Индукция и оценка ишемии-реперфузии в Лангендорфа-перфузии сердца крыс

Резюме

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Аннотация

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Введение

Выяснение событий, лежащих в основе сердечной ответ на оба ишемии и реперфузии имеют важное значение в улучшении лечения инфаркта миокарда и сердечной ¹ хирургических процедур, которые требуют пережатия аорты ^2. В то время как модели в естественных условиях ишемии реперфузионного повреждения позволяют очень полезный анализ конечной точки, они не столь эффективны для изучения функциональных последствий ишемии реперфузионного повреждения остро в режиме реального времени. Кроме того, в естественных условиях модели ишемии реперфузии обычно производят значительное изменчивость размера инфаркта, и прямые поставки препарата к сердцу во время реперфузии является сложной задачей. Использование сердечного системы Лангендорфа изолированы для изучения ишемии реперфузии позволяет в реальном времени функциональной оценки фармакологической терапии, равномерной площади инфаркта ткани и мгновенной доставки лекарственного средства непосредственно к миокарду.

Впервые описан бу Оскара Лангендорфа в 1895 ^3, Лангендорфа изолированные сердце надежный моделью для изучения ишемии реперфузии, что оно использовалось в ишемии реперфузии исследований за последние 40 лет ^4,5. Вот некоторые изменения сделаны для оптимизации изолированного сердца для функционального анализа. В месте пункции аорты, а сердце бьется гарантирует, что сердце не испытывать ишемический предварительной подготовки, которая бы изменить результаты ишемии реперфузии испытаний ^6. Чтобы облегчить это, трахеотомия выполняется, позволяя вентиляции и обеспечения физиологической стабильности крысы во время операции. Сердце затем прикрепляется к водяной рубашкой спиральной стеклянную колонку, через которую Кребса Хенселейта буфер доставляется по ретроградной перфузии непосредственно в аорту. Солевой раствор на баллон, заполненный вставлен в левый желудочек и прикреплен к датчику давления, который позволяет в режиме реального времени измерения давления внутри желудочка ANд расчет нескольких функциональных параметров. По завершении эксперимента, сердца промывают холодной солевой раствор, чтобы задержать сжатие и мгновенно замораживали в жидком азоте, чтобы позволить потоку анализ ДНК, РНК и белка уровней. Таким образом изменен, Лангендорфа перфузии сердца служит эффективной системы прямого мониторинга физиологического эффекта фармакологических вмешательств в любое время остро во время ишемии реперфузии.

протокол

Все процедуры, перечисленные здесь были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в институциональная в Медицинском университете Южной Каролины. Эксперименты, описанные здесь, являются острые, эксперименты, не выживания. Таким образом, нет никакой пользы глазной мази и стерильные операционные люкс не требуется. Эвтаназии достигается путем обескровливания при уборке сердца.

1. Экспериментальная Подготовка

1. Установите или постоянное давление или постоянная потока Лангендорфа перфузии устройства ^4.
2. Подготовьте 4 л модифицированного Krebs Хенселейта буфера (в мм: 112 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgSO _4, 1 K ₂ HPO _4, 1,25 CaCl _2, 25 NaHCO _3, 11 D-глюкозы, 0,2 октановой кислоты, рН = 7,4).
   1. Сделать 10x акции буферов.
      1. Растворите NaCl, KCl, _MgSO4 и K ₂ HPO ₄ в 3 л воды высшей степени очистки.
      2. Растворите CaCl ₂ в 500 мл сверхчистой воды Wiго по 40 мл 1 н HCl.
      3. Медленно добавить раствор CaCl ₂ в буфер, сделанные в 1.2.1.1. Добавьте достаточно сверхчистой воды с всего 4 L. Разрешить перемешивают в течение 1 ч перед фильтрацией через фильтр 0,8 мкм. Хранить при 4 ° С.
      4. Растворите NaHCO ₃ в 4 л воды высшей степени очистки. Разрешить перемешивают в течение 1 ч перед фильтрацией через 0,8 мкм фильтр. Хранить при 4 ° С
   2. Комбинат 400 мл 10x Кребса Henseleit буфер 400 мл 10x NaHCO ₃ буфера. Добавьте достаточно воды, чтобы сверхчистого Всего 4 L. Растворите глюкозу и кислоты октановую при перемешивании. Фильтр по 0,8 мкм фильтр.
3. Подготовка системы к сердцу.
   1. Добавить 2 л фильтрованной буфером до 4 л бутылки помещают в 38 над запорным краном, прикрепленной к аорты канюли. Это обеспечит давление перфузии 70-80 мм рт.ст. к сердцу, что рекомендованное давление перфузии ^4.
   2. Вставка для диспергирования газа барботер в буфер в бутылке.
   3. Запуск буфер через систему, будучи уверенным, чтобы устранить любые пузыри изнутри трубы.
   4. Включите газа (95% O _2/5% CO ₂₎ по крайней мере, за 30 мин до сердца должен быть размещен в системе. Используйте зонд потока газа и газоанализатор крови, чтобы проверить насыщение кислородом.
4. Подготовка хирургические материалы и воздушный шар.
   1. Для уборки сердца, подготовить одну пару 6,75 "хирургическими ножницами, одну пару 4,5" ножницы, две пары кровоостанавливающих, два набора щипцов, карамельный Два шприцы с иглами 27 G, 2 части 0-GUAGE шелковой нити (около 15 см в длину), один 1/16 дюйма колючей канюли, и один трахеи канюли.
   2. Чтобы собрать трахеи канюли, клей короткий кусок 1/16 дюйма диаметр пластиковой трубки к Y-разъем.
   3. Чтобы собрать шар аппарат: приложите через зонд иглу с куском 1/16 дюйма трубки, затем приложите трубку к корпусу датчика давления. Небольшой шприц прикреплен к другой стороне TR давленияansducer жилья позволит инфляции и дефляции баллона.
      1. Вырезать квадрат полиэтиленовой пленкой и место кончике иглы через зонд в центре. Оберните полиэтиленовой пленкой вокруг зондового иглы.
      2. Заполните шар с физиологическим раствором и галстук с двумя швами. Накачать шар, чтобы убедиться в отсутствии утечек. Объем физиологического раствора в надутого воздушного шара должно быть около 200 мкл, но может варьироваться в зависимости от размера крысы.
      3. Кроме того, используйте латекс палец кроватки в месте пластиковой пленкой. Поместите иглу через зонд в палец кроватки, залейте раствором и галстук.

