Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

Resumo

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Resumo

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Introdução

A elucidação dos eventos subjacentes à resposta cardíaca tanto para isquemia e reperfusão são essencial para melhorar o tratamento de enfarte ¹ e procedimentos cirúrgicos cardíacos do miocárdio que necessitam pinçamento aórtico ^2. Embora os modelos in vivo de lesão de reperfusão de isquemia permitir análise de ponto final muito úteis, eles não são tão eficazes para estudar os efeitos funcionais da isquemia lesão de reperfusão aguda em tempo real. Além disso, em modelos de isquemia reperfusão in vivo geralmente produzem uma variabilidade significativa da dimensão do enfarte e a entrega directa de drogas para o coração no momento da reperfusão é um desafio. A utilização de um sistema de coração de Langendorff isolado para estudar a lesão por isquemia reperfusão permite a avaliação funcional em tempo real dos tratamentos farmacológicos, área uniforme do tecido enfartado e entrega instantânea de fármaco directamente ao miocárdio.

Descrita pela primeira vez by Oscar Langendorff em 1895 ^3, o coração de Langendorff isolado é um modelo robusto para o estudo da lesão de reperfusão de isquemia, tendo sido utilizado na pesquisa de isquemia reperfusão durante os últimos 40 anos ^4,5. Aqui, algumas modificações são feitas para aperfeiçoar o coração isolado para análise funcional. Em situ canulação da aorta, enquanto o coração está a bater garante que o coração não experimentar o pré-condicionamento isquémico, que iria alterar os resultados dos ensaios isquemia reperfusão ^6. Para facilitar isto, uma traqueotomia é efectuada, permitindo a ventilação e garantir a estabilidade fisiológica do rato durante a cirurgia. O coração é depois ligado a uma coluna em espiral com camisa de água de vidro através da qual tampão de Krebs Henseleit é entregue através de perfusão retrógrada directamente para a aorta. Um balão cheio de soro fisiológico é inserido no ventrículo esquerdo e ligado a um transdutor de pressão, que permite a medição das pressões em tempo real a partir do um ventrículod cálculo de vários parâmetros funcionais. Na conclusão do experimento, o coração é lavada com solução salina fria para prender contração e flash congelado em nitrogênio líquido para permitir a análise a jusante dos níveis de DNA, RNA e proteínas. Assim modificado, o coração de Langendorff perfundido serve como um sistema eficaz para a monitorização directa do efeito fisiológico de intervenções farmacológicas, em qualquer momento de forma aguda durante a lesão por isquemia-reperfusão.

Protocolo

Todos os procedimentos listados aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional na Universidade de Medicina da Carolina do Sul. As experiências aqui descritas são, experiências agudas não-sobrevivência. Como tal, não há uso de pomada e uma suíte de cirurgia estéril não é necessária. A eutanásia por exsanguinação é conseguida durante a colheita do coração.

1. Experimental Preparação

1. Configure ou uma pressão constante ou fluxo constante de perfusão Langendorff Aparelho ^4.
2. Prepare a 4 L de Krebs Henseleit modificado (em mM: NaCl 112, KCl 5, _MgSO4 1,2, 1 K ₂ HPO _4, 1,25 de _CaCl2, 25 de _NaHCO3, 11 de D-glicose, 0,2 de ácido octanóico, pH = 7,4).
   1. Faça 10x buffers de ações.
      1. Dissolve-se NaCl, KCl, _MgSO4, e K ₂ HPO ₄ em 3 L de água ultrapura.
      2. Dissolver _CaCl2 em 500 ml de água ultrapura with 40 ml de 1 N de HCl.
      3. Adiciona-se lentamente solução de _CaCl2 ao tampão feito em 1.2.1.1. Adiciona-se água ultra-pura o suficiente para o total de 4 L. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de um filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C.
      4. Dissolver NaHCO ₃ em 4 L de água ultrapura. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de pelo filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C
   2. Combinar 400 mL de 10x tampão de Krebs Henseleit com 400 ml de 10x tampão de _NaHCO3. Adicionar água ultrapura suficiente para totalizar 4 L. Dissolver glicose e ácido octanóico, sob agitação. Filtrar através de filtro de 0,8 um.
3. Sistema de preparar-se para o coração.
   1. Adicionar 2 L de tampão de filtrado para um frasco de 4 L 38 colocado em cima da torneira de passagem ligado à cânula aórtica. Isto irá proporcionar uma pressão de perfusão de 70-80 mmHg para o coração, que é a pressão de perfusão recomendado ^4.
   2. Insira gás dispersão bubbler para o buffer na garrafa.
   3. Execute o tampão através do sistema, tendo a certeza de eliminar quaisquer bolhas de dentro da tubulação.
   4. Ligue gás (95% _{de O2} / 5% de CO _2), pelo menos, 30 min antes do coração está a ser colocado no sistema. Use uma sonda de fluxo de gás e analisador de gases de sangue para verificar a saturação de oxigênio.
4. Preparar material cirúrgico e balão.
   1. Para a colheita de coração, prepare um par de tesouras cirúrgicas 6,75 ", um par de 4.5" tesouras, dois pares de hemostats, dois conjuntos de fórceps caramalt, duas seringas com agulhas de 27 G, 2 peças de 0-medidor fio de seda (cerca de 15 cm de comprimento), uma cânula farpado 1/16 polegadas, e uma cânula traqueal.
   2. Para montar cânula traqueal, colar um pequeno pedaço de 1/16 de polegada de diâmetro tubo de plástico a um conector Y.
   3. Para montar aparelhos balão: anexar uma agulha gavagem a uma peça de 1/16 de polegada tubulação, em seguida, anexar a tubulação para habitação transdutor de pressão. Uma pequena seringa ligada ao outro lado da pressão transducer habitação vai permitir que a inflação ea deflação do balão.
      1. Corte um quadrado de envoltório e local ponta de plástico de uma agulha gavage no centro. Envolva o envoltório de plástico em torno da agulha por sonda.
      2. Encha o balão com soro fisiológico e amarrar com duas suturas. Inflar balão para garantir que não haja vazamentos. O volume de solução salina dentro do balão inflado deve ser de aproximadamente 200 ul, mas pode variar dependendo do tamanho do rato.
      3. Como alternativa, use um berço dedo de látex no lugar do plástico. Coloque agulha gavage dentro dedo berço, encha com solução salina e amarrar.

