Моделирование резистентностью к химиотерапии лейкоз<em&gt; In Vitro</em

Резюме

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Аннотация

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Введение

The overall goal of the method described is to provide an efficient, cost-effective in vitro approach that supports investigation of the mechanisms that underlie bone marrow supported survival of leukemic cells during chemotherapy exposure. It is well documented that surviving residual tumor cells that persist after treatment contribute to relapse of disease that is often more aggressive than that at diagnosis and is often less effectively treated^1-8. Models that include leukemic cells in isolation, such as those limited to culture of cells in media alone, for testing of therapeutic approaches do not factor in these critical signals, or the heterogeneity of disease that occurs in response to availability of niche derived cues in which tumor cell subpopulations with very specific interactions with niche cells derive enhanced protection. Standard 2D co-culture models that co-culture bone marrow derived stromal cells and leukemic cells have somewhat addressed the contribution of the marrow niche and have shown that interaction with bone marrow microenvironment cells increases their resistance to chemotherapy and alters their growth characteristics^9-14. These models however often fail to recapitulate long term survival of tumor cells and do not accurately inform the outcomes associated with the most resistant leukemic cell populations that contribute to MRD. In vivo models remain critical and define the "gold standard" for investigation of innovative therapies prior to clinical trials but they are often challenged by the time and cost required to test hypotheses related to resistant tumors and relapse of disease. As such, development of more informative 2D models would be of benefit for pilot investigations to better inform the design of subsequent murine based pre-clinical design.

The 2D in vitro model presented in this report lacks the complexity of the true in vivo microenvironment, but provides a cost effective and reproducible means to interrogate tumor interactions with the microenvironment that lends itself specifically to enrichment of the chemoresistant subpopulation of tumor cells. This distinction is valuable as evaluation of the entire population of tumor cells may mask the phenotype of a minor group of therapy resistant tumor cells that comprise the most important target. An additional advantage is the scalability of the model to fit the analysis of interest. Bulk cultures can be established for those analyses requiring significant recovery of tumor cells, while small scale co-cultures in multi-well plates can be utilized for PCR based analysis or microscopy based evaluations.

Based on this need we developed an in vitro model to address the heterogeneity of disease that is characteristic of B-lineage acute lymphoblastic leukemia (ALL). We demonstrate that ALL cells, which share many characteristics in common with their healthy counterparts, localize to distinct compartments of BMSC or OB co-culture. Three populations of tumor cells are generated that have distinct phenotypes that are valuable for investigation of therapeutic response. Specifically, we demonstrate that (ALL) cells recovered from the "phase dim" (PD) population of co-culture are consistently refractory to therapy with survival that approximates tumor cells that have not been exposed to cytotoxic agents. These ALL cells, from either established cell lines or primary patient samples, migrate beneath adherent stromal cells or osteoblast layers but can be captured following trypsinization of cultures and separation of cell types by utilization of gel type 10 cross-linked dextran (G10) particle columns¹⁵.

Here we present a setup of a 2D co-culture that can be employed to model interactions between bone marrow microenvironment stromal cells (BMSC/OB) and leukemic cells. Of particular importance is the observation that leukemic cells form three spatial subpopulations relative to the stromal cell monolayer and that the PD population represents a chemotherapy resistant tumor population due to its interaction with the BMSC or OB. Furthermore, we demonstrate how to effectively isolate the leukemic cell populations by G10 columns. Of note, we have found that isolation of these subpopulations allows for downstream analysis of the most resistant PD population to determine potential modes of resistance that are conferred to these cells due to their interaction with the bone marrow microenvironment stromal cells or osteoblasts. Techniques that we have utilized downstream of this co-culture and isolation model include flow cytometric evaluation, proteomic analysis and targeted protein expression evaluation as well as more recently developed laser ablation electrospray ionization (LAESI) and Seahorse analysis to evaluate metabolic profiles. Through use of this model in combination with the techniques above we have found that the PD population of leukemic cells has a chemotherapy resistant phenotype that is unique when compared to leukemic cells cultured in media alone or those recovered from the other subpopulations in the same co-culture. As such, this model lends itself to more rigorous evaluation to test strategies targeting the most chemotherapy resistant leukemic cells which derive their resistant phenotype through interaction with the bone marrow microenvironment.

протокол

1. Расширенный Получение

1. Подготовка декстран частицы G10.
   1. Подготовьте G10 суспензии путем добавления 50 мл 1x PBS 10 частиц г G10. Смешайте инверсией и позволяют G10 оседать из фосфатно (PBS) при 4 ° CO / N.
   2. День разделения колонок G10, аспирата PBS из осажденных частиц G10 и добавить 50 мл свежего PBS. Смешайте обращением. Повторите дважды, добавляя 50 мл свежего PBS в осажденных частиц G10 и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию.
2. Культивирование СККМ и OB.
   1. Поддержание как BMSC или OB при 37 ° С в 6% CO ₂ и выращенной на 10 см культуральных планшетах до 90% слияния пока не будет достигнута.
   2. Trypsinize СККМ или OB клетки и разделить 1: 2 на новые 10 см пластинах. Клетки выращивают до этих стандартов пока нет необходимости для лейкозных совместного культивирования.