2. Урожай сердце

1. Задержите крысу Спрэг Dawley, используя decapicone или другое устройство ручной сдержанность. Взвесьте крысы.
2. Администрирование кетамин / ксилазин смеси (0,85 мг / кг кетамина и 0,15 мг / кг ксилазина) с помощью внутрибрюшинной инъекции для анестезии крыс. Эта доза анестетика обеспечит достаточные для анестезии20-40 мин, но процедура должна быть завершена как можно быстрее после анестезии подтверждается.
3. Подтвердите должной степени анестезии путем тестирования пальца щепоткой рефлекса.
4. Трахеотомия
   1. Удалить шкуру с середины передней лапы до основания челюсти, используя кровоостанавливающих поднять шкуру и ножницы, чтобы сделать разрез. Держите шкурку повышенной отделить его от основной мышцы, позволяя сократить по шкуре и снимите его.
   2. Использование кровоостанавливающих, поднимите железистой ткани и сделать горизонтальный разрез в фасции уступает железистой ткани. Используйте кровоостанавливающих распространяться разрез открытым, стараясь не ник яремной вены.
   3. Использование кровоостанавливающих, щепотка мышцы вышележащих трахеи и с помощью ножниц сделать поперечный разрез в мышце чуть ниже кончика кровоостанавливающих. Использование кровоостанавливающих, распространение ткань на части, чтобы раскрыть трахеи.
   4. Осторожно вставьте кровоостанавливающих под трахеи, очистка фасции, а прогрессирует, осторожно вперед и втягивания кровоостанавливающих.
   5. После кровоостанавливающих успешно размещены позади трахеи, щепотка 0-0 шелковый шов с кровоостанавливающих и hemisect трахеи с небольшим, острой парой ножниц.
   6. Вставьте трахеи канюли в трахее hemisected, тянуть нить за трахеи и связать нить вокруг канюлированного трахеи, закрепления шва в Y-пах канюли с хирургами узел.
   7. С помощью иглы 27 G, вводят 1000 ЕД / кг гепарина в яремную вену и позволяют распространить в течение 30 сек.
5. Торакотомия
   1. Удалить шкуру с середины живота к середине передней лапы области, зажимая с кровоостанавливающих и резки с ножницами.
   2. Сделайте ¾ дюйма поперечный разрез в брюшной стенке мышечной, чуть ниже диафрагмы.
   3. Сделайте вертикальный разрез до брюшной стенки и грудной стенки, резки вдоль грудины.
   4. Вырезать диафрагму назад на двусторонней основе, затем распространилась грудную клетку, чтобы выявить сердце, зажим грудную клетку с кровоостанавливающих чтобы убедиться, что он остается распространение.
   5. Использование кровоостанавливающих, аккуратно удалите тимус, обнажая восходящую аорту.
   6. Дразнить кровоостанавливающих через аорты петли, продвижении и втягивания кровоостанавливающих и осторожно распространяя фасции, чтобы кончик кровоостанавливающих через.
   7. Используйте кровоостанавливающих тянуть 0-0 шелковый шов за восходящей аорты, галстук шов в свободную половину квадратных узла.
   8. Поверните кран, чтобы начать поток перфузии буфера, hemisect аорты и сразу вставить канюли в просвет аорты. Быстро подпруга половину квадратных узел и завершить узел, затянув тщательно.
   9. Используйте ножницы, чтобы рассекать сердце от больших сосудов, удалить сердце из груди и приложить к колонке перфузии.
   10. Обрезать излишки ткани легких и позволить, чтобы уравновесить сердца на колонке в течение 15 мин до введения баллона. Использование нормальную скорость потока буфера через сердце 10-20 мл / мин.