2. Colheita do coração

1. Contenha um rato Sprague Dawley utilizando um decapicone ou outro dispositivo de segurança manual. Pesar rato.
2. Administrar cetamina / mistura de xilazina (0,85 mg / kg de cetamina e 0,15 mg / kg de xilazina) através de injecção intraperitoneal para anestesiar ratos. Esta dose de anestésico irá fornecer suficientes para anestesia20-40 min, mas o procedimento deve ser concluído o mais rapidamente possível após a anestesia é confirmada.
3. Confirme grau adequado de anestesia pelo teste toe pitada reflexo.
4. Traqueotomia
   1. Retirar pele de meados de forepaw à base de mandíbula, utilizando hemostats para elevar pele e tesoura para fazer incisão. Manter a pele elevada para separá-lo do músculo subjacente, permitindo que um corte ao longo da pele e removê-lo.
   2. Usando hemostats, levante o tecido glandular e fazer uma incisão horizontal na fáscia inferior ao tecido glandular. Use hemostats para espalhar incisão aberta, tomando cuidado para não nick as veias jugulares.
   3. Usando pinças hemostáticas, músculo sobrejacente pitada traqueia, e usando uma tesoura fazer uma incisão transversal no músculo logo abaixo da ponta das pinças hemostáticas. Usando pinças hemostáticas, espalhar tecido para além de revelar traqueia.
   4. Insira com cuidado hemostats sob traquéia, limpando fáscia enquanto progredindo suavemente avançar e recuar hemostats.
   5. Uma vez hemostats são colocados com sucesso por trás da traquéia, beliscar 0-0 sutura de seda com hemostats e hemisect a traqueia com um pequeno par, de tesoura afiada.
   6. Insira cânula traqueal na traquéia hemisected, puxe sutura por trás da traquéia, e amarrar a sutura ao redor da traqueia canulada, ancorando a sutura com o Y-virilha da cânula com um nó cirurgiões.
   7. Usando uma agulha de 27 G, injectar 1.000 U / kg de heparina na veia jugular e permitir a circular durante 30 seg.
5. Toracotomia
   1. Retirar pele de meados de abdômen para região mid-pata dianteira por compressão com hemostats e corte com tesoura.
   2. Adicione uma incisão transversal ¾ de polegada na parede muscular abdominal, imediatamente abaixo do diafragma.
   3. Faça uma incisão vertical até a parede a parede abdominal e torácica, cortando ao longo do esterno.
   4. Corte o diafragma volta bilateralmente, em seguida, espalhar caixa torácica para revelar coração, ribcage braçadeira com hemostats para garantir que ele permanece spread.
   5. Usando hemostats, remova gentilmente timo, expondo a aorta ascendente.
   6. Tease hemostats através de loop aórtica, avançar e recuar hemostats e gentilmente espalhando fascia para permitir ponta de hemostats completamente.
   7. Use hemostats para puxar 0-0 sutura de seda por trás da aorta ascendente, amarre sutura em um meio-quadrado nó frouxo.
   8. Virar a torneira para iniciar o fluxo de tampão de perfusão, hemisect aorta e imediatamente inserir uma cânula para lúmen da aorta. Rapidamente apertar um nó meia-quadrado e completar o nó, apertando bem.
   9. Use a tesoura para dissecar coração longe dos grandes vasos, remova coração do peito e fixe a coluna de perfusão.
   10. Corte o excesso de tecido pulmonar e permitir que o coração se equilibrar em coluna por cerca de 15 min antes da inserção de balão. Usar uma taxa de fluxo normal do tampão por meio de coração de 10-20 ml / min.

