Induzione e valutazione di ischemia-riperfusione Injury in Langendorff-perfusi Hearts Rat

Riepilogo

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Abstract

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Introduzione

Delucidazione degli eventi di riferimento la risposta cardiaca sia ischemia e riperfusione sono essenziali per migliorare il trattamento di infarto ¹ e cardiache procedure chirurgiche che richiedono miocardio clampaggio aortico ^2. Mentre i modelli in vivo di ischemia riperfusione consentono analisi endpoint molto utili, essi non sono efficaci per studiare gli effetti funzionali di ischemia riperfusione acutamente in tempo reale. Inoltre, in modelli di ischemia riperfusione vivo producono generalmente significativa variabilità nelle dimensioni dell'infarto e consegna diretta di farmaco al cuore al momento della riperfusione è impegnativo. L'utilizzo di un sistema Langendorff cuore isolato per studiare il danno da ischemia riperfusione permette valutazione funzionale in tempo reale di trattamenti farmacologici, superficie uniforme tessuto infartuato e consegna istantanea di farmaco direttamente al miocardio.

Prima descritto by Oscar Langendorff nel 1895 ^3, il cuore Langendorff isolato è un modello affidabile per lo studio di ischemia riperfusione, essendo stato utilizzato nella ricerca ischemia riperfusione per gli ultimi 40 anni ^{di 4,5.} Qui, alcune modifiche sono fatte per ottimizzare il cuore isolato per l'analisi funzionale. In situ incannulamento dell'aorta mentre il cuore batte assicura che il cuore non sperimenta precondizionamento ischemico, tali da modificare i risultati di studi ischemia riperfusione ^6. Per facilitare ciò, viene eseguita una tracheotomia, consentendo la ventilazione e garantire la stabilità fisiologica del ratto durante l'intervento chirurgico. Il cuore è poi collegato a un camicia d'acqua colonna tortile vetro attraverso il quale tampone Krebs Henseleit avviene tramite perfusione retrograda direttamente nell'aorta. Un palloncino soluzione salina viene inserita nel ventricolo sinistro e collegato ad un trasduttore di pressione, che consente la misurazione in tempo reale delle pressioni dall'interno un ventricolod calcolo dei molteplici parametri funzionali. Al termine dell'esperimento, cuore viene lavata con soluzione salina fredda per arrestare la contrazione e flash congelati in azoto liquido per consentire l'analisi valle dei livelli di DNA, RNA e proteine. Così modificato, cuore perfuso Langendorff serve come un sistema efficace per il monitoraggio diretto degli effetti fisiologici degli interventi farmacologici in qualsiasi momento acutamente durante il danno da ischemia riperfusione.

Protocollo

Tutte le procedure qui elencati sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso la Medical University of South Carolina. Gli esperimenti qui descritti sono acute, esperimenti non di sopravvivenza. Come tale, non c'è uso di unguento occhio e una suite operatoria sterile non è necessaria. L'eutanasia si ottiene dissanguamento durante la raccolta del cuore.

