Induction et de l'évaluation de l'ischémie-reperfusion dans coeurs de rat Langendorff perfusés

Résumé

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Résumé

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Introduction

Élucidation des événements sous-jacents de la réponse cardiaque à la fois à l'ischémie et la reperfusion sont essentiels pour améliorer le traitement des infarctus ¹ et cardiaques procédures chirurgicales qui nécessitent du myocarde clampage aortique ^2. Alors que les modèles in vivo d'une lésion de reperfusion d'ischémie permettent une analyse de point de terminaison très utiles, ils ne sont pas aussi efficaces pour étudier les effets fonctionnels de la lésion de reperfusion d'ischémie aiguë en temps réel. En outre, dans les modèles d'ischémie reperfusion vivo produisent généralement la variabilité significative de la taille de l'infarctus, et la livraison directe de médicaments au cœur au moment de la reperfusion est difficile. L'utilisation d'un système de cœur isolé de Langendorff pour l'étude des lésions d'ischémie de reperfusion permet une évaluation fonctionnelle en temps réel des traitements pharmacologiques, zone uniforme de tissu infarci et livraison instantanée du médicament directement dans le myocarde.

D'abord décrit by Langendorff Oscar en 1895 ^3, au coeur de Langendorff isolé est un modèle robuste pour étudier les lésions de reperfusion d'ischémie, après avoir été utilisé dans la recherche de reperfusion d'ischémie pendant les 40 dernières années ^4,5. Ici, quelques modifications sont apportées pour optimiser le coeur isolé pour l'analyse fonctionnelle. Dans cathétérisme situ de l'aorte alors que le cœur bat assure que le cœur ne connaît pas le préconditionnement ischémique, qui pourrait altérer les résultats des essais ischémie reperfusion ^6. Pour faciliter cela, une trachéotomie est réalisée, ce qui permet la ventilation et assurer la stabilité physiologique du rat au cours de la chirurgie. Le cœur est ensuite fixé à une colonne à chemise d'eau en spirale à travers laquelle le verre tampon Krebs Henseleit est envoyé par perfusion rétrograde directement dans l'aorte. Un ballon rempli de solution saline est introduite dans le ventricule gauche et fixé à un transducteur de pression, ce qui permet la mesure du temps réel de la pression de l'intérieur de l'un ventriculed calcul des paramètres fonctionnels multiples. À la fin de l'expérience, le cœur est rincée avec une solution saline froide pour arrêter la contraction et le flash congelés dans l'azote liquide pour permettre une analyse en aval du taux d'ADN, ARN et de protéines. Ainsi modifié, le cœur de Langendorff perfusé sert d'un système efficace pour la surveillance directe de l'effet physiologique des interventions pharmacologiques à tout moment aiguë au cours de la lésion d'ischémie reperfusion.

Protocole

Toutes les procédures énumérés ici ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université médicale de Caroline du Sud. Les expériences décrites ici sont, des expériences non-survie aigus. En tant que tel, il n'y a aucune utilisation de pommade ophtalmique et un bloc opératoire stérile est pas nécessaire. L'euthanasie est obtenu par saignée pendant la récolte du cœur.

