לוקמיה עמידה דוגמנות כימותרפיה<em&gt; במבחנה</em

Summary

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Abstract

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Introduction

The overall goal of the method described is to provide an efficient, cost-effective in vitro approach that supports investigation of the mechanisms that underlie bone marrow supported survival of leukemic cells during chemotherapy exposure. It is well documented that surviving residual tumor cells that persist after treatment contribute to relapse of disease that is often more aggressive than that at diagnosis and is often less effectively treated^1-8. Models that include leukemic cells in isolation, such as those limited to culture of cells in media alone, for testing of therapeutic approaches do not factor in these critical signals, or the heterogeneity of disease that occurs in response to availability of niche derived cues in which tumor cell subpopulations with very specific interactions with niche cells derive enhanced protection. Standard 2D co-culture models that co-culture bone marrow derived stromal cells and leukemic cells have somewhat addressed the contribution of the marrow niche and have shown that interaction with bone marrow microenvironment cells increases their resistance to chemotherapy and alters their growth characteristics^9-14. These models however often fail to recapitulate long term survival of tumor cells and do not accurately inform the outcomes associated with the most resistant leukemic cell populations that contribute to MRD. In vivo models remain critical and define the "gold standard" for investigation of innovative therapies prior to clinical trials but they are often challenged by the time and cost required to test hypotheses related to resistant tumors and relapse of disease. As such, development of more informative 2D models would be of benefit for pilot investigations to better inform the design of subsequent murine based pre-clinical design.

The 2D in vitro model presented in this report lacks the complexity of the true in vivo microenvironment, but provides a cost effective and reproducible means to interrogate tumor interactions with the microenvironment that lends itself specifically to enrichment of the chemoresistant subpopulation of tumor cells. This distinction is valuable as evaluation of the entire population of tumor cells may mask the phenotype of a minor group of therapy resistant tumor cells that comprise the most important target. An additional advantage is the scalability of the model to fit the analysis of interest. Bulk cultures can be established for those analyses requiring significant recovery of tumor cells, while small scale co-cultures in multi-well plates can be utilized for PCR based analysis or microscopy based evaluations.

Based on this need we developed an in vitro model to address the heterogeneity of disease that is characteristic of B-lineage acute lymphoblastic leukemia (ALL). We demonstrate that ALL cells, which share many characteristics in common with their healthy counterparts, localize to distinct compartments of BMSC or OB co-culture. Three populations of tumor cells are generated that have distinct phenotypes that are valuable for investigation of therapeutic response. Specifically, we demonstrate that (ALL) cells recovered from the "phase dim" (PD) population of co-culture are consistently refractory to therapy with survival that approximates tumor cells that have not been exposed to cytotoxic agents. These ALL cells, from either established cell lines or primary patient samples, migrate beneath adherent stromal cells or osteoblast layers but can be captured following trypsinization of cultures and separation of cell types by utilization of gel type 10 cross-linked dextran (G10) particle columns¹⁵.

Here we present a setup of a 2D co-culture that can be employed to model interactions between bone marrow microenvironment stromal cells (BMSC/OB) and leukemic cells. Of particular importance is the observation that leukemic cells form three spatial subpopulations relative to the stromal cell monolayer and that the PD population represents a chemotherapy resistant tumor population due to its interaction with the BMSC or OB. Furthermore, we demonstrate how to effectively isolate the leukemic cell populations by G10 columns. Of note, we have found that isolation of these subpopulations allows for downstream analysis of the most resistant PD population to determine potential modes of resistance that are conferred to these cells due to their interaction with the bone marrow microenvironment stromal cells or osteoblasts. Techniques that we have utilized downstream of this co-culture and isolation model include flow cytometric evaluation, proteomic analysis and targeted protein expression evaluation as well as more recently developed laser ablation electrospray ionization (LAESI) and Seahorse analysis to evaluate metabolic profiles. Through use of this model in combination with the techniques above we have found that the PD population of leukemic cells has a chemotherapy resistant phenotype that is unique when compared to leukemic cells cultured in media alone or those recovered from the other subpopulations in the same co-culture. As such, this model lends itself to more rigorous evaluation to test strategies targeting the most chemotherapy resistant leukemic cells which derive their resistant phenotype through interaction with the bone marrow microenvironment.