Preparazione 1. sperimentale

1. Impostare sia una pressione costante o costante flusso Langendorff Perfusion Apparatus ^4.
2. Preparare 4 L di Krebs modificato Henseleit Buffer (in mM: 112 NaCl, KCl 5, 1.2 _MgSO4, 1 K ₂ HPO _4, 1.25 CaCl _2, 25 _NaHCO3, 11 D-glucosio, 0.2 acido ottanoico, pH = 7,4).
   1. Fai 10x azionari buffer.
      1. Sciogliere NaCl, KCl, MgSO _4, e K ₂ HPO ₄ a 3 litri di acqua ultrapura.
      2. Sciogliere CaCl ₂ in 500 ml di acqua ultrapura with 40 ml di 1 N HCl.
      3. Aggiungere lentamente CaCl ₂ soluzione al buffer realizzato in 1.2.1.1. Aggiungere acqua ultrapura abbastanza per un totale di 4 L. Consenti a mescolare per 1 ora prima di filtrare attraverso un filtro di 0,8 micron. Conservare a 4 ° C.
      4. Sciogliere NaHCO ₃ a 4 litri di acqua ultrapura. Lasciare a mescolare per 1 ora prima di filtrare attraverso a 0.8 micron filtro. Conservare a 4 ° C
   2. Unire 400 ml 10x tampone Krebs Henseleit con 400 ml 10x NaHCO ₃ buffer. Aggiungere acqua ultrapura abbastanza per un totale di 4 L. Sciogliere glucosio e acido ottanoico mescolando. Filtrare 0,8 micron filtro.
3. Sistema di Preparazione per il cuore.
   1. Aggiungere 2 L di tampone filtrata in una bottiglia 4 L 38 disposto sopra il rubinetto attaccato alla cannula aortica. Ciò fornirà una pressione di perfusione di 70-80 mmHg al cuore, che è la pressione di perfusione raccomandata ^4.
   2. Inserire gas dispersione gorgogliatore nel buffer nella bottiglia.
   3. Eseguire il buffer attraverso il sistema, avendo cura di eliminare eventuali bolle dall'interno del tubo.
   4. Accendere gas (95% O _2/5% CO ₂₎ almeno 30 minuti prima cuore è da collocare sul sistema. Utilizzare una sonda flusso di gas e analizzatore di gas del sangue per verificare la saturazione di ossigeno.
4. Preparare scorte chirurgiche e pallone.
   1. Per la raccolta di cuore, preparare un paio di forbici chirurgiche 6,75 ", un paio di forbici 4.5", due paia di hemostats, due set di pinze CaraMalto, due siringhe con 27 aghi G, 2 pezzi di 0-misuratore sutura di seta (su 15 cm di lunghezza), una cannula spinato 1/16 di pollice, e una cannula tracheale.
   2. Per assemblare cannula tracheale, incollare un breve pezzo di tubo del diametro di plastica 1/16 di pollice a un connettore a Y.
   3. Per assemblare apparato palloncino: inserire un ago sonda gastrica per un pezzo di tubo 1/16 di pollice, quindi collegare il tubo di alloggiamento trasduttore di pressione. Una piccola siringa collegata all'altro lato della tr pressioneansducer alloggiamento consentirà l'inflazione e la deflazione del palloncino.
      1. Tagliare un quadrato di plastica dell'involucro e luogo punta di un ago sonda gastrica al centro. Avvolgere l'involucro di plastica intorno all'ago sonda gastrica.
      2. Riempire palloncino con soluzione salina e legare con due punti di sutura. Gonfiare palloncino per assicurarsi che non ci siano perdite. Il volume di soluzione salina all'interno del palloncino gonfiato dovrebbe essere circa 200 ml, ma può variare a seconda delle dimensioni del ratto.
      3. In alternativa, utilizzare un lettino dito lattice al posto della pellicola trasparente. Posizionare gavage ago all'interno dito culla, riempire con soluzione salina e legare.