1. Préparation expérimentale

1. Mettre en place soit une pression constante ou un débit constant perfusion de Langendorff Appareil ^4.
2. Préparer 4 litres de tampon de Krebs-Henseleit modifiée (en mM: NaCl 112, KCl 5, 1,2 MgSO _4, 1 K ₂ HPO _{4, CaCl2} 1,25, NaHCO ₃ 25, 11 D-glucose, l'acide octanoïque 0,2, pH = 7,4).
   1. Assurez 10x actions tampons.
      1. Dissoudre NaCl, KCl, MgSO ₄ et K ₂ HPO ₄ dans 3 L d'eau ultrapure.
      2. Dissoudre _CaCl2 dans 500 ml d'eau ultra pure wie 40 ml de HCl 1 N.
      3. Ajouter lentement solution de CaCl ₂ à la mémoire tampon réalisés dans 1.2.1.1. Ajouter de l'eau ultra pure assez pour totalisera 4 L. permettent de remuer pendant 1 heure avant de filtrer à travers un filtre de 0,8 um. Conserver à 4 ° C.
      4. Dissoudre NaHCO ₃ à 4 L d'eau ultra-pure. Laisser agiter pendant 1 heure avant de filtrer à travers à 0,8 um filtre. Conserver à 4 ° C
   2. Mélanger 400 ml 10x tampon de Krebs Henseleit avec 400 ml 10x tampon NaHCO _3. Ajouter suffisamment d'eau ultra-pure à totalisera 4 L. Dissoudre le glucose et l'acide octanoïque, tout en agitant. Filtrer à travers 0,8 um filtre.
3. Préparez-vous pour le système cardiaque.
   1. Ajouter 2 L de tampon filtré à un 4 L bouteille placé 38 en dessus du robinet fixé à la canule aortique. Cela donnera une pression de perfusion de 70-80 mmHg au cœur, qui est la pression de perfusion recommandé ^4.
   2. Insérez dispersion barboteur de gaz dans la mémoire tampon dans la bouteille.
   3. Exécutez le tampon à travers le système, en étant sûr d'éliminer les bulles à l'intérieur du tube.
   4. Activer le gaz (95% O _2/5% CO ₂₎ d'au moins 30 min avant de cœur doit être placé sur le système. Utilisation d'une sonde d'écoulement de gaz et l'analyseur de gaz de sang pour vérifier la saturation en oxygène.
4. Préparer fournitures chirurgicales et ballon.
   1. Pour la récolte de cœur, de préparer une paire de 6,75 "ciseaux chirurgicaux, une paire de 4.5" ciseaux, deux paires de pinces hémostatiques, deux ensembles de pince caramalt, deux seringues avec 27 g d'aiguilles, 2 morceaux de 0-jauge suture de soie (environ 15 cm de longueur), une canule à barbillons 1/16 de pouce, et une canule trachéale.
   2. Pour assembler canule trachéale, coller un court morceau de tuyau en plastique de diamètre 1/16 pouces à un connecteur en Y.
   3. Pour assembler un appareil de ballon: fixer une aiguille de gavage à un morceau de tuyau 1/16 de pouce, puis fixer la tuyauterie à un logement de capteur de pression. Une petite seringue fixée à l'autre côté de la pression de transducer logements permettra à l'inflation et la déflation du ballon.
      1. Couper un carré de la pointe de pellicule plastique et le lieu d'une aiguille de gavage dans le centre. Enveloppez la pellicule de plastique autour de l'aiguille de gavage.
      2. Remplissez ballon avec une solution saline et attacher avec deux points de suture. Gonflez ballon pour assurer qu'il n'y a pas de fuites. Le volume de solution saline à l'intérieur du ballonnet gonflé doit être approximativement de 200 pi, mais peut varier en fonction de la taille du rat.
      3. Sinon, utilisez un lit latex de doigt à la place de la pellicule de plastique. Placez aiguille de gavage dans les doigtier, remplir avec une solution saline et attacher.

