבוע. עובש הוכנס (B) והדוק קבוע לפקק סיליקון (C). הקוטר החיצוני של mandrel היה 4.7 מ"מ.

איור 3:. ייצור של המבנים בתנאים סטריליים תערובת התאים וקולגן נמזג לתוך מתחם דיור-העובש (א), ולתת ג'ל לשעה 1 בטמפרטורת חדר (B). לאחר מכן, העובש הוסר (C), bioreactor סטטי הורכב (D) והועבר בתוך מאגר להבשלה סטטי של המבנה בחממה (ט = 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 100% לחות). הקוטר החיצוני של mandrel היה 4.7 מ"מ.

איור 4:. מדידת העובי / הקוטר החיצוני של המבנים interferometer סריקת לייזר המשמש לביצוע מדידת הקטרים ​​החיצוניים של המבנים. המבנה הוצב למסלול של קרן הלייזר ונוצר צל. הרוחב של הצל, המתאים לקוטר החיצוני של המבנה, אז נמדד ומוצג על המסך.

e_content "FO: לשמור-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 5:. הופעה מורפולוגי של המבנה שנקטפו () מייד לאחר gelation ו( ב ') לאחר שיפוץ מונע תאים במהלך התבגרות סטטי במשך 2 שבועות.

איור 6: הגדרה ניסויית לאפיונים מכאניים היא הייתה מורכבת ממייקרו-המכאני הבוחן מצויד בתא עומס 5 או 10 N ואמבט המכיל PBS על 37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על הדגימות בתנאים פסאודו-פיסיולוגי..

איור 7: F להכנת דגימות או אפיונים מכאניים. קציר לדוגמא () והכנה (ב) לבדיקות שבוצעו בעייפות האורך והכיוונים ההיקפיים (C). הקוטר החיצוני של mandrel היה 4.7 מ"מ.

איור 8: סיבוב קיר bioreactor () המבנים צינוריים רוכזו במרכז המאגר בעזרת תמיכת סיליקון בצורת ג.. שני הגפיים של המבנה היו סגורים, כדי למנוע כל דליפה של פתרון HUVECs. (ב) היו בתרבית במבני חממה (ט = 37 מעלות צלזיוס, _2, לחות 5% CO 100%) בסיבוב ב4.02 x 10 ^-5 כוח g עבור 2 ימים.

2 / "width =" 700 52812fig9highres.jpg "/>
איור 9:.. אפיונים מכניים תוצאות של בדיקות שבוצעו על עייפות מבנים באורך (א) וכיוונים היקפיים (ב ') לאחר שיפוץ מונע תא אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 10:. פעילות המטבולית של SMCs בתוך ג'ל קולגן מדידות של קצב צריכת הגלוקוז וקצב ייצור חומצת החלב בוצעו עם מנתח גז דם כל 2 ימים, לאחר שינוי התרבות הבינוני. מדיום תרבות טרי שימש כרמת בסיס למדידות סוכר ובריכוזי חומצת החלב.

n-page = "תמיד">
איור 11: endothelialization לום תמונות היסטולוגית של החתכים רדיאליים של מבנים צינוריים.. צביעת Trichome של האסון של מבנים צינוריים בתרבית באופן סטטי לשבוע 1 (א) ו -2 שבועות (ב '). צביעת H & E של מבנה צינורי (C).

זמן	עובי (מ"מ)	דחיסה (%)
0 שעות	4.83 ± 0.02	0 ± 0
2 שעות	4.26 ± 0.02	12 ± 0
4 שעות	4.21 ± 0.03	13 ± 1
6 שעות	4.06 ± 0.10	16 ± 2
12 שעותr	3.16 ± 0.07	35 ± 1
יום 1	2.08 ± 0.11	57 ± 2
שבוע 1	0.68 ± 0.07	86 ± 1
2 שבועות	0.36 ± 0.00	93 ± 0

טבלת 1: דחיסה מהירה של קוטר מבנה במהלך התבגרות סטטי עובי דופן של המבנים ושיעור הדחיסה כפונקציה של זמן של תרבות סטטי.. דחיסה נמדדה על ידי קביעת הקוטר החיצוני של מבנים צינוריים עם interferometer לייזר סריקה (הסדרה 183B, LaserMike 136). לאחר 24 שעות, המבנים נדחסו עד 57% ± 2% מהממדים המעוצב שלהם. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן (n = 3). הנוכחות והפעילות של תאי חיים שריר חלק הייתה אחראי רק לשינויים גדולים כזה.

