אינדוקציה והערכה של איסכמיה reperfusion פגיעה בלבבות עכברוש Langendorff-perfused

Summary

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Abstract

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Introduction

הבהרה של האירועים שבבסיס תגובת הלב לשתי איסכמיה ו reperfusion חיונית בשיפור הטיפול בהליכי אוטם שריר לב ¹ ולב כירורגית שדורשים ² צלב-הידוק אב העורקים. בעוד מודלים in vivo של פגיעת reperfusion איסכמיה לאפשר ניתוח נקודת סיום מאוד שימושי, הם לא יעילים כמו לחקר ההשפעות התפקודיות של פגיעת reperfusion איסכמיה בחריפות בזמן אמת. בנוסף, במודלי reperfusion איסכמיה vivo בדרך כלל לייצר שונות משמעותיות בגודל אוטם, ומשלוח ישיר של תרופה ללב בזמן reperfusion הוא מאתגר. הניצול של מערכת לב Langendorff מבודדת ללימוד פגיעת reperfusion איסכמיה מאפשר להערכה תפקודית בזמן אמת של טיפולים תרופתיים, אזור האחיד של רקמת אוטם שריר, ומשלוח מיידי של תרופה ישירות לשריר הלב.

תאר ב ראשוןy אוסקר Langendorff בשינה 1895 ^3, הלב Langendorff מבודד הוא מודל חזק ללימוד פגיעת reperfusion איסכמיה, ששמש במחקר reperfusion איסכמיה במשך 40 השנים האחרונות ^4,5. הנה, כמה שינויים נעשו כדי לייעל את הלב המבודד לניתוח פונקציונלי. בcannulation באתרו של אב העורקים בזמן הלב פועם מבטיח כי הלב אינו חווה נפשית מראש איסכמי, שהיה משנה את תוצאות ניסויי reperfusion איסכמיה ^6. כדי להקל על זה, tracheotomy מתבצע, המאפשר אוורור והבטחת יציבות פיזיולוגית של העכברוש במהלך ניתוח. הלב אז מצורף לעמודת מים במקטורן זכוכית ספירלה שדרכו חיץ קרבס Henseleit מועבר באמצעות זלוף מדרדר ישירות לאב העורקים. בלון מלוח מלא מוכנס לתוך החדר השמאלי ומחובר למתמר לחץ, המאפשר למדידה בזמן אמת של לחצים מהחדרחישוב ד פרמטרים פונקציונליים מרובים. בסיומו של הניסוי, הלב סמוק עם מי מלח קר כדי לעצור את ההתכווצות ופלאש קפוא בחנקן נוזלי כדי לאפשר ניתוח במורד הזרם של רמות ה- DNA, RNA והחלבון. שונה כך, לב Langendorff perfused משמש כמערכת יעילה לניטור ישיר של ההשפעה הפיזיולוגית של התערבויות תרופתיות בכל עת בחריפות במהלך פציעת reperfusion איסכמיה.

Protocol

כל הנהלים המופיעים ברשימה שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה. הניסויים שתוארו כאן הם ניסויים חריפים, שאינה הישרדות. ככזה, אין שימוש במשחת עיניים וחבילת הפעלה סטרילי לא נדרשה. המתת חסד מושגת על ידי exsanguination במהלך הקציר של הלב.

