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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Résumé

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Introduction

The overall goal of the method described is to provide an efficient, cost-effective in vitro approach that supports investigation of the mechanisms that underlie bone marrow supported survival of leukemic cells during chemotherapy exposure. It is well documented that surviving residual tumor cells that persist after treatment contribute to relapse of disease that is often more aggressive than that at diagnosis and is often less effectively treated1-8. Models that include leukemic cells in isolation, such as those limited to culture of cells in media alone, for testing of therapeutic approaches do not factor in these critical signals, or the heterogeneity of disease that occurs in response to availability of niche derived cues in which tumor cell subpopulations with very specific interactions with niche cells derive enhanced protection. Standard 2D co-culture models that co-culture bone marrow derived stromal cells and leukemic cells have somewhat addressed the contribution of the marrow niche and have shown that interaction with bone marrow microenvironment cells increases their resistance to chemotherapy and alters their growth characteristics9-14. These models however often fail to recapitulate long term survival of tumor cells and do not accurately inform the outcomes associated with the most resistant leukemic cell populations that contribute to MRD. In vivo models remain critical and define the "gold standard" for investigation of innovative therapies prior to clinical trials but they are often challenged by the time and cost required to test hypotheses related to resistant tumors and relapse of disease. As such, development of more informative 2D models would be of benefit for pilot investigations to better inform the design of subsequent murine based pre-clinical design.

The 2D in vitro model presented in this report lacks the complexity of the true in vivo microenvironment, but provides a cost effective and reproducible means to interrogate tumor interactions with the microenvironment that lends itself specifically to enrichment of the chemoresistant subpopulation of tumor cells. This distinction is valuable as evaluation of the entire population of tumor cells may mask the phenotype of a minor group of therapy resistant tumor cells that comprise the most important target. An additional advantage is the scalability of the model to fit the analysis of interest. Bulk cultures can be established for those analyses requiring significant recovery of tumor cells, while small scale co-cultures in multi-well plates can be utilized for PCR based analysis or microscopy based evaluations.

Based on this need we developed an in vitro model to address the heterogeneity of disease that is characteristic of B-lineage acute lymphoblastic leukemia (ALL). We demonstrate that ALL cells, which share many characteristics in common with their healthy counterparts, localize to distinct compartments of BMSC or OB co-culture. Three populations of tumor cells are generated that have distinct phenotypes that are valuable for investigation of therapeutic response. Specifically, we demonstrate that (ALL) cells recovered from the "phase dim" (PD) population of co-culture are consistently refractory to therapy with survival that approximates tumor cells that have not been exposed to cytotoxic agents. These ALL cells, from either established cell lines or primary patient samples, migrate beneath adherent stromal cells or osteoblast layers but can be captured following trypsinization of cultures and separation of cell types by utilization of gel type 10 cross-linked dextran (G10) particle columns15.

Here we present a setup of a 2D co-culture that can be employed to model interactions between bone marrow microenvironment stromal cells (BMSC/OB) and leukemic cells. Of particular importance is the observation that leukemic cells form three spatial subpopulations relative to the stromal cell monolayer and that the PD population represents a chemotherapy resistant tumor population due to its interaction with the BMSC or OB. Furthermore, we demonstrate how to effectively isolate the leukemic cell populations by G10 columns. Of note, we have found that isolation of these subpopulations allows for downstream analysis of the most resistant PD population to determine potential modes of resistance that are conferred to these cells due to their interaction with the bone marrow microenvironment stromal cells or osteoblasts. Techniques that we have utilized downstream of this co-culture and isolation model include flow cytometric evaluation, proteomic analysis and targeted protein expression evaluation as well as more recently developed laser ablation electrospray ionization (LAESI) and Seahorse analysis to evaluate metabolic profiles. Through use of this model in combination with the techniques above we have found that the PD population of leukemic cells has a chemotherapy resistant phenotype that is unique when compared to leukemic cells cultured in media alone or those recovered from the other subpopulations in the same co-culture. As such, this model lends itself to more rigorous evaluation to test strategies targeting the most chemotherapy resistant leukemic cells which derive their resistant phenotype through interaction with the bone marrow microenvironment.