סוpplemental וידאו 1:. קציר של ג'ל קולגן צינורי-שופץ לא אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

נוסף וידאו 2:. דחיסה מונע תאים של ג'ל קולגן צינורי אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

נוסף וידאו 3:. מניפולציה של ג'ל קולגן צינורי-שופץ לא אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

נוסף 4 וידאו:. מניפולציה של ג'ל קולגן צינורי-שופץ תאים אנא לחץ כאן לצפייה ההוא וידאו.

נוסף וידאו 5:. בדיקת עייפות אורך (30%) על-שופץ תאי ג'ל קולגן צינורי אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

נוסף וידאו 6:. בדיקת עייפות היקפית (30%) על-שופץ תאי ג'ל קולגן צינורי אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

Discussion

בקרב הקהילה של מהנדסי רקמת כלי דם, מאמצים אדירים שנעשו כדי לשחזר את שכבת תקשורת Tunica אחראית ליציבות המכנית של כלי דם ^16. מאז עבודתו החלוצית של ויינברג ובל ^17, קולגן כבר בשימוש נרחב כפיגום להנדסת רקמות כלי דם בגלל ההתאמה הביולוגית, הנכסים שאינם החיסוניים שלה והזמינות. עם זאת, השימוש בקולגן מהווה אתגר גדול לחוקרים, כחומר זה לא קל לטפל, בשל החוסר המהותי של קשיחות מכאנית. מניפולציות במהלך הכנת פיגום עלולות לגרום נזק לפיגומים, להתפשר לשימוש נוסף.

הטכניקה המתוארת בעבודה זו מאפשרת: i) להנדס ג'ל קולגן cellularized לגיאומטריה בצורת צינור; ii) להנדס רקמות ביולוגיות חזקים מספיק כדי להיות מטופלים לאחר תקופה קצרה סטטי התבגרות (1 או 2 שבועות); ג) כלתכונות מכאניות וviscoelastic sess של רקמות ביולוגיות כגון בצורת צינור ב-2 כיוונים. תאים בג'ל לשחק תפקיד מפתח בשיפוץ מטריצת קולגן. במהלך תקופת ההתבגרות, SMCs ההתכווצות הוביל לדחיסה של ג'לי מניב מבנה עם יציבות מכאנית גבוהה שיכול להיות מוערך בכיווני האורך והיקפיים. לאחר מכן, HUVECs זורעים בצד luminal של המבנים שנוצרו האנדותל הומוגנית ובת-קיימא, ובכך הוכיחו את התאמתו של ג'ל קולגן עבור יישומי הנדסת רקמות וכלי דם.

