Langendorff-perfüze sıçan Hearts indüksiyon ve İskemi-reperfüzyon Hasarı Değerlendirilmesi

Özet

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Özet

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Giriş

Hem iskemi ve reperfüzyon kardiyak tepkiyi altında yatan olaylar izahı aort kros-sıkma ^2. gerektiren miyokard infarktüsü ¹ ve kardiyak cerrahi işlemlerin tedavi geliştirilmesi esastır. Iskemi reperfüzyon hasarının in vivo modelleri, çok kullanışlı bir son nokta analizi sağlarken, gerçek zamanlı olarak, akut iskemi reperfüzyon hasarının fonksiyonel etkilerinin araştırılması için etkili değildir. In vivo iskemi reperfüzyon modelleri genellikle reperfüzyon sırasında infarkt önemli değişkenlik ve kalbe ilacın doğrudan teslim üretmek içinde Ayrıca, zordur. iskemi reperfüzyon hasarının incelenmesi için bir Langendorff izole kalp sisteminin kullanımı, farmakolojik tedaviler, enfarkte doku tek biçimli alan ve doğrudan miyokarda ilacın anlık teslimat gerçek zamanlı fonksiyonel değerlendirmesi için izin verir.

İlk b'deki^{1895, 3} y Oscar Langendorff, Langendorff izole kalp son 40 yıl ^4,5 için iskemi reperfüzyon araştırmalarında kullanılan edilerek, iskemi reperfüzyon hasarı incelemek için sağlam bir modeldir. Burada, bazı değişiklikler fonksiyonel analiz için izole kalbi optimize etmek için yapılır. Aortun yerinde kanülasyon kalp kalpte iskemi reperfüzyon çalışmaların ⁶ sonuçlarını değiştirecek iskemik önkoşullanma, tecrübe etmediğini garanti iken. Bunu kolaylaştırmak için, bir traketomi havalandırma sağlayan ve ameliyat sırasında sıçan fizyolojik istikrarın sağlanması gerçekleştirilir. Bundan sonra, kalp, Krebs Henseleit tamponu aort içine doğrudan retrograd perfüzyon yoluyla teslim edildiği bir cam su ceketli sarmal kolonuna bağlanmıştır. Bir tuzlu su dolu balon sol ventrikül içerisine eklenen ve ventrikül An içinden baskıların gerçek zamanlı ölçümüne izin veren bir basınç transdüktörüne, bağlı olduğuBirden fazla fonksiyonel parametreler d hesaplanması. Deneyin sonunda, kalp kasılma ve DNA, RNA ve protein seviyeleri alt analiz sağlamak için sıvı azot içinde dondurulmuş flaş tutulması için bir soğuk tuzlu su ile yıkanır. Böylece değiştirilmiş, Langendorff perfüze kalp iskemi reperfüzyon hasarı sırasında akut herhangi bir zamanda farmakolojik müdahalelerin fizyolojik etkisinin direkt izlenmesi için etkili bir sistem olarak hizmet vermektedir.

Protokol

Burada listelenen tüm işlemler Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Burada tarif edilen deneyler, akut, hayatta olmayan deneylerdir. Bu nedenle, var göz merhemi hiçbir kullanımı ve steril bir çalışma paketi gerekli değildir. Ötanazi kalbin hasat sırasında eksanguinasyon yoluyla elde edilir.