2. Установление и поддержание совместно культуры

1. Добавить 5-20 ^{× 10 6} лейкозных клеток яп 10 мл опухоли конкретного питательных сред на 80% -90% сливной СККМ или OB пластины.
   Примечание: В нашей лаборатории поддерживает совместное культивирование при 37 ° С в 5% _{O 2,} чтобы лучше перепросматривать микросреду костного мозга, которые, как было показано в диапазоне от 1% до 7% ^16-18. Однако поддержание совместное культивирование при этом напряжения кислорода не является критическим для создания трех лейкозных субпопуляций и по усмотрению лаборатории.
2. Каждый ^{4-й день} удалить все, кроме 1 мл СМИ (в том числе лейкозных клеток в суспензии) и заменить 9 мл свежего лейкозных культуральной среде. При удалении 9 мл среды из пластины, будьте осторожны, чтобы не нарушить клейкий слой СККМ или OB.
   1. Удалить СМИ, наклоняя тарелку в сторону и аспирации СМИ в углу пластины. Кроме того, при добавлении свежей среды, обязательно добавьте по каплям в углу пластины против боковине, чтобы обеспечить минимальное нарушение липкий слой СККМ или OB.
3. После ^{12-й день} совместного культивирования, промыть лейкозных клеток из СККМ или OB слоя с помощью пипетки культуральной среды от блюдо вверх и вниз мягко по блюду приблизительно от 5 до 10 раз, а затем собрать в 15 мл коническую трубку. Reseed на новом 80% -90% сливной СККМ или OB пластины, как описано в шаге 2.1.
   Примечание: нежный полоскание совместного культивирования, как описано в шаге 2.3 снимет S и PB лейкозных клеток, не нарушая СККМ или OB монослой. Это позволяет только опухолевые клетки должны быть переданы к следующему совместно культурального планшета. Это 12-дневный цикл можно повторять столько раз, сколько необходимо на основе потребностей пользователей.

3. Подготовка Колонны G10 бисера

Примечание: Если стерильной анализ ниже или культивирование требуется после G10 разделения колонок следующие шаги должны быть выполнены с использованием стерильной техники и G10 колонки должны быть установлены в стерильной биологической капотом.

1. Предварительно ваRM среды для культивирования клеток до 37 ° С в водяной бане (~ 30 мл на колонке). Использование 10 мл одноразовый шприц, снимите и выбросьте поршень. Добавить стекловату для шприца.
2. С помощью пинцета растащить стекловату на тонкие оголенные жилы. Добавить несколько слоев слегка упакованном стекловаты со шприцем до 2/3 шприца наполнен стекловатой.
   Примечание: Стекловолокно имеет решающее значение для предотвращения свободные G10 частицы от загрязняющих коллекцию лейкозных клеток. Убедитесь стекловата упакован достаточно, чтобы поддержать частицы G10, но не слишком плотно упакованы, чтобы блокировать поток носителя через колонку.
3. Приложить 1-ходовой кран с наконечником шприца в закрытом положении.
4. Зажим Шприц столбец кольца стоят достаточно высоко так 50 мл коническую трубку (сбор трубки) могут быть размещены под краном. Поместите пробирку в колонке шприца.
5. Использование 10 мл пипетки добавить по каплям, частицы G10 ресуспендировали в PBS в колонну сверхустекловата. Продолжайте добавлять частицы G10 пока мл гранул ~ 2 (как измерено градаций на шприце) из G10 частиц форм на верхней части стекловаты.
6. Равновесие колонку G10 с подогретого СМИ.
   1. Добавить 2 мл подогретого СМИ в колонну. Открыть кран клапан медленно, так что среда проходит из колонны по каплям.
   2. Повторите шаг 3.6.1 до в общей сложности 10 мл подогретого СМИ были натыкался колонны.
      Примечание: Если частицы G10 видны в потоке через в пробирку, либо 1) добавить больше частиц G10 для поддержания ~ 2 мл гранул убедившись никаких дополнительных частицы G10 не выйдут из колонки или 2) заменить колонну с неиспользуемом одном и повторение шаги 3.4-3.6.1.
   3. После канализацию подогретого СМИ из колонны, закрыть водопроводный кран и выбросить пробирку для сбора с потоком через. Добавить новую коллекцию трубку под колонку. Колонка готова к загрузке с носителя + клеток смеси.
      Примечание: Столбцыследует использовать немедленно и не дают высохнуть.