Protocol

1. הכנה מתקדמת

1. הכנת חלקיקי G10 dextran.
   1. הכן סלארי G10 על ידי הוספת 50 מ"ל 1x PBS על 10 חלקיקים G10 גרם. מערבבים על ידי היפוך ולאפשר G10 להגיע להסדר מחוץ בופר פוספט (PBS) בשעה 4 ° CO / N.
   2. היום של ההפרדה עמודה G10, לשאוב PBS מחלקיקים G10 התיישבו ולהוסיף 50 מ"ל PBS טרי. מערבבים על ידי היפוך. חזור פעמיים, הוספת 50 מ"ל PBS טרי לחלקיקים G10 התיישבו ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
2. Culturing BMSC ו OB.
   1. לשמור הן BMSC או OB ב 37 ° C ב 6% CO _{2 ו} גדל על צלחות בתרבית רקמה 10 ס"מ עד 90% confluency הוא הגיע.
   2. Trypsinize BMSC או תאי OB ולפצל 1: 2 על 10 צלחות סנטימטר חדשות. התאים גדלים סטנדרטים אלה עד הדרושים leukemic שיתוף culturing.

2. לקביעתם ולקיומם Co-תרבות

1. להוסיף 5-20 x 10 ^{6 תאים} leukemic in 10 מ"ל של התקשורת בתרבות גידולים ספציפיים על גבי ומחוברות 80% -90% BMSC או צלחת OB.
   הערה: המעבדה שלנו שומרת שיתוף תרבויות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% O ₂ לשחזר במיקרו-סביבה של מח עצם טובה יותר אשר הוכח נע בין 1% ל -7% ^16-18. עם זאת, שמירה על שיתוף תרבויות על מתח החמצן זו אינה קריטית להקמת שלוש תת-אוכלוסיות leukemic והוא על פי שיקול דעתו של המעבדה.
2. כל יום 4 ^th להסיר את כל אבל 1 מיליליטר של תקשורת (כולל תאי leukemic השעיה) ולהחליפו 9 מיליליטר תקשורת ותרבות leukemic טריה. כשמוציאים 9 מ"ל של התקשורת מהצלחת, להיזהר לא להפריע את השכבה חסיד BMSC או OB.
   1. סר מדיה ידי הטיית הצליחה אל תקשורת הלוואי לשאוב בפינת הצלחת. בנוסף, בעת הוספת תקשורת טריה, הקפד להוסיף טיפה חכמה בפינת הצלחת נגד הדפנות כדי להבטיח הפרעה מזערית של שכבת חסיד BMSC או OB.
3. לאחר 12 יום ^ה של תרבות משותפת, לשטוף תאי leukemic מ BMSC או שכבת OB ידי pipetting תקשורת ותרבות ממרחק של עד מנה ולמטה בעדינות על הצלחת כ 5 עד 10 פעמים ולאחר מכן לאסוף ב 15 מיליליטר צינור חרוטים. Reseed על BMSC ומחוברות 80% -90% חדשות או צלחת OB כמתואר בשלב 2.1.
   הערה: שטיפה עדינה של שיתוף תרבות כמתואר בשלב 2.3 תסיר S ו- PB תאים leukemic מבלי לשבש את monolayer BMSC או OB. זה מאפשר לתאים סרטניים בלבד שיועבר הצלחה שיתוף התרבות הבא. ניתן לחזור מחזור 12 ביום זה פעמים רבות ככל הצורך בהתבסס על צרכי המשתמש.

3. עמודות הכנת חרוז G10

הערה: אם ניתוח במורד זרם סטרילי או culturing נדרש בעקבות פירוד עמודת G10 את השלבים הבאים צריך להתבצע באמצעות טכניקה סטרילית ועמודות G10 צריכות להיות התקנה במנדף הביולוגי סטרילי.