Protocole

1. Préparation avancée

  1. Préparation de particules G10 dextran.
    1. Préparer G10 suspension en ajoutant 50 ml de PBS 1x à 10 g de particules G10. Mélanger par inversion et permet G10 se déposer de tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° CO / N.
    2. Le jour du G10 colonne de séparation, aspirer PBS à partir de particules G10 installés et ajouter 50 ml PBS frais. Mélanger par inversion. Répéter deux fois, en ajoutant 50 ml PBS frais à particules G10 sédentaires et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
  2. Cultivant BMSC et OB.
    1. Maintenir à la fois BMSC ou OB à 37 ° C dans 6% de CO 2 et 10 cm cultivées sur des plaques de culture tissulaire jusqu'à 90% de confluence est atteinte.
    2. Trypsiniser BMSC ou cellules OB et divisés 1: 2 sur de nouvelles plaques cm 10. Les cellules sont cultivées à ces normes jusqu'à son utilisation pour la co-culture leucémique.

2. Établir et maintenir des Co-culture

  1. Ajouter 5-20 x 10 6 cellules leucémiques in 10 ml de milieu de culture spécifique de la tumeur sur un 80% -90% de confluence BMSC ou plaque d'OB.
    NOTE: Notre laboratoire maintient co-cultures à 37 ° C dans 5% de O 2 pour mieux récapituler le microenvironnement de la moelle osseuse qui a été montré à la gamme de 1% à 7% de 16 à 18. Toutefois, le maintien des co-cultures à cette tension d'oxygène est pas critique pour la mise en place des trois sous-populations leucémiques et est à la discrétion du laboratoire.
  2. Chaque 4 e jour supprimer tout sauf 1 ml de médias (y compris les cellules leucémiques en suspension) et le remplacer par 9 ml frais milieux de culture leucémique. Lors du retrait de 9 ml de milieu de la plaque, veiller à ne pas perturber la couche adhérente BMSC ou OB.
    1. Retirez le support en inclinant la plaque sur le support latéral et aspirer dans le coin de la plaque. En outre, lors de l'ajout du milieu frais, veillez à ajouter goutte à goutte dans le coin de la plaque contre la paroi latérale pour assurer une perturbation minimale de la couche adhérente BMSC ou OB.
  3. Après le 12 e jour de co-culture, rincer les cellules leucémiques de BMSC ou couche de OB par pipetage des milieux de culture de plat et doucement sur ​​le plat d'environ 5 à 10 fois, puis recueillir dans 15 ml tube conique. Réensemencer sur un nouveau 80% -90% de confluence BMSC ou plaque OB comme décrit dans l'étape 2.1.
    NOTE: Le rinçage doux de la co-culture tel que décrit dans l'étape 2.3 va éliminer les cellules leucémiques S et PB sans perturber la monocouche BMSC ou OB. Ceci permet que des cellules tumorales devant être transférées à la plaque de co-culture suivante. Ce cycle de 12 jours peut être répétée autant de fois que nécessaire en fonction des besoins des utilisateurs.

3. Préparer les colonnes perles G10

NOTE: Si l'analyse ou la culture aval stérile est nécessaire après la séparation de la colonne G10 les étapes suivantes doivent être effectuées en utilisant une technique stérile et colonnes du G10 devraient être mis en place dans une hotte biologique stérile.