2. Récolte cœur

1. Retenez un rat Sprague Dawley utilisant un decapicone ou un autre dispositif de retenue manuel. Peser rat.
2. Administrer la kétamine / xylazine mélange (0,85 mg / kg de kétamine et 0,15 mg / kg de xylazine) par injection intrapéritonéale à anesthésier rat. Cette dose d'anesthésique fournira anesthésie suffisantes pour20-40 min, mais la procédure devrait être achevée aussi rapidement que possible après l'anesthésie est confirmée.
3. Confirmez bon degré de l'anesthésie par des tests pincement de l'orteil réflexe.
4. Trachéotomie
   1. Retirer peau à partir de mi-patte à la base de la mâchoire, en utilisant des produits hémostatiques pour élever peau et ciseaux pour faire incision. Gardez la peau élevée à séparer du muscle sous-jacent, permettant de couper le long de la fourrure et le retirer.
   2. Utilisation de pinces hémostatiques, soulevez le tissu glandulaire et de faire une incision horizontale au fascia inférieur au tissu glandulaire. Utilisez des pinces hémostatiques pour répandre incision ouverte, en prenant soin de ne pas entailler les veines jugulaires.
   3. Utilisation de pinces hémostatiques, pincée muscle recouvrant la trachée et l'aide de ciseaux font une incision transversale dans le muscle juste en dessous de la pointe des pinces hémostatiques. Utilisation de pinces hémostatiques, répartis tissu pour révéler la trachée.
   4. Insérez soigneusement hémostatiques dans la trachée, de compensation fascia tout en progressant par doucement avancer et reculer hémostatiques.
   5. Une fois hémostatiques sont placés avec succès derrière la trachée, pincez 0-0 suture de soie avec des pinces hémostatiques et hemisect la trachée avec une petite paire, de ciseaux.
   6. Insérez canule trachéale dans la trachée hemisected, tirez suture derrière la trachée, et attacher la suture autour de la trachée canule, l'ancrage de la suture à la Y-aine de la canule avec un noeud de chirurgiens.
   7. En utilisant une aiguille 27 G, injecter 1 000 U / kg d'héparine dans la veine jugulaire et laisser circuler pour 30 sec.
5. Thoracotomie
   1. Retirer fourrure provenant milieu de l'abdomen à la région mi-patte en pinçant avec pinces hémostatiques et couper avec des ciseaux.
   2. Faire un ¾ de pouce transversale incision dans la paroi musculaire abdominale, juste en dessous du diaphragme.
   3. Faire une incision verticale sur le mur de la paroi abdominale et la poitrine, coupe le long du sternum.
   4. Coupez le diaphragme retour bilatéralement, puis étaler la cage thoracique pour révéler coeur, pince cage thoracique avec des pinces hémostatiques pour assurer qu'il demeure propagation.
   5. Utilisation de pinces hémostatiques, retirez délicatement le thymus, exposer l'aorte ascendante.
   6. Taquiner hémostatiques dans la boucle de l'aorte, avancer et reculer hémostatiques et doucement propagation fascia pour permettre pointe de pinces hémostatiques travers.
   7. Utilisez des pinces hémostatiques pour tirer 0-0 soie suture derrière l'aorte ascendante, ligaturer dans un demi-carré noeud lâche.
   8. Tournez le robinet pour commencer flux de tampon de perfusion, hemisect aorte et l'insérer immédiatement la canule dans la lumière de l'aorte. Rapidement sangler un nœud de demi-carré et compléter le noeud, serrer à fond.
   9. Utilisez des ciseaux à disséquer coeur loin des gros vaisseaux, retirez le cœur de la poitrine et l'attacher à la colonne de perfusion.
   10. Coupez le tissu pulmonaire excès et permettre cœur à équilibrer sur la colonne pendant environ 15 minutes avant l'insertion de ballon. Utiliser un débit normal de tampon à travers le cœur de 10-20 ml / min.