3. Langendorff de perfusão e isquemia-reperfusão Lesão

1. Colocação de pré LVssure balão
   1. Desinflar o balão ao rolar em forma de cone e vire torneira para garantir balão continua a ser esvaziado.
   2. Excise átrio esquerdo com um pequeno par de tesouras para expor o acesso à válvula mitral.
   3. Insira balão através do átrio esquerdo e da válvula mitral em ventrículo esquerdo.
   4. Inicie o software de monitoramento de pressão (LabChart Pro).
   5. Encher o balão através da abertura de válvula e suavemente o aumento da quantidade de solução salina em balão até que a pressão diastólica leitura de micromanómetro excede zero.
   6. Para verificar a resposta comprimento-tensão, inflar o balão lentamente a uma pressão diastólica de 75 mmHg, desinflar lentamente, repetir uma vez.
   7. Regule a pressão diastólica de 10 mm Hg através da modulação da quantidade de solução salina no balão. Vire torneira para selar balão a este nível de inflação, e manter sistema de pressão fechado entre balão LV e transdutor de pressão.
   8. Lower coração em câmara câmara ea tampa aquecida com plástico.
2. De Anúnciosministração de isquemia-reperfusão Lesão
   1. Ligue o fundo da câmara de aquecimento e câmara de permitir a encher-se com tampão de Effused.
   2. Quando o buffer tenha submergido coração, virar a torneira para parar o fluxo de tampão para o coração, induzindo isquemia global. Tempo de isquemia pode variar de acordo com os objetivos do experimento.
   3. Após 30 min de isquemia, virar a torneira para restaurar o fluxo de tampão para o coração, o início da reperfusão.
   4. Permitir reperfusão do coração durante 1 hora antes de terminar o experimento. Use tempos de reperfusão variáveis, dependendo dos objetivos do experimento.
3. Rescisão de Experiência e de colheita de Tissue
   1. Usando a porta lateral de torneira, administrar 10 ml de solução salina tamponada com fosfato a 4 ° C para o coração a uma taxa de 10 ml / min para parar o coração.
   2. Remover coração da coluna perfusão, aparar restante tecido atrial.
   3. Coloque coração em uma matriz de tecido corte de aço inoxidável, cubra com Parafilm, e colocar a -80 ° C durante 8 minutos, ou até que o coração tem uma consistência como marshmallows.
   4. Remova o bloco do freezer e coloque razorblades em cortar matriz de cortar o coração em fatias de 2 mm. Blocos de tecido também pode ser comprado com outros que 2 mm tamanhos fatia.
   5. Remover fatias um de cada vez e soltar em nitrogênio líquido a piscar congelar por estudos bioquímicos. Reter a fatia ventricular terceira a partir do ápice para a coloração do enfarte.
   6. Remover o tecido a partir de azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à utilização em experiências bioquímicas.
4. Enfarte Coloração
   1. Incubar a terceira fatia ventricular em 10 mL de 1% w / v de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 37 ° C durante 15 min.
      Nota: A incubação no TTC pode ser realizada durante 15 ou 30 min, sem qualquer alteração na eficácia ^15.
   2. Transferir fatia de tecido de TTC a 10% de formalina tamponada e deixa-se incubar à temperatura ambiente durante a noite. Para melhores resultados, ouvirts deve ser retirado de formalina e fotografada dentro de 24 horas ^4.
   3. Fotografia manchado fatia e uso de software como o ImageJ para estimar o tamanho do infarto de acordo com o protocolo do fabricante. Tirar fotografias, logo que possível após a sua fixação, como o corante vai desaparecer com o tempo.

Resultados

O aparelho de balão do ventrículo esquerdo permite a monitorização em tempo real da pressão desenvolvida pela entidade ventrículo esquerdo (Figura 1). Como descrito anteriormente ^7, este traçado da pressão pode ser usado para calcular muitos dos parâmetros da função ventricular. Estes cálculos podem ser realizados na fase de linha de base, bem como a fase de reperfusão, em média, em traços múltiplos dentro de cada grupo, e comparadas a fim de determinar se a intervenção farm...

Discussão

O coração perfundido isolado de rato pode ser utilizado com êxito para estudar o efeito da intervenção farmacológica no pré-condicionamento cardíaco em lesão de reperfusão de isquemia ^9. No entanto, existem alguns passos essenciais para o procedimento que deve ser normalizados, a fim de assegurar a reprodutibilidade dos resultados. A manutenção de uma temperatura de 37,4 ° C no interior do sistema é crítica, já que mesmo a hipotermia e hipertermia pode causar pré-condicionamento cardíaco

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8