Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Zusammenfassung

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Zusammenfassung

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Einleitung

Aufklärung der Ereignisse des Herz Reaktion auf sowohl Ischämie und Reperfusion zugrunde liegen weiter zu verbessern die Behandlung von Herzinfarkt und Herz ¹ operative Eingriffe, die Aorten-Querspann ² erfordern. Während in vivo Modellen von Ischämie-Reperfusionsverletzung ermöglichen sehr nützlich Endpunktanalyse, sind sie nicht so wirksam für die Untersuchung der funktionellen Auswirkungen von Ischämie-Reperfusionsverletzung akut in Echtzeit. Zusätzlich kann in vivo Ischämie-Reperfusion-Modelle erzeugen im Allgemeinen zu signifikanten Schwankungen in der Infarktgröße und die direkte Abgabe von Arzneimittel an das Herz zum Zeitpunkt der Reperfusion ist eine Herausforderung. Die Verwendung einer Langendorff-Herzen isoliert System für die Untersuchung ischämischen Reperfusionsschäden ermöglicht Echtzeit-funktionelle Bewertung der pharmakologischen Behandlungen, gleichmäßige Flächen infarzierten Gewebe und momentane Abgabe von Arzneimittel direkt in den Herzmuskel.

Zuerst beschrieben by Oscar Langendorff 1895 ³ ist der Langendorff-Herz isoliert ein robustes Modell für die Untersuchung ischämischen Reperfusionsschäden, nachdem er in Ischämie-Reperfusion Forschung für den letzten 40 Jahren ^4,5 verwendet. Hier werden einige Modifikationen vorgenommen, um das isolierte Herz zur Funktionsanalyse zu optimieren. In situ Kanülierung der Aorta, während das Herz schlägt, wird sichergestellt, dass das Herz nicht ischämischen Präkonditionierung, die die Ergebnisse der Ischämie-Reperfusion den Versuchen ⁶ verändern würden auftreten. Um dies zu erleichtern, wird ein Luftröhrenschnitt durchgeführt, so dass Belüftung und gewährleisten physiologische Stabilität der Ratte während der Operation. Das Herz wird dann auf eine Glaswassermantel spiral Säule, durch die Krebs-Henseleit-Puffer wird durch retrograde Perfusion direkt in die Aorta geliefert befestigt. Eine Kochsalzlösung gefüllten Ballon wird in den linken Ventrikel eingeführt und mit einem Druckwandler, der für die Echtzeit-Messung von Drücken von innerhalb der Herzkammer ein ermöglicht befestigtd Berechnung mehrerer funktioneller Parameter. Am Ende des Experiments wird das Herz mit kalter Kochsalzlösung gespült, um die Kontraktion und in flüssigem Stickstoff eingefroren, um Downstream-Analyse von DNA, RNA und Protein-Ebene ermöglichen verhaften. So modifizierte, dient der Langendorff-perfundierten Herzen als ein wirksames System für die direkte Überwachung der physiologischen Wirkung von pharmakologische Interventionen zu jeder Zeit während des akut ischämischen Reperfusionsschäden.

Protokoll

Alle hier aufgeführten Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Medizinischen Universität von South Carolina genehmigt. Die hier beschriebenen Experimente sind akute, nicht-Überlebensexperimente. Als solche gibt es keine Verwendung von Augensalbe und eine sterile OP-Bereich nicht erforderlich ist. Sterbehilfe wird durch Ausbluten bei der Ernte des Herzens erreicht.