3. Лангендорфа перфузии и ишемии реперфузии

1. Размещение предварительно LVssure шар
   1. Выпустите шарик при прокатке в форме конуса и повернуть кран, чтобы обеспечить воздушный шар остается спущенный.
   2. Акцизный левого предсердия с небольшим ножницами, чтобы разоблачить доступ к митрального клапана.
   3. Вставьте шар через левое предсердие и митрального клапана в левый желудочек.
   4. Начните программное обеспечение для мониторинга давления (LabChart Pro).
   5. Накачать шар, открыв кран и аккуратно увеличивая количество физиологического раствора в воздушном шаре, пока диастолическое давление чтение микроманометром больше нуля.
   6. Чтобы проверить реакцию длины натяжения, надуть воздушный шар медленно диастолического давления 75 мм рт.ст., выкачать медленно, повторяю еще.
   7. Установка диастолическое давление до 10 мм ртутного столба, модулируя количество физиологического раствора в баллоне. Поверните кран, чтобы запечатать воздушный шар на этом уровне инфляции, и поддерживать систему замкнутого давления между ЛЖ и воздушном шаре датчика давления.
   8. Нижняя сердце в нагретую камеру и крышкой камеры с пластиком.
2. Объявлениеслужение ишемии реперфузии
   1. Вставьте нижнюю часть нагретой камере и позволяет камере, чтобы заполнить буфер изливаемой.
   2. Когда буфер погружен сердце, включите кран, чтобы остановить поток буфера в сердце, вызывая глобальное ишемии. Время ишемии может варьироваться в зависимости от целей эксперимента.
   3. Через 30 мин ишемии, повернуть кран, чтобы восстановить поток буфера в сердце, начала реперфузии.
   4. Разрешить реперфузии сердца в течение 1 ч до прекращения эксперимента. Используйте переменные раз реперфузии, в зависимости от целей эксперимента.
3. Прекращение эксперимента и сбор урожая ткани
   1. Использование боковой порт краном, администрирование 10 мл фосфатно-буферного раствора при 4 ° С в сердце со скоростью 10 мл / мин, чтобы остановить сердце.
   2. Удалить сердце из колонки перфузии, обрежьте остальные предсердия ткани.
   3. Поместите сердце в нержавеющей стали ткани нарезки матрицы, накрыть Паrafilm, и место при -80 ° С в течение 8 мин, или пока сердце имеет консистенцию зефира, как.
   4. Удалить блок из морозильника и вставьте бритвы в матрицу нарезки нарезать сердце в 2 ломтика мм. Тканевые блоки также могут быть приобретены с другими, чем 2 мм размеров срезов.
   5. Удалить ломтиками по одному и падение в жидкий азот, чтобы заморозить мигать для биохимических исследований. Сохранение третий желудочка ломтик от вершины для окрашивания инфаркта.
   6. Удалите ткань из жидкого азота и хранят при -80 ° С до использования в биохимических экспериментов.
4. Инфаркт Окрашивание
   1. Инкубируйте третий кусочек желудочка в 10 мл 1% вес / объем хлорида трифенилтетразолинхлорида (TTC) при 37 ° С в течение 15 мин.
      Примечание: Инкубационный в ТТС может быть выполнена в течение 15 или 30 мин без изменения эффективности ^15.
   2. Передача ткани кусочек от TTC до 10% забуференном формалине и позволяют инкубировать при комнатной температуре в течение ночи. Для получения оптимальных результатов, слышатьTS должны быть вывезены из формалина и отображаемого в течение 24 часов ^4.
   3. Фотография окрашенных кусочек и использование программного обеспечения, таких, как ImageJ оценить размер инфаркта в соответствии с протоколом производителя. Фотографировать, как можно скорее после фиксации, а краска будет исчезать с течением времени.

Результаты

Желудочка баллон аппарат левой позволяет мониторинга в режиме реального времени в разработанной заказчиком левого желудочка (рис 1) давления. Как описано выше ^7, это давление трассировки может быть использован для вычисления многих параметров функции левого желудочка. ?...

Обсуждение

Изолированных перфузии сердца крысы могут быть успешно использованы для изучения влияния фармакологического вмешательства на сердечную предварительной ишемии реперфузии ^9. Тем не менее, существуют некоторые существенные шаги по процедуре, которые должны быть стандартизирова?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8