2. Raccolta cuore

1. Trattenere un ratto Sprague Dawley utilizzando un decapicone o altro sistema di vincolo manuale. Pesare topo.
2. Somministrare ketamina / miscela xylazina (0,85 mg / kg di ketamina e 0,15 mg / kg xilazina) tramite iniezione intraperitoneale per anestetizzare ratto. Questa dose di anestetico fornirà anestesia sufficienti per20-40 min, ma la procedura dovrebbe essere completata il più rapidamente possibile dopo anestesia è confermato.
3. Verificare il corretto livello di anestesia da test punta pizzico reflex.
4. Tracheotomia
   1. Rimuovere pelle da metà zampa a base di mascella, utilizzando hemostats per elevare Pelt e forbici per fare incisione. Mantenere la trippa elevata per separarlo dal muscolo sottostante, permettendo di tagliare lungo la trippa e rimuoverlo.
   2. Utilizzando hemostats, sollevare il tessuto ghiandolare e fare una incisione orizzontale a fascia inferiore al tessuto ghiandolare. Utilizzare hemostats per diffondere incisione aperta, facendo attenzione a non intaccare le vene giugulari.
   3. Utilizzando hemostats, pizzico muscolo sovrastanti la trachea, e con le forbici fare una incisione trasversale nel muscolo appena sotto la punta delle hemostats. Utilizzando hemostats, si sviluppa il tessuto oltre a rivelare trachea.
   4. Inserire con cautela hemostats sotto la trachea, la compensazione fascia mentre procedendo delicatamente avanzamento e riavvolgimento emostatici.
   5. Una volta hemostats sono collocati con successo dietro la trachea, un pizzico 0-0 sutura di seta con hemostats e hemisect la trachea con un piccolo paio di forbici affilate.
   6. Inserire cannula tracheale nella trachea hemisected, tirare di sutura dietro la trachea, e legare la sutura intorno alla trachea cannulato, ancorando la sutura alla Y-inguine della cannula con un nodo chirurghi.
   7. Utilizzando un ago 27 G, iniettare 1.000 U / kg di eparina nella vena giugulare e consentire a circolare per 30 sec.
5. Toracotomia
   1. Rimuovere pelle da metà addome per regione medio-zampe anteriori da pizzicare con hemostats e il taglio con le forbici.
   2. Fare un ¾ di pollice trasversale un'incisione nella parete muscolare addominale, appena sotto il diaframma.
   3. Effettuare una incisione verticale sul muro della parete toracica e addominale, taglio lungo lo sterno.
   4. Tagliare il diaframma posteriore bilateralmente, poi diffuso gabbia toracica per rivelare il cuore, morsetto gabbia toracica con hemostats per assicurare rimane diffusione.
   5. Utilizzando hemostats, rimuovere delicatamente il timo, esponendo l'aorta ascendente.
   6. Tease hemostats attraverso cappio aortica, avanzamento e riavvolgimento hemostats e delicatamente diffusione fascia per consentire punta di hemostats attraverso.
   7. Utilizzare hemostats per tirare 0-0 sutura di seta dietro dell'aorta ascendente, cravatta di sutura in una mezza piazza nodo allentato.
   8. Girare rubinetto per avviare il flusso di tampone di perfusione, hemisect aorta e inserire la cannula nel lume aortico immediatamente. Rapidamente cinch un nodo mezzo quadrato e completare il nodo, stringendo a fondo.
   9. Usare le forbici per sezionare cuore lontano dai grandi vasi, togliere il cuore dal petto e allegare alla colonna di perfusione.
   10. Troncare tessuto polmonare in eccesso e permette cuore equilibrare su colonna per circa 15 minuti prima dell'inserimento del palloncino. Utilizzare una portata normale di tampone attraverso il cuore di 10-20 ml / min.