1. Versuchsvorbereitung

1. Bis entweder einen konstanten Druck oder konstanten Fluss Langendorff Perfusion ⁴ Stellen.
2. Herstellung von 4 L modifizierte Krebs-Henseleit-Puffer (in mM: 112 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgSO _4, 1 K ₂ HPO _4, 1,25 CaCl _2, 25 NaHCO _3, 11 D-Glucose, 0,2 Octansäure, pH = 7,4).
   1. Machen 10x stock Puffer.
      1. Aufzulösen NaCl, KCl, MgSO ₄ und K ₂ HPO ₄ in 3 L Reinstwasser.
      2. Löse CaCl ₂ in 500 ml Reinstwasser with 40 ml 1 N HCl.
      3. Langsam _{CaCl2-Lösung} in den Puffer in 1.2.1.1 vorgenommen. Fügen Sie genug hochreinem Wasser auf insgesamt 4 L. Lassen Sie für 1 Stunde vor dem Filtrieren durch ein 0,8 um Filter zu rühren. Lagerung bei 4 ° C.
      4. Löse NaHCO ₃ in 4 L Reinstwasser. Man lässt 1 h, bevor es durch einen Filter an 0,8 um-Filter rühren. Lagerung bei 4 ° C
   2. Kombinieren Sie 400 ml 10x Krebs Henseleit-Puffer mit 400 ml 10x _{NaHCO3-Puffer.} Fügen Sie genug hochreinem Wasser auf insgesamt 4 L. auflösen Glukose und Oktansäure unter Rühren. Man filtriert durch 0,8-um-Filter.
3. Bereiten System für Herz.
   1. In 2 l gefiltert Puffer zu einem 4-l-Flasche 38 in platziert über dem Hahn an die Aortenkanüle angebracht. Dadurch wird ein Perfusionsdruck von 70-80 mmHg in das Herz, die die empfohlene Perfusionsdruck ⁴ zu liefern.
   2. Legen Gasdispersions bubbler in den Puffer in der Flasche.
   3. Führen Sie den Puffer durch das System, dass auf jeden Fall alle Blasen aus dem Inneren der Rohrleitung zu beseitigen.
   4. Einzuschalten Gas (95% O _2/5% CO ₂₎ mindestens 30 min vor Herz ist auf dem System platziert werden. Verwenden Sie ein Gasstrom-Sonde und Blutgasanalysegerät, um die Sauerstoffsättigung zu überprüfen.
4. Bereiten chirurgisches Material und Ballon.
   1. Für die Ernte von Herz, bereiten ein Paar von 6,75 "chirurgische Schere, ein Paar von 4.5" Schere, zwei Paare von Hämostatika, zwei Sätze von Karamellenmalz Zange zwei Spritzen mit 27 G Nadeln, 2 Stück von 0-Gauge-Seidenfaden (ca. 15 cm in der Länge), einer 1/16 inch Stacheldraht Kanüle und eine Trachealkanüle.
   2. Um Trachealkanüle montieren, kleben Sie ein kurzes Stück von 1/16 Zoll Durchmesser Kunststoffschlauch mit einem Y-Verbinder.
   3. Um Ballongerät montieren: fügen Sie eine Sondennadel an ein Stück 1/16 Zoll Schlauch, dann bringen Sie Schlauch an Druckwandlergehäuse. Eine kleine Spritze zu der anderen Seite des Druck tr befestigtansducer Gehäuse wird Aufblasen und Entleeren des Ballons zu ermöglichen.
      1. Schneiden Sie ein Quadrat der Plastikverpackung und Platz Spitze einer Magensonde Nadel in der Mitte. Wickeln Sie die Plastikfolie um die Sondennadel.
      2. Füllen Ballon mit Kochsalzlösung und binden mit zwei Nähten. Blasen Sie Ballon, um sicherzustellen, keine Lecks vorhanden sind. Das Volumen der Salzlösung innerhalb des aufgeblasenen Ballons sollte ungefähr 200 & mgr; l, kann aber abhängig von der Größe der Ratte variieren.
      3. Alternativ können Sie einen Latex Fingerling anstelle der Plastikfolie. Platzieren Sie eine Magensonde Nadel innerhalb Fingerling, füllen mit Kochsalzlösung und Krawatte ab.