1. טרום ווהתרבית תאים rm התקשורת ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים (~ 30 מ"ל לכל טור). באמצעות מזרק חד פעמי 10 מ"ל, להסיר ולסלק הבוכנה. להוסיף צמר זכוכית כדי מזרק.
2. בעזרת פינצטה, לפרק צמר זכוכית לחוטים רופפים דקים. להוסיף מספר שכבות של צמר זכוכית ארוז קלות על המזרק עד 2/3 מזרק מלא צמר זכוכית.
   הערה: צמר הזכוכית היא חיונית כדי למנוע חלקיקי G10 רופפים מ מזהמים את אוסף תאי leukemic. הפוך צמר זכוכית בטוחה הוא ארוז מספיק כדי לתמוך חלקיקי G10, אבל לא צפופה מדי בצפיפות לחסום זרימת מדיה דרך עמודה.
3. צרף ברזלי 1-דרך אל קצה המזרק במצב סגור.
4. טור מזרק קלאמפ לצלצל לעמוד גבוה מספיק כדי צינור חרוטי 50 מ"ל (צינור איסוף) ניתן למקם מתחת ברזלים. מניח צינור איסוף תחת עמודת מזרק.
5. בעזרת פיפטה 10 מ"ל להוסיף, טיפה חכם, חלקיקים G10 resuspended ב PBS לעמודה על גביצמר הזכוכית. ממשיכים להוסיף חלקיקים G10 עד גלולה מ"ל ~ 2 (כפי שנמדד על ידי סיום לימודים על המזרק) של צורות חלקיקים G10 על גבי צמר זכוכית.
6. לאזן את עמודת G10 עם תקשורת מחוממת מראש.
   1. הוסף 2 מ"ל של התקשורת מחומם מראש לעמודה. שסתומים ברזלים להרחיב לאט כך בתקשורת זורמת מתוך הטור נפתח חכם.
   2. חזור על שלב 3.6.1 עד סך של 10 מ"ל של התקשורת מחומם מראש כבר חצה את הטור.
      הערה: אם חלקיקי G10 נראה את הזרימה דרך בצינור האוסף, או 1) להוסיף עוד חלקיקי G10 לשמור ~ 2 גלולת מיליליטר מוודא שאף חלקיקי G10 נוספים לברוח מהעמודה או 2) להחליף עמודה עם אחד בשימוש וחזרו צעדים 3.4-3.6.1.
   3. לאחר מנקז התקשורת מחומם מראש מהעמודה, לסגור את שסתום וזורקים צינור איסוף עם הזרימה דרך. להוסיף צינור אוסף חדש תחת העמודה. הטור הוא מוכן להיות טעון עם תערובת תאי מדיה +.
      הערה: עמודותיש להשתמש מיד ולא להתייבש.

4. הפרדה 3 תת-אוכלוסיות בתוך משותף תרבות

1. אוסף של השעיה (S) תת-אוכלוסיית גידול.
   1. לשאוב התקשורת מהצלחת שיתוף תרבות עם פיפטה בעדינות מחדש להחיל את אותה התקשורת לשטוף את הצלחת לאסוף מדיה המכילה תאים leukemic צינור חרוטי 15 מ"ל. תאי leukemic שנאספו הם תת-אוכלוסיית S.
2. אוסף של השלב ברייט-אוכלוסיית גידול (PB).
   1. הוסף 10 מ"ל התקשורת טרי חזרה לצלחת שיתוף תרבות. לשטוף נמרצות על ידי pipetting תקשורת הוסיפה למעלה ולמטה כ 5 פעמים כדי להסיר תאי leukemic חסידים אבל לא מספיק חזק כדי לסלק רכיב חסיד BMSC / OB.
   2. לשאוב עם פיפטה ולאסוף התקשורת צינור חרוטי 15 מ"ל. התאים שנאספו הם תת-אוכלוסיית PB.
3. אוסף של שלב דים (PD) תת-אוכלוסיית גידול.
   1. צלחת לשטוף עם 1 מ"ל PBS כדי remתקשורת נותרת אובה. Trypsinize צלחת שיתוף תרבות עם 3 מ"ל טריפסין ומקום לתוך 37 ° C חממה במשך 5 דקות.
   2. הסר את צלחת מתוך החממה לטפוח בעדינות צידי הצלחת לנשל BMSC / OB חסיד.
   3. הוסף 1 מ"ל בסרום שור העובר (FBS) ו פיפטה מעלה ומטה 3-5 פעמים להתפרק אגרגטים תא גדול.
   4. אסוף התקשורת עם תאים צינור חרוטי 15 מ"ל. תאים אלה הם תת-אוכלוסייה PD unpurified עם BMSC / OB גם כן.
4. צנטריפוגה 3 מבודדת תת-אוכלוסיות ב 400 XG במשך 7 דקות. לשאוב ולזרוק supernatant אז בנפרד resuspend כדורים ב 1 מיליליטר תקשורת מחוממת מראש. תאים מוכנים להיות הועמס על עמודת G10.