1. ניסיוני הכנה

1. הגדרה או לחץ קבוע או זרימה מתמדת מכשירי Langendorff זלוף ^4.
2. הכן 4 L של קרבס Henseleit הצפת שונה (במ"מ: 112 NaCl, KCl 5, 1.2 MgSO _4, 1 K _{2 4} HPO, 1.25 CaCl _2, 25 ₃ NaHCO, 11 D-גלוקוז, 0.2 חומצת octanoic, pH = 7.4).
   1. הפוך 10x מאגרי המניה.
      1. ממיסים NaCl, KCl, MgSO _4, ו- K _{2 4} HPO במי ultrapure 3 L.
      2. לפזר CaCl ₂ ב 500 מיליליטר המים Wi ultrapureה 40 מיליליטר של 1 N HCl.
      3. לאט לאט להוסיף CaCl ₂ פתרון לחיץ שנעשה ב1.2.1.1. להוסיף מספיק מים ultrapure להסתכם 4 ל 'אפשר לעורר עבור שעה 1 לפני סינון דרך מסנן 0.8 מיקרומטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
      4. לפזר NaHCO ₃ במי ultrapure 4 L. לאפשר לעורר במשך שעה 1 לפני הסינון דרך על 0.8 מיקרומטר מסנן. חנות ב 4 מעלות צלזיוס
   2. לשלב 400 מיליליטר 10x חיץ קרבס Henseleit עם 400 מיליליטר 10x NaHCO חיץ _3. מוסיף מים ultrapure מספיק לסך 4 ל ממיסים סוכר ובחומצת octanoic תוך ערבוב. סנן באמצעות 0.8 מיקרומטר לסנן.
3. הכן מערכת ללב.
   1. הוסף 2 ליטר של חיץ מסונן לבקבוק 4 L ממוקם 38 במעל ברזלים מחוברים לצינורית אב העורקים. זה יספק לחץ זלוף של 70-80 מ"מ כספית ללב, המהווה את לחץ זלוף המומלץ ^4.
   2. הכנס bubbler פיזור גז למאגר בבקבוק.
   3. הפעל את החיץ באמצעות המערכת, להיות בטוח כדי לחסל את כל בועות מתוך צינורות.
   4. הפעל גז (95% O _2/5% CO ₂₎ לפחות 30 דקות לפני לב הוא להציב במערכת. השתמש זרימת גז בדיקה ומנתח גז דם כדי לוודא ריווי חמצן.
4. הכן אספקה ​​כירורגית ובלון.
   1. לקציר של לב, להכין זוג אחד של 6.75 "מספריים כירורגיות, זוג אחד של 4.5" מספריים, שני זוגות של hemostats, שני סטים של מלקחיים caramalt, שני מזרקים עם 27 מחטי G, 2 חתיכות של תפר משי 0-מד (כ 15 ס"מ אורך), צינורית אחד 1/16 אינץ 'תיל, וצינורית לקנה הנשימה אחת.
   2. להרכיב צינורית לקנה הנשימה, להדביק חתיכה קצרה של צינור פלסטיק בקוטר 1/16 אינץ 'לY-מחבר.
   3. להרכיב מנגנון בלון: לצרף מחט gavage לפיסת 1/16 צינורות אינץ ', ולאחר מכן לצרף צינורות לדיור מתמר לחץ. מזרק קטן המצורף לצד השני של TR הלחץ האחרansducer דיור יאפשר אינפלציה ודפלציה של הבלון.
      1. לחתוך ריבוע של קצה לעטוף ומקום פלסטיק של מחט gavage במרכז. לעטוף בניילון הנצמד סביב מחט gavage.
      2. מלא בלון עם מי מלח ולקשור את שני תפרים. לנפח בלון כדי לוודא שאין דליפות. הנפח של תמיסת מלח בתוך הבלון המנופח צריך להיות בערך 200 μl, אבל יכול להשתנות בהתאם לגודל של העכברוש.
      3. לחלופין, להשתמש בעריסת אצבע לטקס במקום של הניילון נצמד. הנח מחט gavage בתוך עריסת אצבע, למלא עם מי מלח ולקשור את.