1. Deneysel hazırlanması

1. Sabit bir basınç veya sabit akış Langendorff perfüzyon Aparatı ⁴ ya ayarlayın.
2. Tadil edilmiş bir Krebs Henseleit tamponu 4 L hazırlayın (mM olarak: 112 NaCl, 5 KCl, 1.2 MgSO _4, 1 K ₂ HPO _4, 1.25 _CaCl2, 25 NaHCO _3, 11 D-glikoz, 0.2 oktanoik asit, pH = 7.4).
   1. 10x stok tamponlar olun.
      1. 3 L'lik, aşırı saf su içinde NaCI, KCI, MgSO ₄ ve K ₂ HPO ₄ eritin.
      2. 500 ml ultra saf su wi CaCl ₂ çözülür1 N HCI, 40 ml inci.
      3. Yavaşça 1.2.1.1 yapılan tampon _CaCl2 çözüm ekleyin. 4 L. toplam kadar ultra-saf su ilave bir 0.8 um'lik bir filtreden filtre edilmeden önce 1 saat boyunca karışmaya bırakın. 4 ° C'de saklayın.
      4. 4 L ultra saf su içinde NaHCO ₃ eritin. 0.8 um filtre ile süzülmeden önce 1 saat boyunca karışmaya bırakın. Mağaza 4 ° C'de
   2. 400 ml 10x NaHCO ₃ tamponla 400 ml 10x Krebs Henseleit tampon birleştirin. Karıştırılırken glikoz ve oktanoik asit içinde çözündürülür 4 L. toplam kadar ultra-saf su ilave edilir. 0.8 um'lik bir filtreden filtre.
3. Kalp için sistem hazırlayın.
   1. 4 L'lik bir şişeye süzüldü tampon 2 L ekleme aort kanülüne bağlanmış vana yukarıda 38 yerleştirilir. Bu, önerilen perfüzyon basıncı ⁴ olan kalp, 70-80 mmHg perfüzyon basıncını teslim edecek.
   2. Şişede tampon içine gaz dağıtım bubbler yerleştirin.
   3. Boru içinden kabarcıkları ortadan kaldırmak için emin olmak, sistem üzerinden tampon çalıştırın.
   4. Kalp sistemi yerleştirilmesi için önce gaz (% 95 O ₂ /% 5 CO ₂₎ en az 30 dakika açın. Oksijen doygunluğu doğrulamak için bir gaz akış probu ve kan gazı analizörü kullanın.
4. Cerrahi malzemeleri ve balon hazırlayın.
   1. Kalbin hasat için 6.75 bir çift "cerrahi makas, 4.5 bir çift" makas, 27 G iğne, 0-guage ipek sütür 2 adet (yaklaşık 15 hemostat iki çift, caramalt forseps iki takım, iki şırınga hazırlamak cm uzunluğunda), bir 1/16 inç dikenli kanülü, bir trakeal kanül.
   2. Trakeal kanül monte etmek için, Y-konnektörüne 1/16 inç çaplı plastik boru kısa bir parça yapıştırıcı.
   3. Balon cihazı monte etmek için: 1/16 inç boru parçasına bir gavaj iğne takılır, daha sonra basınç dönüştürücü konut hortumu takmak. Basınç tr diğer tarafına bağlı küçük bir şırıngaansducer konut balonu şişmesini ve sönmesini sağlayacaktır.
      1. Merkezinde sonda iğne plastik wrap ve yer ucunun bir kare kesin. Gavaj iğnenin etrafına plastik wrap sarın.
      2. Tuzlu su ile balon doldurun ve iki dikiş ile kapalı kravat. Herhangi bir sızıntı olmadığından emin olmak için balonu şişirin. şişirilmiş balon içindeki tuzlu su hacmi yaklaşık 200 ul olmalıdır, ancak sıçan büyüklüğüne bağlı olarak değişebilir.
      3. Alternatif olarak, plastik sargı yerine bir lateks parmak yatağı kullanır. Parmak karyolası içinde sonda iğne yerleştirin tuzlu su ile doldurun ve kapalı kravat.

