Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi<em&gt; İn Vitro</em

Özet

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Özet

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Giriş

The overall goal of the method described is to provide an efficient, cost-effective in vitro approach that supports investigation of the mechanisms that underlie bone marrow supported survival of leukemic cells during chemotherapy exposure. It is well documented that surviving residual tumor cells that persist after treatment contribute to relapse of disease that is often more aggressive than that at diagnosis and is often less effectively treated^1-8. Models that include leukemic cells in isolation, such as those limited to culture of cells in media alone, for testing of therapeutic approaches do not factor in these critical signals, or the heterogeneity of disease that occurs in response to availability of niche derived cues in which tumor cell subpopulations with very specific interactions with niche cells derive enhanced protection. Standard 2D co-culture models that co-culture bone marrow derived stromal cells and leukemic cells have somewhat addressed the contribution of the marrow niche and have shown that interaction with bone marrow microenvironment cells increases their resistance to chemotherapy and alters their growth characteristics^9-14. These models however often fail to recapitulate long term survival of tumor cells and do not accurately inform the outcomes associated with the most resistant leukemic cell populations that contribute to MRD. In vivo models remain critical and define the "gold standard" for investigation of innovative therapies prior to clinical trials but they are often challenged by the time and cost required to test hypotheses related to resistant tumors and relapse of disease. As such, development of more informative 2D models would be of benefit for pilot investigations to better inform the design of subsequent murine based pre-clinical design.

The 2D in vitro model presented in this report lacks the complexity of the true in vivo microenvironment, but provides a cost effective and reproducible means to interrogate tumor interactions with the microenvironment that lends itself specifically to enrichment of the chemoresistant subpopulation of tumor cells. This distinction is valuable as evaluation of the entire population of tumor cells may mask the phenotype of a minor group of therapy resistant tumor cells that comprise the most important target. An additional advantage is the scalability of the model to fit the analysis of interest. Bulk cultures can be established for those analyses requiring significant recovery of tumor cells, while small scale co-cultures in multi-well plates can be utilized for PCR based analysis or microscopy based evaluations.

Based on this need we developed an in vitro model to address the heterogeneity of disease that is characteristic of B-lineage acute lymphoblastic leukemia (ALL). We demonstrate that ALL cells, which share many characteristics in common with their healthy counterparts, localize to distinct compartments of BMSC or OB co-culture. Three populations of tumor cells are generated that have distinct phenotypes that are valuable for investigation of therapeutic response. Specifically, we demonstrate that (ALL) cells recovered from the "phase dim" (PD) population of co-culture are consistently refractory to therapy with survival that approximates tumor cells that have not been exposed to cytotoxic agents. These ALL cells, from either established cell lines or primary patient samples, migrate beneath adherent stromal cells or osteoblast layers but can be captured following trypsinization of cultures and separation of cell types by utilization of gel type 10 cross-linked dextran (G10) particle columns¹⁵.

Here we present a setup of a 2D co-culture that can be employed to model interactions between bone marrow microenvironment stromal cells (BMSC/OB) and leukemic cells. Of particular importance is the observation that leukemic cells form three spatial subpopulations relative to the stromal cell monolayer and that the PD population represents a chemotherapy resistant tumor population due to its interaction with the BMSC or OB. Furthermore, we demonstrate how to effectively isolate the leukemic cell populations by G10 columns. Of note, we have found that isolation of these subpopulations allows for downstream analysis of the most resistant PD population to determine potential modes of resistance that are conferred to these cells due to their interaction with the bone marrow microenvironment stromal cells or osteoblasts. Techniques that we have utilized downstream of this co-culture and isolation model include flow cytometric evaluation, proteomic analysis and targeted protein expression evaluation as well as more recently developed laser ablation electrospray ionization (LAESI) and Seahorse analysis to evaluate metabolic profiles. Through use of this model in combination with the techniques above we have found that the PD population of leukemic cells has a chemotherapy resistant phenotype that is unique when compared to leukemic cells cultured in media alone or those recovered from the other subpopulations in the same co-culture. As such, this model lends itself to more rigorous evaluation to test strategies targeting the most chemotherapy resistant leukemic cells which derive their resistant phenotype through interaction with the bone marrow microenvironment.