2. קציר הלב

1. לרסן את עכברוש ספראג Dawley באמצעות decapicone או התקן ריסון ספר אחר. שוקל חולדה.
2. לנהל קטמין / תערובת xylazine (0.85 מ"ג / קילוגרם קטמין ו0.15 מ"ג / קילוגרם xylazine) באמצעות זריקת intraperitoneal להרדים חולדה. מינון זה של הרדמה יספק הרדמה מספיק ל20-40 דקות, אבל ההליך אמור להסתיים מהר ככל האפשר לאחר ההרדמה הוא אישר.
3. לאשר מידה ראויה של הרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן בדיקות.
4. Tracheotomy
   1. הסר פרווה מאמצע כף-לבסיס של לסת, באמצעות hemostats לרומם פרווה ומספריים לעשות חתך. שמור את הפרווה גבוהה להפריד אותו מהשריר הבסיסי, המאפשר אחד כדי לחתוך לאורך הפרווה ולהסיר אותו.
   2. באמצעות hemostats, להרים רקמות בלוטות ולעשות חתך אופקי בfascia נחותים רקמת הבלוטות. השתמש hemostats להפיץ חתך פתוח, נזהר שלא ניק ורידי הצוואר.
   3. מספריים באמצעות hemostats, שריר שמעל קנה הנשימה קמצוץ, ובאמצעות לעשות חתך רוחבי בשריר ממש מתחת לקצה hemostats. באמצעות hemostats, התפשט לרקמות מלבד לחשוף את קנה הנשימה.
   4. בזהירות להכניס hemostats תחת קנה הנשימה, ניקוי fascia תוך כדי התקדמות בעדינות על ידי קידום וחוזר בי hemostats.
   5. ברגע שhemostats ממוקמים בהצלחה מאחורי קנה הנשימה, לצבוט 0-0 תפר משי עם hemostats וhemisect קנה הנשימה עם זוג קטן, מספריים חד.
   6. הכנס צינורית לקנה הנשימה לתוך קנה הנשימה התפצל לפתע, למשוך תפר מאחורי קנה הנשימה, ולקשור את התפר סביב קנה הנשימה cannulated, עיגון התפר לY-המפשעה של הצינורית עם קשר מנתחים.
   7. באמצעות מחט 27 G, להזריק 1000 U / קילוגרם הפרין לוריד הצוואר ומאפשר להסתובב למשך 30 שניות.
5. פתיחת בית החזה
   1. הסר פרווה מאמצע בטן-לאזור אמצע כף-ידי צובט עם hemostats וגזירה במספריים.
   2. לעשות חתך רוחבי אינץ '¾ לתוך קיר שרירי הבטן, ממש מתחת לסרעפת.
   3. לעשות חתך אנכי במעלה קיר הקיר וחזה הבטן, חיתוך לאורך עצם החזה.
   4. חותך את הסרעפת בחזרה בילטרלי, ואז להפיץ בית חזה כדי לחשוף את לב, בית חזה מהדק עם hemostats כדי להבטיח שנשארה התפשטות.
   5. באמצעות hemostats, להסיר בעדינות התימוס, חושף את אב העורקים עולים.
   6. להקניט hemostats דרך לולאת אב העורקים, קידום וחוזר בי hemostats בעדינות מתפשט fascia לאפשר קצה hemostats דרך.
   7. השתמש hemostats למשוך 0-0 תפר משי מאחורי אב העורקים עולים, לקשור תפר לפקעת חצי כיכר רופפת.
   8. הפעל ברזלים כדי להתחיל זרימה של חיץ זלוף, אב העורקים hemisect ומייד להכניס צינורית לתוך לומן של אב העורקים. מהירות cinch קשר חצי כיכר ולהשלים את הקשר, הידוק ביסודיות.
   9. השתמש במספריים לנתח לב מכולים הגדולים, להוציא את הלב מחזה ולצרף לעמודה זלוף.
   10. לקצץ משם רקמת ריאה עודפת ולאפשר לב לאזן על עמודה במשך כ -15 דקות לפני החדרת הבלון. השתמש קצב זרימה נורמלי של חיץ דרך הלב של 10-20 מיליליטר / דקה.