2. Hasat Kalp

1. Bir decapicone veya diğer manuel emniyet aygıtı kullanarak bir Sprague Dawley sıçan kısıtlamaktadır. Sıçan tartılır.
2. Sıçan anestezisi için intraperitonal enjeksiyon yoluyla ketamin / ksilazin karışımı (0.85 mg / kg ketamin ve 0.15 mg / kg ksilazin) uygulayınız. Anestezik Bu doz için yeterli anestezi sağlayacaktır20-40 dakika, ancak prosedür olarak hızla anestezi onaylandıktan sonra mümkün olduğunca tamamlanması gerekmektedir.
3. Test ayak tutam refleks ile anestezi uygun derecede onaylayın.
4. Nefes borusu ameliyatı
   1. Kesi yapmak için postu ve makas yükseltmek için hemostat kullanarak, çene tabanına orta forepaw gelen postu çıkarın. Postu boyunca kesip çıkarmak için izin, altta yatan kas ayırmak için yükseltilmiş postu tutun.
   2. Hemostat kullanarak, glandüler doku kaldırın ve bez dokuya fasya yatay kesi alt olun. Nick değil şah damarlar özen açık kesi yaymak için hemostat kullanın.
   3. , Hemostat kullanma tutam kas trakea örten ve kullanan makas sadece hemostat ucu altındaki kas enine kesi yapmak. Hemostat kullanarak, trakea ortaya çıkarmak için birbirinden doku yayıldı.
   4. Dikkatle hafifçe ilerleyen ve hemostat geri çekilmesiyle ilerlerken fasya temizleyerek, trakea altında hemostat yerleştirin.
   5. Hemostatlar başarıyla trakea arkasına konduğunda, hemostatlarla 0-0 ipek sütür çimdik ve makas küçük, keskin çifti ile trakea Hemisect.
   6. , Hemisected trakea içine trakeal kanül yerleştirin trakea arkasında dikiş çekin ve bir cerrah düğümü ile kanül Y-kasık sütür demirleme, kanüle trakea etrafında dikiş kravat.
   7. 27 G iğne kullanarak, şah damarına 1000 U / kg heparin enjekte ve 30 saniye süreyle sirküle izin verir.
5. Torakotomi
   1. Hemostatlarla kısma ve makasla keserek orta forepaw bölgeye orta karından postu çıkarın.
   2. Hemen diyaframın altında, karın kası duvarında içine ¾ inç enine kesi olun.
   3. Sternum boyunca kesme, karın duvarı ve göğüs duvarı yukarı dikey bir kesi yapmak.
   4. Geri bilateral diyaframı Kes, daha sonra kalbi, bu yaymak kalmasını sağlamak için hemostatlarla kelepçe göğüs kafesi ortaya çıkarmak için göğüs kafesi yayıldı.
   5. Hemostat kullanarak, yavaşça çıkan aort açığa timus çıkarın.
   6. Hemostat ucu ile izin fasya yayılan hafifçe ilerleyen ve hemostat geri çekilmeden ve aort döngü hemostat Tease.
   7. , Çıkan aort arkasında 0-0 ipek sütür çekin gevşek bir yarım kare düğüm içine dikiş kravat hemostat kullanın.
   8. Perfüzyon tamponu Hemisect aort akışını başlatmak ve hemen aort lümeni içine kanül eklemek için musluğunu getirin. Hızla yarım kare düğüm cinch ve iyice sıkarak, düğümü tamamlayın.
   9. Uzaklıkta büyük damarların kalbi incelemek göğüs kalp kaldırmak ve perfüzyon sütuna eklemek için makas kullanın.
   10. Aşırı akciğer dokusu uzak trim ve kalp balon yerleştirilmesinden önce yaklaşık 15 dakika boyunca kolonu üzerinde dengelenmeye gelmeye bırakın. 10-20 ml / dk kalbinden tampon normal akış hızını kullanarak.