Protokol

1. Gelişmiş Hazırlık

1. dekstran G10 parçacıklarının hazırlanması.
   1. 10 g G10 parçacıklarına PBS 1X 50 ml ekleyerek G10 bulamaç hazırlanır. tersine çevirerek karıştırın ve G10 4 ° CO / N fosfat tamponlu salin (PBS) üzerinden yerleşmek için izin verir.
   2. G10 sütun ayrılık günü, yerleşmiş G10 parçacıklar aspirat PBS ve 50 ml taze PBS ekleyin. tersine çevirerek karıştırın. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de yerleşmiş G10 parçacıklar ve saklamak için 50 ml taze PBS eklenerek, iki kez tekrarlayın.
2. BMSC ve OB Kültürleme.
   1. % 90 kaynaşma elde edilene kadar% 6 _CO2 ve 10 cm doku kültürü plakaları üzerinde büyütülmüş, 37 ° C 'de BMSC veya OB hem koruyun.
   2. Yeni 10 cm plakalar üzerine 2: Trypsinize BMSC veya OB hücreleri ve 1 ayrıldı. lösemi ko-kültür için gerekli olana kadar hücreleri bu standartlara göre yetiştirilir.

2. oluşturulması ve Co-kültür bakımı

1. 5-20 ^x 10 6 lösemi hücreleri ekleyin in,% 80-% 90 konfluent BMSC veya OB plakasına tümöre özgü kültür ortamı 10 mi.
   NOT: Lab daha% 1 ila% 7 ^16-18 arasındadır gösterilmiştir kemik iliği mikro-özetlemek için,% 5 _O2, 37 ° C 'de ko-kültürler tutar. Ancak, bu oksijen gerilimi ile ortak kültürlerini koruyarak üç lösemi alt popülasyonlar kurulması için kritik değildir ve laboratuar takdirine bağlıdır.
2. Her ^4. gün (süspansiyon lösemik hücreler de dahil olmak üzere), 1 ml'lik ortam, ancak kaldırmak ve 9 ml taze lösemi kültür ortamı ile değiştirin. plakadan medya 9 ml çıkarırken, BMSC veya OB yapışık katman rahatsız etmemek için dikkatli olun.
   1. plaka köşesinde yan ve aspirat medya plaka eğerek ortamı çıkarın. Taze medya ekleyerek, ayrıca, BMSC veya OB yapışık tabakanın en az kesintiye sağlamak için yan duvar karşı plaka köşesinde damla damla eklemeyi unutmayın.
3. Ko-kültür ^12. günün ardından, yaklaşık 5 ila 10 kat çanak up kültür ortamı ve aşağı pipetleme hafifçe çanak üzerinde tarafından BHYK veya OB katmanından lösemik hücreleri yıkayın ve daha sonra 15 ml konik tüp içinde toplamak. aşama 2.1 'de tarif edildiği gibi, yeni% 80-% 90 konfluent BHYK veya OB plaka üzerine reseed.
   NOT: BMSC veya OB tek tabaka bozmadan S ve PB lösemi hücreleri kaldıracak adım 2.3 açıklandığı gibi ko-kültür yumuşak durulama. Bu, sadece tümör hücreleri aşağıdaki ko-kültür plakasına aktarılır sağlar. Bu 12 gün döngüsü kullanıcı ihtiyaçlarına göre gerektiğinde kadar birçok kez tekrar edilebilir.

3. Hazırlanması G10 Boncuk Sütunlar

NOT: Steril aşağı analiz veya kültür G10 sütun ayrılması aşağıdaki gerekiyorsa aşağıdaki adımlar steril tekniği kullanılarak yapılmalıdır ve G10 sütunları steril biyolojik kaputu kurulum olmalıdır.