Bioreactor מוצג בעבודה זו תוכנן במיוחד כדי לספק סביבה אופטימלית לצמיחת תאים במהלך התבגרות סטטי. בנוסף, המכשירים שפותחו עבור האפיון של התכונות מכאניות וviscoelastic של המבנים נועדו במטרה להפחית את הנזק פוטנציאלי הגלום במניפולציה שלחומרים עדינים כזה. לפיכך, bioreactor סטטי היה מצויד במסנן 0.22 מיקרומטר וקרום מסנן על הכובע (שלב 1.1.2, איור 1 א ו- B) שאיפשר חילוף גזים בין מדיום התרבות בתוך המאגר והחממה, תוך שמירה על סביבת סטרילית תרבות. מחיצת luer בתחתית שימשה כנמל לדגימת מדיום תרבות ושינוי בתרבות סטטי. כמה צעדים קריטיים צריכים להיחשב במהלך ייצור מבנה ואפיונים. כל המניפולציות (שבוצעו בשלב 2.1.1 ובשלבים הבאים) שעשוי לשנות את העקרות של המערכת בוצעו במנדף הביולוגי סטרילי. תאים וג'ל קולגן הכנת תערובת טופלה על קרח כדי לעכב את תהליך gelation (שלבים 2.1.4 ל2.1.7). בשלב 2.1.7, כל בועות אוויר כלואות בתערובת לפני gelation אזורי ריכוז לחץ פוטנציאליים שיכול לסכן את יםtability של המבנים. לכן, הסרת בועות אוויר כזה דורש מעט רועד ההרכבה או באמצעות ואקום רפואי במשך 3 דקות לdegasing בתנאים סטריליים. לבסוף, להתמודד עוצבו במיוחד לשמירה על הציר המרכזי בmandrel עובש הצינור במהלך gelation ולמאפשר מניפולציה עדינה של המבנים בקציר (הסרת mandrel, סעיף 2.4), לendothelialization, ועל מנת להקל על ההרכבה המערכת המכנית (בדיקות אורך).

הפרוטוקול הנוכחי מציע גישה מקורית וקל לתהליך אלטרנטיבי של חיזוק מבני ג'ל קולגן המבוססים על הפוטנציאל הגלום התכווצות הטבעית של SMCs. טכניקות נפוצות של חיזוק מטריצות קולגן כרוך בשימוש בסוכני crosslinking פיזיים וכימיים שיכולה להיות השפעות מזיקות על אינטראקציות תאי מטריצת ^18-20. טכניקת הייצור מוצגת בעבודה זו מאפשרת לכוון את תהליך שיפוץ מונע תאים זו להניב מבנה רקמות מהונדסות עם תכונות מכאניות ממוקדות ללא כל טיפול פיזי או כימי.

אפיון של תכונות מכאניות וviscoelastic של ג'ל קולגן התייבשות הוא אתגר גדול. בפרספקטיבה זו, הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה מקורית להערכת התכונות מכאניות של רקמות רכות צינורי. אפיון זה יכול להתבצע לא רק בכיוון ההיקפי, אלא גם בכיוון האורך, ישירות על כל המבנה צינורי. במהלך אפיון מכאני, טמפרטורה, סביבה מימית, pH וחוזק יוני הם חלק מהגורמים הסביבתיים שידועים כי הם משפיעים על ההתנהגות המכנית של רקמות ביולוגיות ²¹ באופן דרסטי. לפיכך, העבודה הנוכחית מצביעה על הגדרה מקורית ופרוטוקול לאפיון המכני של רקמות ביולוגיות במאודפסאודו-פיזיולוגית לשחזור סביבה (תמיסת מלח על 37 מעלות צלזיוס וpH 7.4). למיטב ידיעתנו, של אפיון סוג זה דווח לא במקום אחר.