3. Langendorff זלוף ואיסכמיה reperfusion פציעה

1. מיקום של טרום LVבלון ssure
   1. להוציא את האוויר הבלון תוך גלגול לצורת קונוס ולהפוך את ברזלים כדי להבטיח בלון נשאר מרוקן.
   2. בלו עזב אטריום עם מספריים קטנים לחשוף גישה לשסתום צניפי.
   3. הכנס בלון דרך אטריום שמאל ושסתום צניפי לתוך חדר השמאלי.
   4. התחל תוכנת ניטור לחץ (LabChart Pro).
   5. לנפח בלון על ידי פתיחת שסתום ובעדינות הגדלת כמות של תמיסת מלח בבלון עד שלחץ הדיאסטולי קריאה מmicromanometer עולה אפס.
   6. כדי לבדוק את התגובה באורך-מתח, לנפח בלון לאט ללחץ הדיאסטולי של 75 מ"מ כספית, להוציא את האוויר לאט, חוזר פעם אחת.
   7. הגדר לחץ הדיאסטולי 10 מ"מ כספית על ידי ויסות הכמות של תמיסת מלח בבלון. הפעל ברזלים לאטום בלון ברמה זו של אינפלציה, ולשמור על מערכת לחץ סגורה בין בלון LV ומתמר לחץ.
   8. לב נמוך יותר לתא תא וכיסוי מחומם עם פלסטיק.
2. מודעהministration של איסכמיה reperfusion פציעה
   1. חבר את החלק התחתון של החדר המחומם ולאפשר קאמריים למלא עם חיץ effused.
   2. כאשר חיץ ששקוע לב, להפוך את ברזלים כדי לעצור את הזרימה של חיץ ללב, גרימת איסכמיה הגלובלית. זמן איסכמיה יכול להשתנות בהתאם למטרות של הניסוי.
   3. לאחר 30 דקות של איסכמיה, להפוך ברזלים כדי לשחזר את הזרימה של חיץ ללב, ייזום reperfusion.
   4. לאפשר reperfusion של לב עבור שעה 1 לפני סיום הניסוי. השתמש פעמים reperfusion משתנים, בהתאם למטרות של הניסוי.
3. סיום הניסוי וקציר של רקמות
   1. שימוש בנמל בצד של ברזלים, לנהל 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט ב 4 מעלות צלזיוס ללב בשיעור של 10 מיליליטר / דקה לעצור הלב.
   2. הסר לב מטור זלוף, לקצץ משם נותר רקמות פרוזדורים.
   3. הנח לב לתוך מטריצת חיתוך רקמות נירוסטה, מכסה באבאrafilm, והמקום ב -80 ° C במשך 8 דקות, או עד שהלב יש עקביות כמו מרשמלו.
   4. הסר בלוק מהמקפיא ולהכניס סכיני גילוח לחיתוך מטריצה ​​לחתוך לב ל -2 פרוסות מ"מ. ניתן גם לרכוש בלוקים רקמות עם גדלי פרוסה אחרים מ -2 מ"מ.
   5. הסר פרוסות אחד בכל פעם ושחרר לתוך חנקן נוזלי להבהב להקפיא למחקרים ביוכימיים. שמור על פרוסת חדרית השלישית מהקודקוד לצביעת אוטם.
   6. הסרה של רקמה מחנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד לשימוש בניסויים ביוכימיים.
4. אוטם מכתים
   1. דגירה הפרוסה חדרית השלישית ב 10 מיליליטר של 1% w / כלוריד triphenyltetrazolium נ (TTC) על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
      הערה: דגירה בTTC יכולה להתבצע במשך 15 או 30 דקות ללא שינוי ביעילות ^15.
   2. העבר את פרוסת רקמה מTTC 10% פורמלין שנאגרו ולאפשר לדגירה בטמפרטורת חדר למשך הלילה. לקבלת תוצאות אופטימליות, לשמועיש לנקוט TS מתוך פורמלין וצלם בתוך 24 שעות ^4.
   3. תוכנה פרוסה ושימוש מוכתם צילום כגון ImageJ להעריך גודל אוטם על פי הפרוטוקול של היצרן. לצלם בהקדם האפשרי לאחר קיבוע, כצבע יימוג לאורך זמן.

תוצאות

מנגנון בלון החדר השמאלי מאפשר ניטור של הלחץ שפותח על ידי חדר הקבלנות שמאלה (איור 1) בזמן אמת. כפי שתואר לעיל ^7, עקבות לחץ זה יכול לשמש כדי לחשב רב של הפרמטרים של תפקוד חדר. חישובים אלה יכולים להתבצע בשלב הבסיסי, כמו גם את שלב reperfusion, בממוצע לכל עקבות מרובות ?...

Discussion

מבודד לב החולדה perfused יכול לשמש בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה של התערבות תרופתית בלב נפשית מראש לפגיעה reperfusion איסכמיה ^9. עם זאת, יש כמה צעדים חיוניים להליך שחייב להיות אחיד כדי להבטיח תוצאות לשחזור. שמירה על טמפרטורה של 37.4 מעלות צלזיוס במערכת היא קריטית, כמו גם היפות?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8