1. Ön-WARM hücre kültür ortamı, su banyosu içinde 37 ° C (~ 30 mi kolon başına). 10 ml'lik tek kullanımlık şırınga kullanarak, kaldırmak ve pistonu atın. şırınga, cam yünü ekleyin.
2. cımbız kullanarak, ince gevşek ipliklerini içine cam yünü dışında çekin. Şırınga 2/3 cam yünü ile dolana kadar şırınga hafifçe dolu cam yünü çoklu katmanlar ekleyin.
   NOT: cam yünü lösemik hücre toplama kirletmesini gevşek G10 partikülleri önlemek için çok önemlidir. Emin cam yünü G10 parçacıkları desteklemek için yeterli dolu, ama çok yoğun sütun aracılığıyla medya akışını engellemek için dolu değil emin olun.
3. kapalı konumda bir şırınganın ucu 1 yollu valf ekleyin.
4. halkaya Kelepçe şırınga sütunu yani 50 ml konik tüp (toplama tüp) musluk altına yerleştirilebilir yeterince yüksek duruyor. şırınga sütununda toplama tüpü yerleştirin.
5. 10 ml'lik bir pipet üstünde sütun PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi, G10 parçacıkları ekleme damla damla kullanılmasıcam yünü. cam yünü üzerine G10 partikülleri form (şırınga mezuniyet ile ölçülen) bir p 2 mi pelet kadar G10 parçacıklarının eklenmesi devam edin.
6. önceden ısıtılmış medya ile G10 sütun dengeye.
   1. sütununa önceden ısıtılmış ortam 2 ml ilave edilir. Bu kadar açık musluk vana yavaş medya damla damla sütunun dışarı akar.
   2. önceden ısıtılmış ortam 10 ml'lik bir toplam kadar adımı tekrar 3.6.1 sütun karşılaşıncaya edilmiştir.
      Not: G10 partikülleri toplama tüpü boyunca akış görülen ya 1) + G10 parçacıklarının eklenmesi durumunda ek bir G10 taneciklerinin kolona kaçmasına emin ~ 2 mi pelet korumak ya da 2) kullanılmayan bir ve tekrar ile sütun yerine 3.4-3.6.1 adımları.
   3. sütunundan önceden ısıtılmış medya tahliye ettikten sonra, stopcock kapatın ve içinden akışı ile toplama tüpü atın. sütununda yeni koleksiyonu tüp ekleyin. Kolon ortamı + hücre karışımı ile yüklenebilir hazırdır.
      NOT: Kolonlarhemen kullanılmıştır ve kurumaya izin verilmelidir.

4. Co-kültür içinde 3 alt popülasyonlar ayırmak

1. Süspansiyon (S) tümör ICSI'nin toplanması.
   1. ko-kültür plaka aspire medya pipet ile ve yavaşça plaka yıkayın ve bir 15 ml konik tüp lösemi hücreleri içeren medya toplamak için aynı medya uygulamak yeniden. Toplanan lösemili hücreler S ICSI'nin vardır.
2. Faz Parlak (PB) tümör ICSI'nin toplanması.
   1. ko-kültür plaka üzerine geri 10 ml taze medya ekleyin. yapışık lösemi hücreleri ancak yapışık BMSC / OB bileşeni çıkarmak için yeterince sert değil kaldırmak için yukarı ve aşağı yaklaşık 5 kat eklendi medya pipetleme kuvvetlice çalkalayın.
   2. pipet ile aspire ve 15 ml konik tüp medya toplamak. Toplanan hücreler PB ICSI'nin vardır.
3. Faz Dim (PD) tümör ICSI'nin toplanması.
   1. rem 1 ml PBS ile durulayın plakaove kalan ortam. 5 dakika için 37 ° C inkübatör içine 3 mi tripsin ve yeri ile tripsinize ko-kültür plakası.
   2. yapışık BMSC / OB çıkarmak için plakanın kenarlarına dokunun yavaşça inkübatör dışına plakasını çıkarın ve.
   3. dışında büyük hücre agrega kırmak için 1 ml fetal sığır serumu (FBS) ve pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez ekleyin.
   4. 15 ml konik tüp hücrelerin medyayı toplayın. Bu hücreler de BMSC / OB ile arıtılmamış PD ICSI'nin vardır.
4. Santrifüj 3 7 dakika boyunca 400 x g'de subpopülasyonunun izole edilmiştir. Aspire ve atın yüzer madde daha sonra tek tek 1 ml önceden ısıtılmış medya pelet tekrar süspansiyon. Hücreler G10 kolona yüklendi hazırdır.