לסיכום, הטכניקה המוצעת בעבודה זו מדגימה את הפוטנציאל הגבוה של ערבוב הישיר של תאים עם קולגן עבור יישומי הנדסת רקמות וכלי דם. שיטה זו ביחד עם תהליך האפיון וendothelialization המכני מהווה פרוטוקולים רבים ערכיים גבוהים. מכאן, דרך שינויים קלים של הסט-אפ ופרוטוקולים, תוך שמירה על אותו הרציונל, דרישות עיקריות לשווים רקמת כלי דם הנדסה ניתן לטפל כגון עיבוד מהיר ולא מסובך, כולל endothelialization, ואת האפשרות להיות משורבב למגוון רחב של רך רקמות עם אורכים ובקטרים ​​שונים. יתר על כן, ניתן לחקור סוגים שונים חסיד תא, חלבוני ECM וגיאומטריות יצוקות למספר applicati הממוקדתוספות, כגון גידי הנדסה, שתלי עור, כתמי לב, עצבים, בין יתר. למרות התכונות מכאניות של המבנים מעודדות, הם עדיין נמוכים יותר מאלה של רקמות ילידים. בהקשר זה, אנו מאמינים שתקופת התבגרות סטטי קצרה מאוד היא צעד חיוני לגירוי הדינמי לתוך bioreactor, ובכך מוביל לשלמות מבנית גבוהה ויציבות מכאנית. עם זאת, את האפשרות לייצר במהירות מבנים מבוסס קולגן cellularized רקמות מהונדסות מתאימה למכאני והיסטולוגית ניתוחים עושה bioreactor סטטי המתואר במסמך זה כלי שימושי ומבטיח לספק תובנה יחסי הגומלין בין תאים וECM במהלך צמיחה ושיפוץ, או אפילו ל לשמש כמודל לטיפולים ומערכות אספקת סמים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CellTreat 50 ml Bio-Reaction tubes	CELLTREAT Scientific Products	229-475	Centrifuge tube
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk	Cole Parmer	RK-45503-04	Luer fittings for "gas-exchange port"
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk	Cole Parmer	RK-45500-04	Luer fittings for the "medium sampling port"
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft.	Cole Parmer	RK-96410-17	Tube 1 and 2 for the gauze grippers
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft.	Cole Parmer	RK-96410-16	Tube 3 for the gauze grippers
Silastic Medical adhesive silicone, type A	Dow Corning	-	Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor
Polyvent 4 Vessel venting filters	Whatman	6713-0425	Filter for "gas exchange port"
Rod. PP. stirring. 8’’	Scienceware	377660008	Mandrel
Stopper silicone rubber 00 PK12	VWR	59590-084	Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube
Krytox PFPE/PTFE Greases	Dupont	GPL 202	Medical grade grease for covering the mandrel
Trypsin-EDTA (0.5%)	Gibco	15400-054	Cell culture
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent	Dow Corning	-	C-shaped silicone support for endothelialization
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco (Life Technology)	11995-065	Cell culture
Pure acetone (99%)	Laboratoire Mat Inc.	AP0102	Chemical for collagen extraction
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%)	Fisher Scientific	AC610080040	Chemical for collagen extraction
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%)	Fisher Scientific	FL070494	Chemical for collagen extraction
Chloroform solution (99%)	Laboratoire Mat Inc.	CR 0179	Chemical for collagen extraction
Hepes	Sigma-Aldrich	163716	Chemical for construct preparation
NaOH	Laboratoire Mat Inc.	SR-0169	Chemical for construct preparation
LaserMike 136	LaserMike	Series 183B	Scanning laser interferometer
ElectroPulse MicroTester	Instron Corporation	-	Micromechanical Tester
HyClone Media M199/EBSS, 500 ml	GE Healthcare Life Sciences	SH30253.01	Component of cell culture medium
Fetal bovine serum HI - 500 ml	Gibco	SH 30396.03	Component of cell culture medium
Porcine serum (PS)	Sigma-Aldrich	P9783	Component of cell culture medium
Penicillin-Streptomicin	Gibco	15140-122	Component of cell culture medium
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP661-50	Saline solution
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red	Sarstedt Inc.	83.1812.002	Cell culture
ColorpHast- pH-indicator strips (pH = 6.5-10.0)	EMD	9583	pH measurements
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml vial	BD Biosciences - Discovery Labware	356230	Concentrate protein mixture for endothelialization process
LifeCam VX-3000	Microsoft	-	Thickness measurement
Biochemical analyzer, DxC600	Beckman Coulter Unicell Synchron	-	Glucose and lactate concentrations measurements
Collagen fibers	Rat tails	-	Collagen was extracted in the laboratory
Porcine smooth muscle cells (pSMCs)	Porcine aortas	-	pSMCs were isolated in the laboratory
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	Human umbilical veins	-	HUVECs were isolated in the laboratory