3. Langendorff Perfüzyon ve İskemi Reperfüzyon Hasarı

1. LV öncesi Yerleştirmessure balon
   1. Bir koni şekline haddeleme sırasında balon Deflate ve balon sönük kalmasını sağlamak için musluğunu açın.
   2. ÖTV mitral kapak erişimi maruz makas küçük bir çifti ile atrium bıraktı.
   3. Sol atrium ve sol ventrikül içine mitral kapaktan balonu yerleştirin.
   4. Basıncı izleme yazılımını başlatın (LabChart Pro).
   5. Stopcock açarak ve yavaşça mikromanometre okuma diastolik basınç sıfır geçene kadar balon serum fizyolojik miktarını artırarak balonu şişirmek.
   6. Yavaş yavaş havasını, uzunluk-gerilim yanıtını kontrol 75 mmHg diyastolik basınç yavaş yavaş balonu şişirmek için bir kez tekrarlayın.
   7. Balonla tuzlu miktarını modüle ederek 10 mmHg diyastolik basınç olarak ayarlayın. Enflasyon bu seviyede balonu mühür stopcock çevirin ve LV balon ve basınç dönüştürücü arasındaki kapalı basınç sistemi korumak.
   8. Plastik ile ısıtılan bölme ve kapak odasına düşük kalp.
2. Ilanİskemi Reperfüzyon Hasarı ve ministration
   1. Isıtmalı odasının alt Tak ve oda effused tampon ile doldurmak için izin verir.
   2. Tampon kalbini batık zaman, küresel iskemi uyaran, kalbine tampon akışını durdurmak için stopcock çevirin. Iskemi süresi deney hedeflerine bağlı olarak değişebilir.
   3. Iskemi 30 dakika sonra, reperfüzyon başlatılması, kalp içine tampon maddesi akışını geri musluğunu açın.
   4. Deney sonlandırmadan önce 1 saat süreyle kalp reperfüzyon izin verin. Deney hedeflerine bağlı olarak, değişken reperfüzyon kez kullanabilirsiniz.
3. Deney sona ermesi ve Doku Hasat
   1. Vana yan bağlantı noktasını kullanarak, 10 ml 'lik bir oranda kalp içine, 4 ° C'de fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ml tatbik / dak kalbi durdurmak için.
   2. Perfüzyon sütunundan kalbi çıkarın atriyal doku kalan uzak trim.
   3. Pa ile kaplayın, paslanmaz çelik, doku dilimleme matrisi içine kalbi yerleştirin8 dakika boyunca, ya da kalp kadar -80 ° C 'de rafilm ve yer hatmi benzeri bir tutarlılığı vardır.
   4. Dondurucudan çıkarın bloğunu ve 2 mm'lik dilimler halinde kalbi dilim matris dilimleme içine jilet yerleştirin. Doku blokları da 2 mm'den daha başka dilim boyutları ile satın alınabilir.
   5. Bir defada dilimleri birini çıkarın ve biyokimyasal çalışmalar için dondurma flaş sıvı azot içine bırakın. Enfarktüs boyama apeks üçüncü ventrikül dilim saklayın.
   6. Biyokimyasal deneylerde kullanılana kadar -80 ° C'de, sıvı azot ve deposundan doku çıkarın.
4. Enfarktüs Boyama
   1. 15 dakika boyunca 37 ° C'de / hac trifeniltetrazolyum klorür (TTC)% 1 w 10 ml, üçüncü ventriküler dilimleri inkübe edin.
      Not: TTC Kuluçka etkinliği ¹⁵ herhangi bir değişiklik ile 15 ya da 30 dakika süre ile gerçekleştirilebilir.
   2. % 10 tamponlu formalin için TTC doku dilim aktarın ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. En iyi sonuçlar için, duymakts formalin üzerinden alındı ​​ve 24 saat ⁴ olan görüntülü olmalıdır.
   3. Böyle ImageJ olarak Fotoğraf lekeli dilim ve kullanım yazılım üreticisinin protokolüne göre infarkt boyutunu tahmin etmek. Boya zamanla kaybolacak kadar, tespit sonrasında kısa sürede fotoğraf çekmek.

Sonuçlar

sol ventrikül balon aparatı müteahhitlik sol ventrikül (Şekil 1) tarafından geliştirilen basınç gerçek zamanlı izleme sağlar. Daha önce ⁷ tarif edildiği gibi, bu basınç izleme ventriküler fonksiyon parametrelerinin çoğu hesaplamak için kullanılabilir. Bu hesaplamalar, başlangıç ​​aşaması olarak reperfüzyon fazı yapılan her bir grup içinde birden fazla izleri üzerinden ortalaması alınmış, ve daha önce ⁹ yapmış gibi farmakolojik müdahale, ka...

Tartışmalar

İzole perfüze sıçan kalp başarıyla iskemi reperfüzyon hasarı ⁹ kardiyak önkoşullama üzerindeki farmakolojik müdahalenin etkisini araştırmak için kullanılabilir. Ancak, tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için standardize edilmelidir prosedüre bazı temel adımlar vardır. Sistem içinde 37.4 ° C arasında bir sıcaklık muhafaza hatta hafif ve hipotermi hipertermi kalp önkoşullanma ^10,11 neden olabilir, kritik öneme sahiptir. ketamin ile uzun süreli maruz kalp önkoşullama <...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8