G10 Sütun üzerine 5. Yükleme Co-kültür Hücreleri

NOT: Emin stopcock olun tamamen G10 sütun medya içeren hücreleri eklemeden önce kapatılır. Ayrıca, her subpopülasyonu introduc öyle değil ayrı bir G10 kolonu üzerinde koştu olmalıdıraşağı analizde nüfus arasında herhangi bir önyargı e.

1. 1.000 ul pipet kullanarak, damla damla ayrı bir G10 sütuna önceden ısıtılmış medya her hücre alt populasyonun 1 ml ekleyin. hücreleri içeren medya üstünde veya G10 pelet içinde kalmasını sağlamak. Hücreler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca G10 pelet üzerinde inkübe izin verin.
   NOT: musluğu inkübasyon süresince kapalı kalır.

6. G10 Sütun lösemik hücreler Toplama

1. Her G10 sütun 1-3 ml önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Açık musluk vana ve medya yavaş yavaş kolon damla damla çıkmak için izin verir.
   NOT: sütun veya sütun yıkayın ve izole lösemi hücreleri kirletebilir BMSC / OB içeren G10 pelet yavaş akış hızını korumak için çok önemlidir.
2. 15 ila 20 ml arasında bir toplam kadar G10 kolonuna küçük artışlarla (1-2 mL) içinde önceden ısıtılmış ortam eklemeye devam sütun içinden geçen ve elde edilmiştir. Yakın musluk valve ve kapak toplama tüpü.
   NOT: Bir G10 parçacık pelet toplama tüpün dibinde görülürse, yavaşça G10 parçacık pelet rahatsız ve yeni bir tüpe transfer bırakarak tüpten ortamı çıkarın.
3. Santrifüj oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 400 x g'de medyayı topladı. Süpernatantı ve alt uygulama için uygun tampon hücre pelletini.
4. Hücreler artık BHYK veya OB kirlenme serbest lösemi hücrelerinin saf nüfus ve kullanıcı takdirine aşağı uygulamalara uygulanacak hazırız.
   NOT: G10 sütunlar aracılığıyla hücrelere geçerken lösemi hücre canlılığı değişmeden kalmalıdır.

Sonuçlar

Bu ko-kültür modeli Başarılı kurulum ve kültür. Yapışık BMSC veya OB tek tabaka göre lösemik hücrelerin 3 alt popülasyonlarının kurulması neden 1 BMSC tek tabaka içine numaralı seribaşı ALL hücreleri başlangıçta askıya olarak yalnızca tek bir nüfusa nasıl görüneceği göstermektedir olacak lösemi hücreleri. lösemik hücreler lösemi hücrelerinin 3 mekansal alt-popülasyonunu oluşturulması için BHYK etkileşime 4 gün...

Tartışmalar

Hastalığın nüks katkıda minimal rezidüel hastalık (MRD) HEPSİ agresif refrakter tedavisinde önemli bir klinik sorundur, yanı sıra, diğer hematolojik maligniteler bir ev sahibi olmaya devam ediyor. Kemik iliği mikro TÜM ^3,8 nüks en sık sitedir. Bu nedenle, kemik iliği mikro modeli modelleri kemoterapi maruziyeti sırasında lösemili tümör hücre canlılığı ve MRD bakımı ile ilgili hipotezleri test etmek için hayati araçlardır. fare modelleri uyuşturucu etkinliği ile ilgili test so...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 sephadex beads	Sigma	G10120	Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe	BD	309604
Glass wool	Pyrex	3950
1-way stopcocks	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021039	Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021037	Used for cell collection
Fetal Bovine Serum	Sigma	F6178
0.05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes	Greiner Bio-One	664160
Culture media
Osteoblast culture media	PromoCell	C-27001	For human osteoblast media
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	For tumor media prepation
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts	PromoCell	C-12720	Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations.
Human Bone Morrow Stromal Cells	WVU Biospecimen Core		De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.