2. Ernte das Herz

1. Restrain eine Sprague Dawley-Ratte mit einem decapicone oder andere manuelle Rückhaltevorrichtung. Wiegen Ratte.
2. Verabreichen Ketamin / Xylazin-Mischung (0,85 mg / kg Ketamin und 0,15 mg / kg Xylazin) durch intraperitoneale Injektion an Ratten anästhesiert. Diese Dosis des Anästhetikums ausreichend für Anästhesie liefern20-40 min, aber das Verfahren sollte möglichst schnell nach der Narkose wird bestätigt, durchgeführt werden.
3. Bestätigen richtigen Grad der Anästhesie durch Tests toe Prise Reflex.
4. Tracheotomie
   1. Entfernen pelt von Mitte Vorderpfote auf Basis des Kiefers, mit Gefäßklemmen, um Fell und Schere zu erheben, um Einschnitt zu machen. Halten Sie das Fell angehoben, um es von der darunter liegenden Muskeln zu trennen, so dass man auf dem Fell schneiden und entfernen.
   2. Verwendung hemostats, heben Drüsengewebe und machen einen horizontalen Schnitt in Faszie schlechter als das Drüsengewebe. Verwenden hemostats zu Einschnitt spreizt, kümmert sich nicht um nick die Halsvenen.
   3. Verwendung Hämostaten pinch Muskeldarüberliegenden Luftröhre, und mit einer Schere einen Quereinschnitt im Muskel genau unter der Spitze der Hämostatika. Verwendung hemostats, verbreiten Gewebe auseinander, um die Luftröhre zu offenbaren.
   4. Gefäßklemmen vorsichtig unter Luftröhre, Clearing Faszie, während voran durch leichtes Vor- und Zurück hemostats.
   5. Sobald hemostats erfolgreich hinter der Luftröhre gelegt, kneifen 0-0 Seidennaht mit Gefäßklemmen und hemisect die Luftröhre mit einem kleinen, scharfen Schere.
   6. Legen Trachealkanüle in die Trachea hemiseziert, ziehen Naht hinter der Luftröhre, und binden Sie den Faden um die Kanüle eingeführt Luftröhre, die Verankerung des Nahtmaterials zu der Y-Leiste der Kanüle mit einem Chirurgen Knoten.
   7. Unter Verwendung einer 27 G Nadel injizieren 1.000 U / kg Heparin in die Halsschlagader und lassen Sie sie für 30 Sekunden zu zirkulieren.
5. Thorakotomie
   1. Entfernen pelt von Mitte Bauch bis Mitte Vorderpfote Region durch Kneifen mit Gefäßklemmen und Schneiden mit einer Schere.
   2. Machen Sie eine ¾-Zoll-Quereinschnitt in die Bauchmuskelwand, direkt unterhalb des Zwerchfells.
   3. Machen Sie eine vertikale Inzision bis die Bauchdecke und Brustwand, Schneiden entlang dem Brustbein.
   4. Schneiden Sie die Blende wieder auf bilateraler Ebene, dann verbreiten Brustkorb zu Herzen, Klemmbrustkorb mit Gefäßklemmen, um sicherzustellen, bleibt es verbreitet zu offenbaren.
   5. Verwendung hemostats, entfernen Sie vorsichtig Thymus, Aussetzen der aufsteigenden Aorta.
   6. Necken hemostats durch Aorten-Schleife, Vorschieben und Zurückziehen hemostats und sanft Verbreitung Faszie zu Spitze Gefäßklemmen ermöglichen durch.
   7. Verwenden hemostats zu 0-0 Seidennaht hinten aufsteigenden Aorta zu ziehen, binden Naht zu einem lockeren Halb quadratischen Knoten.
   8. Schalten Hahn, um den Fluss von Perfusionspuffer, hemisect Aorta beginnen und sofort legen Kanüle in Aortenlumen. Schnell cinch eine Halbkreuzknoten und füllen Sie die Knoten, Anziehen gründlich.
   9. Mit einer Schere Herzen weg von den großen Gefäßen zu sezieren, Herz aus der Brust zu entfernen und um die Perfusion Spalte.
   10. Abschneiden von überschüssigem Lungengewebe und lassen Herz auf der Säule für etwa 15 min vor dem Einsetzen des Ballons äquilibrieren. Verwenden Sie einen normalen Durchflussrate von Puffer durch das Herz von 10-20 ml / min.