3. Langendorff perfusione e ischemia riperfusione

1. Posizionamento di LV pressure balloon
   1. Sgonfiare pallone durante il rotolamento a forma di cono e girare rubinetto per assicurare pallone rimane sgonfio.
   2. Excise lasciato atrio con un piccolo paio di forbici per esporre l'accesso alla valvola mitrale.
   3. Inserire palloncino attraverso atrio sinistro e la valvola mitrale in ventricolo sinistro.
   4. Avviare il software di controllo della pressione (LabChart Pro).
   5. Gonfiare pallone aprendo rubinetto e delicatamente crescente quantità di soluzione salina in mongolfiera fino diastolica lettura da micromanometro supera zero.
   6. Per controllare la risposta lunghezza-tensione, gonfiare palloncino lentamente ad una pressione diastolica di 75 mmHg, sgonfiare lentamente, ripetere una volta.
   7. Impostare la pressione diastolica di 10 mmHg modulando la quantità di soluzione salina nel pallone. Girare rubinetto per sigillare palloncino a questo livello di inflazione, e di mantenere il sistema di pressione chiuso tra LV palloncino e trasduttore di pressione.
   8. Lower cuore in riscaldato da camera e coperchio della camera con la plastica.
2. Annuncioministero della Ischemia riperfusione
   1. Inserire il fondo della camera riscaldata e lasciare da camera di riempire con tampone Effused.
   2. Quando il buffer è sommerso cuore, girare rubinetto per arrestare il flusso di tampone nel cuore, inducendo ischemia globale. Ischemia tempo può variare a seconda degli obiettivi dell'esperimento.
   3. Dopo 30 min di ischemia, girate rubinetto per ripristinare il flusso di tampone in cuore, iniziando riperfusione.
   4. Consentire riperfusione del cuore per 1 ora prima di terminare l'esperimento. Utilizzare tempi riperfusione variabili, a seconda degli obiettivi dell'esperimento.
3. Cessazione Esperimento e raccolta di tessuto
   1. Utilizzando babordo di rubinetto, somministrare 10 ml di tampone fosfato salino a 4 ° C nel cuore ad una velocità di 10 ml / min per arrestare cuore.
   2. Rimuovere cuore dalla colonna perfusione, tagliare via rimanente tessuto atriale.
   3. Mettere il cuore in acciaio inox per affettare matrice di tessuto, coprire con Parafilm, e posto a -80 ° C per 8 minuti, o fino a quando il cuore ha una consistenza marshmallow-like.
   4. Rimuovere blocco dal congelatore e inserire lamette in affettare matrice per tagliare cuore in 2 fette mm. Blocchi tessuto possono essere acquistati anche con i formati fetta altri di 2 mm.
   5. Rimuovere fette uno alla volta e rilasciare in azoto liquido a lampeggiare congelare per studi biochimici. Conservare la fetta terzo ventricolo dall'apice per infarto colorazione.
   6. Rimuovere il tessuto da azoto liquido e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso in esperimenti biochimici.
4. Infarto colorazione
   1. Incubare la terza porzione ventricolare in 10 ml di 1% w / v di cloruro trifeniltetrazolio (TTC) a 37 ° C per 15 min.
      Nota: L'incubazione in TTC può essere eseguita per 15 o 30 minuti con nessun cambiamento nell'efficacia ^15.
   2. Trasferire fetta tessuto dalla TTC al 10% formalina tamponata e lasciar incubare a temperatura ambiente per una notte. Per ottenere risultati ottimali, sentirets devono essere tolti di formalina e ripreso entro 24 ore ^4.
   3. Fotografia macchiato fetta e l'utilizzo di software come ImageJ per stimare le dimensioni dell'infarto secondo il protocollo del produttore. Fotografare il più presto possibile dopo la fissazione, il colorante sbiadiscono nel tempo.

Risultati

L'apparato ventricolo sinistro balloon permette il monitoraggio in tempo reale della pressione sviluppata dalle amministrazioni ventricolo sinistro (figura 1). Come descritto in precedenza ^7, questa traccia di pressione può essere utilizzata per calcolare molti dei parametri della funzione ventricolare. Questi calcoli possono essere effettuati in fase iniziale nonché la fase di riperfusione, mediati su tracce multiple all'interno di ciascun gruppo, e confrontati per determinare se l...

Discussione

Isolato Il cuore perfuso di ratto può essere utilizzato con successo per studiare l'effetto di un intervento farmacologico in precondizionamento cardiaco in ischemia riperfusione ^9. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi essenziali alla procedura che deve essere standardizzato per garantire risultati riproducibili. Il mantenimento di una temperatura di 37,4 ° C all'interno del sistema è critico, in quanto anche lieve ipotermia e ipertermia può causare precondizionamento cardiaco ^10,11. Il te...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8