4. Разделение 3 субпопуляции в совместной культуре

1. Коллекция подвеска (S) опухоли субпопуляции.
   1. Аспирируйте средств массовой информации из со-планшет для культивирования с пипеткой и осторожно повторно применить те же средства массовой информации, чтобы ополоснуть тарелку и собирать носители, содержащие лейкозных клеток в 15 мл коническую трубку. В лейкозных клеток, собранных являются S субпопуляции.
2. Коллекция Фаза Bright (PB) субпопуляции опухоли.
   1. Добавить 10 мл свежей среды обратно на совместное культурального планшета. Промыть энергично с помощью пипетки сообщили СМИ вверх и вниз примерно в 5 раз, чтобы удалить прилипшие лейкозных клеток, но не достаточно сильно, чтобы выбить клейкий СККМ / OB компонент.
   2. Аспирируйте с пипеткой и собирать СМИ в 15 мл коническую трубку. Собранные клетки ПБ субпопуляции.
3. Коллекция Фаза Dim (PD) субпопуляции опухоли.
   1. Промыть пластины с 1 мл PBS в бэрOve остальные СМИ. Trypsinize совместное культивирование пластина с 3 мл трипсина и место в 37 ° C инкубаторе в течение 5 мин.
   2. Удалить пластину из инкубатора и слегка постучите сторон пластины, чтобы сместить клейкий СККМ / OB.
   3. Добавить 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и пипетки вверх и вниз 3-5 раз, чтобы разбивайте большие клеточные агрегаты.
   4. Собирают носитель с клетками в конической трубе 15 мл. Эти клетки неочищенную PD субпопуляции с СККМ / OB, а также.
4. Центрифуга 3 изолированные субпопуляции при 400 мкг в течение 7 мин. Аспирируйте и отбросить супернатант затем по отдельности ресуспендируют гранул в 1 мл подогретого СМИ. Клетки готовы быть загружали на колонку G10.

5. Загрузка Сотрудничество культуры клеток на G10 колонке

Примечание: Убедитесь, кран полностью закрыт перед добавлением среды, содержащей клетки в колонну G10. Кроме того, каждый субпопуляции должны быть подбежал отдельной колонке G10, чтобы не Вве каких-либо предубеждений между населением в прямом анализа.

1. Использование 1000 мкл пипетки внести 1 мл каждой клеточной субпопуляции в подогретого СМИ в отдельную колонку G10 каплям. Убедитесь, что носитель, содержащий клетки остается на вершине или в G10 гранул. Разрешить клетки инкубировать на G10 гранулы в течение 20 мин при комнатной температуре.
   Примечание: Запорный остается закрытым для продолжительности инкубации.

6. Сбор лейкозных клеток из G10 колонке

1. Добавить 1-3 мл подогретого СМИ, чтобы каждый столбец G10. Открыть кран клапан и позволяют СМИ медленно выйти каплям колонна.
   Примечание: Очень важно, чтобы поддерживать скорость медленного потока из колонки или G10 осадок, содержащий СККМ / OB можно мыть из колонки и загрязнять изолированные лейкозных клеток.
2. Продолжайте добавлять подогретого СМИ небольшими порциями (1-2 мл) на колонке G10 пока в общей сложности от 15 до 20 мл пробежала колонку и была собрана. Закрыть кран ваLVE и колпачок коллекция трубки.
   Примечание: Если осадок G10 частиц видно на дне пробирку, осторожно удалить носитель из трубки, оставляя G10 осадок частиц в покое и передача новую пробирку.
3. Центрифуга собраны носители при 400 мкг в течение 7 минут при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в буфере соответствующей для нисходящего применения.
4. Клетки теперь чистый население лейкозных клеток, свободных от СККМ или загрязнения OB и готовы быть применены для последующих применений при усмотрению пользователя.
   Примечание: лейкозных жизнеспособность клеток должна оставаться неизменной при прохождении клетки через G10 столбцов.

Результаты

Успешное настройка и культура этой совместным культивированием модели приведет к созданию 3 субпопуляции лейкозных клеток по отношению к клейкой СККМ или OB монослоя. Рис 1 показано, как все клетки высевали в монослой СККМ изначально появляются как только оди...

Обсуждение

Минимальной остаточной болезни (МОБ), который способствует рецидиву заболевания продолжает оставаться основной клинической проблемой при лечении агрессивной огнеупоров ALL, а также, множество других гематологических опухолей. Микросреда костного мозга является наиболее частой локал...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 sephadex beads	Sigma	G10120	Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe	BD	309604
Glass wool	Pyrex	3950
1-way stopcocks	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021039	Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021037	Used for cell collection
Fetal Bovine Serum	Sigma	F6178
0.05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes	Greiner Bio-One	664160
Culture media
Osteoblast culture media	PromoCell	C-27001	For human osteoblast media
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	For tumor media prepation
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts	PromoCell	C-12720	Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations.
Human Bone Morrow Stromal Cells	WVU Biospecimen Core		De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.