3. Langendorff-Perfusion und Ischämie-Reperfusionsverletzung

1. Platzierung der LV vorssure Ballon
   1. Lassen Sie die Luft Ballon beim Rollen in eine Kegelform und schalten Hahn, um sicherzustellen, Ballon bleibt entleerten.
   2. Excise linken Vorhof mit einer kleinen Schere, um den Zugang zu Mitralklappe aussetzen.
   3. Legen Ballon durch linken Vorhof und Mitralklappe in den linken Ventrikel.
   4. Startdruck-Monitoring-Software (LabChart Pro).
   5. Blasen Sie Ballon durch Öffnen Absperrhahn und sanft zunehmende Menge an Kochsalzlösung in Ballon, bis der diastolische Druck Lesung aus Mikromanometer Null übersteigt.
   6. Auf Länge-Spannung Antwort überprüfen, aufblasen Ballon langsam zu einer diastolischen Druck von 75 mmHg, entleeren langsam, einmal zu wiederholen.
   7. Eingestellt diastolische Druck 10 mmHg durch Modulieren der Menge von Salzlösung in den Ballon. Schalten Hahn zu Ballon auf diesem Niveau der Inflation zu versiegeln und zu pflegen geschlossenen Drucksystem zwischen LV Ballon und Druckwandler.
   8. Unteren Herzkammer in die erhitzt und Abdeckung mit Kunststoffkammer.
2. AnzeigeDienst der Ischämie-Reperfusionsverletzung
   1. Stecker die Unterseite der erwärmten Kammer und erlauben Kammer mit ergossenen Puffer zu füllen.
   2. Als Puffer Herzen unter Wasser, drehen Hahn, den Fluss von Puffer in das Herz zu stoppen, zu induzieren globale Ischämie. Ischämie Zeit kann je nach den Zielen des Experiments variieren.
   3. Nach 30 Minuten der Ischämie, schalten Hahn, um die Strömung des Puffers in das Herz wiederherzustellen, Initiierung der Reperfusion.
   4. Lassen Sie Reperfusion des Herzens für 1 h vor Beendigung des Experiments. Verwenden variable Reperfusion Zeiten, abhängig von den Zielen des Experiments.
3. Kündigung Experiment und Ernten von Tissue
   1. Verwendung Seitenöffnung des Absperrhahns verabreichen 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung bei 4 ° C in das Herz mit einer Rate von 10 ml / min, um das Herz anzuhalten.
   2. Herz entfernen Perfusion Spalte wegschneiden restlichen Vorhofgewebe.
   3. Zeigen Herz in einen Edelstahlgewebe Schneidematrix, Deckel mit Parafilm und Stelle bei -80 ° C für 8 Minuten, oder bis das Herz hat einen Marshmallow artige Konsistenz.
   4. Entfernen Block vom Gefrierschrank und legen Sie in Rasierklingen schneiden Matrix zu Herzen in 2 mm dicke Scheiben schneiden. Gewebeblöcke können auch mit anderen als 2 mm Scheibe Größen erworben werden.
   5. Scheiben entfernen ein zu einer Zeit und fallen in flüssigem Stickstoff auf Blitzeis für biochemische Untersuchungen. Bewahren Sie den dritten Ventrikel Scheibe von der Spitze zur Infarkt Färbung.
   6. Entfernen Gewebe aus flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Verwendung in biochemischen Experimenten.
4. Infarkt-Färbung
   1. Inkubieren des dritten ventrikulären Scheibe in 10 ml 1% w / v Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) bei 37 ° C für 15 min.
      Anmerkung: Die Inkubation in TTC kann für 15 oder 30 Minuten bei unveränderter Wirksamkeit ¹⁵ durchgeführt werden.
   2. Übertragen Gewebeschnitt von TTC zu 10% Formalin und lassen Sie sie bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Für optimale Ergebnisse zu hörents sollte von Formalin aufgenommen und innerhalb von 24 Stunden ⁴ abgebildet werden.
   3. Fotografie Buntscheibe und Verwendung Software wie ImageJ zu Infarktgröße schätzen, nach dem Protokoll des Herstellers. Fotografieren so bald wie möglich nach der Fixierung, da der Farbstoff im Laufe der Zeit verblassen.

Ergebnisse

Die linke Kammerballon Vorrichtung ermöglicht eine Echtzeitüberwachung des Drucks durch den Auftraggeber linken Ventrikel (Abbildung 1) entwickelt. Wie zuvor ⁷ beschrieben, kann diese Druckspur verwendet, um viele der Parameter der Herzfunktion zu berechnen. Diese Berechnungen können in der Basisphase als auch der Reperfusionsphase gemacht werden, gemittelt über mehrere Spuren in jeder Gruppe, und verglichen, um zu bestimmen, ob die pharmakologische Intervention ergab Herz Vorbehandlung, ...

Diskussion

Isoliert perfundierten Rattenherzen erfolgreich eingesetzt werden kann, um die Wirkung von pharmakologischen Intervention Herz Präkonditionierung Reperfusionsverletzung ⁹ untersuchen. Es gibt jedoch einige wesentliche Schritte der Prozedur, die um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten standardisiert werden müssen. Aufrechterhalten einer Temperatur von 37,4 ° C innerhalb des Systems ist entscheidend, denn auch milder Hypothermie und Hyperthermie kann Herz Präkonditionierung ^10,11 führen....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8