5. טוען משותף התרבות תאים על גבי טור G10

הערה: הפוך ברזלים בטוחים סגורה לחלוטין לפני הוספת תאים המכילים תקשורת לעמודת G10. כמו כן, כל תת-אוכלוסייה חייבת להיות דרסה טור G10 נפרד כך שלא introducדואר הטיות בין אוכלוסיות בניתוח במורד הזרם.

1. בעזרת פיפטה 1,000 μl, להוסיף 1 מ"ל של כל תת-אוכלוסייה תא התקשורת מחומם מראש ל טור G10 נפרד טיפה חכם. ודא שהמדיה המכיל את התאים נשאר על גבי או בתוך גלולה G10. אפשר תאים כדי לדגור על גלולת G10 במשך 20 דקות ב RT.
   הערה: ברזלים נותר סגור משך הדגירה.

6. איסוף תאי leukemic מעמודת G10

1. להוסיף 1-3 מ"ל מראש לחמם התקשורת כל עמודה G10. שסתום ברזלים להרחיב ולאפשר תקשורת כדי לצאת לאט בעמודת טיפה חכמה.
   הערה: זה חיוני כדי לשמור על קצב זרימה איטית מהעמודה או גלולת G10 המכילה BMSC / OB יכול לשטוף את הטור ולזהם את תאי leukemic המבודדים.
2. המשך להוסיף מדיה מחוממת מראש במרווחים קטנים (1-2 מיליליטר) לעמודת G10 עד סך של 15 עד 20 מיליליטר יש להפעיל באמצעות עמודה נאסף. va שסתום הקרובצינור איסוף lve וכובע.
   הערה: אם גלולת חלקיקי G10 נתפסת בתחתית צינור איסוף, להסיר בעדינות תקשורת מהצינור עוזב G10 חלקיקים הגלולים באין מפריע ולהעביר צינור חדש.
3. צנטריפוגה שנאספו מדיה ב 400 XG במשך 7 דקות ב RT. הסר supernatant ו resuspend תא גלול במאגר מתאים לשימוש עבור במורד זרם.
4. תאים הם עכשיו אוכלוסייה טהורה של תאים leukemic ללא BMSC או זיהום OB והם מוכנים להיות מיושם על יישומים במורד הזרם לפי שיקול למשתמש.
   הערה: כדאיויות תא leukemic צריכות להישאר ללא שינוי כאשר עוברים תאים דרך עמודות G10.

תוצאות

ההתקנה ותרבות מוצלח של מודל שיתוף תרבות זו תגרום להקמת 3 תת-אוכלוסיות של תאים leukemic ביחס בשכבה BMSC או OB חסיד. איור 1 מראה כיצד כל התאים זורעים לתוך בשכבה BMSC בתחילה מופיעים רק מאוכלוסיה אחת של מושעה תאי leukemic. במהלך 4 ימים תאים leukemic אינטראקציה עם BM...

Discussion

מחלה שארית מינימלית (MRD) התורמת הישנות של המחלה ממשיכה להיות אתגר קליני מהותי בטיפול עקשן אגרסיבי ALL, כמו גם, שורה של ממאירויות המטולוגיות אחרות. במיקרו-סביבה של מח העצם הוא האתר הנפוץ ביותר של ההתקפים ALL ^3,8. ככזה, מודלים שהמודל במיקרו-סביבה של מח העצם הם כלים חיוני...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 sephadex beads	Sigma	G10120	Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe	BD	309604
Glass wool	Pyrex	3950
1-way stopcocks	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021039	Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021037	Used for cell collection
Fetal Bovine Serum	Sigma	F6178
0.05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes	Greiner Bio-One	664160
Culture media
Osteoblast culture media	PromoCell	C-27001	For human osteoblast media
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	For tumor media prepation
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts	PromoCell	C-12720	Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations.
Human Bone Morrow Stromal Cells	WVU Biospecimen Core		De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.