3. perfusion de Langendorff et l'ischémie-reperfusion

1. Placement de LV préssure ballon
   1. Dégonfler ballon tout en roulant en forme de cône et tourner le robinet pour assurer ballon reste dégonflé.
   2. Accise oreillette gauche avec une petite paire de ciseaux pour exposer l'accès à la valve mitrale.
   3. Insérez ballon à travers l'oreillette gauche et la valve mitrale dans le ventricule gauche.
   4. Lancer le logiciel de surveillance de la pression (LabChart Pro).
   5. Gonflez ballon en ouvrant le robinet et doucement une quantité croissante de solution saline en ballon jusqu'à la pression diastolique de micromanomètre dépasse zéro.
   6. Pour vérifier la réponse longueur-tension, gonfler ballon lentement à une pression diastolique de 75 mmHg, dégonfler lentement, répéter une fois.
   7. Régler la pression diastolique de 10 mmHg en modulant la quantité de solution saline dans le ballon. Tournez le robinet pour sceller ballon à ce niveau de l'inflation, et de maintenir le système de pression fermée entre LV ballon et capteur de pression.
   8. Basse coeur dans la chambre de la chambre et le couvercle chauffé avec du plastique.
2. Annonceministère de l'ischémie-reperfusion
   1. Branchez le fond de la chambre chauffée et permet de remplir la chambre avec un tampon épanché.
   2. Lorsque le tampon a submergé coeur, tourner le robinet pour arrêter l'écoulement de tampon dans le cœur, induisant une ischémie globale. temps d'ischémie peut varier en fonction des objectifs de l'expérience.
   3. Après 30 min d'ischémie, tourner le robinet pour restaurer le flux de tampon dans le cœur, initiant reperfusion.
   4. Autoriser la reperfusion du coeur pendant 1 heure avant de terminer l'expérience. Utilisez des temps de reperfusion variables, en fonction des objectifs de l'expérience.
3. Résiliation de l'expérience et de récolte de tissus
   1. Utilisation du port de côté du robinet, administrer 10 ml de solution saline tamponnée phosphate à 4 ° C dans le cœur à un taux de 10 ml / min pour arrêter le coeur.
   2. Retirer le cœur de la colonne de perfusion, rogner tissu auriculaire restant.
   3. Placez coeur dans une matrice de découpage de tissu en acier inoxydable, couvrir avec Parafilm, et le lieu à -80 ° C pendant 8 minutes, ou jusqu'à ce que le coeur a une consistance de guimauve-like.
   4. Retirer le bloc du congélateur et insérer des lames de rasoir dans le tranchage matrice pour découper coeur en tranches de 2 mm. blocs de tissus peuvent également être achetés avec des tranches dimensions autres que 2 mm.
   5. Retirer les tranches une à la fois et déposez-les dans de l'azote liquide à clignoter geler pour les études biochimiques. Conserver la troisième tranche ventriculaire du sommet pour l'infarctus coloration.
   6. Retirer le tissu de l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation dans des expériences biochimiques.
4. Infarctus coloration
   1. Incuber la troisième tranche ventriculaire dans 10 ml de 1% p / v de chlorure de triphényltétrazolium (TTC) à 37 ° C pendant 15 min.
      Note: Incubation dans TTC peut être réalisée pour 15 ou 30 minutes, sans modification de ¹⁵ l'efficacité.
   2. Transfert tranche de tissu à partir de TTC à 10% de formaline tamponnée et laisser incuber à la température ambiante pendant une nuit. Pour des résultats optimaux, entendrets doivent être prises hors de formol et imagés dans les 24 heures ^4.
   3. Taché logiciel de tranche et de l'utilisation de Droits tel que ImageJ pour estimer la taille de l'infarctus selon le protocole du fabricant. Prenez des photos dès que possible après la fixation, comme le colorant va disparaître au fil du temps.

Résultats

L'appareil ventriculaire gauche ballon permet un suivi en temps réel de la pression développée par le pouvoir ventricule gauche (Figure 1). Comme décrit précédemment ^7, cette trace de pression peut être utilisée pour calculer un grand nombre de paramètres de la fonction ventriculaire. Ces calculs peuvent être effectués dans la phase initiale, ainsi que la phase de reperfusion, moyennées sur plusieurs traces à l'intérieur de chaque groupe, et on les compare afin de déter...

Discussion

Le coeur de rat isolé perfusé peut être utilisé avec succès pour étudier l'effet de l'intervention pharmacologique sur préconditionnement cardiaque dans l'ischémie reperfusion ^9. Cependant, il ya certaines étapes essentielles de la procédure qui doit être normalisée afin d'assurer des résultats reproductibles. Le maintien d'une température de 37,4 ° C dans le système est critique, car même une légère hypothermie et l'hyperthermie peuvent provoquer préconditionnement...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8