  1. Pré-warm milieux de culture de cellules à 37 ° C dans un bain d'eau (~ 30 ml par colonne). En utilisant une seringue de 10 ml à usage unique, enlever et jeter plongeur. Ajouter la laine de verre de la seringue.
  2. En utilisant une pince à épiler, séparer la laine de verre en fines mèches en vrac. Ajouter plusieurs couches de laine de verre légèrement tassée à la seringue jusqu'à 2/3 de la seringue est rempli de laine de verre.
    NOTE: La laine de verre est crucial pour empêcher les particules G10 lâches de contaminer la collecte de cellules leucémiques. Assurez-vous que la laine de verre est emballé assez pour soutenir les particules G10, mais pas trop dense pour bloquer l'écoulement de médias à travers la colonne.
  3. Fixez 1 voie robinet à la pointe de la seringue dans la position fermée.
  4. colonne de seringue de serrage à bague reposer suffisamment élevée pour un tube conique de 50 ml (tube de collecte) peut être placé sous le robinet. Placez le tube de collecte dans la colonne de la seringue.
  5. En utilisant une pipette de 10 ml ajouter, goutte à goutte, des particules G10 remises en suspension dans PBS à la colonne au-dessus dela laine de verre. Continuez à ajouter des particules G10 jusqu'à ce qu'un ml culot ~ 2 (tel que mesuré par des graduations sur la seringue) du G10 particules formes au-dessus de la laine de verre.
  6. Équilibrer la colonne G10 avec les médias préchauffées.
    1. Ajouter 2 ml de milieu préchauffée à la colonne. robinet d'arrêt ouvert lentement, de sorte que le support sort de la colonne, goutte à goutte.
    2. Répétez l'étape 3.6.1 jusqu'à un total de 10 ml de milieu préchauffé ont été couru à travers la colonne.
      NOTE: Si des particules du G10 sont vus dans l'écoulement à travers dans le tube de collecte, soit 1) ajouter plus de particules du G10 à maintenir ~ 2 ml culot faire en sorte qu'aucune particule G10 supplémentaires échapper à la colonne ou 2) remplacer la colonne avec un un utilisé et répétez étapes 3.4-3.6.1.
    3. Après les drains des médias préchauffées de la colonne, fermer le robinet d'arrêt et jeter le tube collecteur d'écoulement à travers. Ajouter un nouveau tube de prélèvement dans la colonne. La colonne est prêt à être chargé avec un mélange de médias + cellulaire.
      NOTE: Les Colonnesdoit être utilisé immédiatement et ne laisse sécher.

4. Séparation des 3 sous-populations au sein de co-culture

  1. Collection sous-population de la suspension (S) de la tumeur.
    1. Aspirer le milieu de la plaque de co-culture avec la pipette et doucement appliquer de nouveau les mêmes médias pour rincer la plaque et de recueillir les médias contenant des cellules leucémiques dans un tube de 15 ml conique. Les cellules leucémiques recueillies sont la sous-population S.
  2. Collection de la phase Bright (PB) sous-population de la tumeur.
    1. Ajouter 10 ml du milieu frais de retour sur la plaque de co-culture. Rincer vigoureusement par pipetage médias ajoutée de haut en bas environ 5 fois pour éliminer les cellules leucémiques adhérentes, mais pas assez fort pour déloger adhérente BMSC / OB composant.
    2. Aspirer à la pipette et recueillir les médias dans un tube conique de 15 ml. Les cellules recueillies sont la sous-population PB.
  3. Collection de la phase Dim (PD) sous-population de la tumeur.
    1. plaque rinçage avec 1 ml de PBS à remmédias restants ove. Trypsiniser plaque co-culture avec 3 ml de trypsine et le lieu dans 37 ° C incubateur pendant 5 min.
    2. Retirer la plaque de l'incubateur et tapotez doucement côtés de la plaque pour déloger adhérente BMSC / OB.
    3. Ajouter 1 ml de sérum de veau fœtal (FBS) et la pipette de haut en bas 3-5 fois pour briser les grands agrégats de cellules.
    4. Collecter des supports avec les cellules dans un tube conique de 15 ml. Ces cellules sont la sous-population de PD non purifié avec BMSC / OB ainsi.
  4. sous-populations centrifugeuse 3 isolé à 400 g pendant 7 min. Aspirer et éliminer le surnageant puis remettre en suspension individuellement pastilles dans 1 ml de médias préchauffées. Les cellules sont prêtes à être chargées sur une colonne G10.

5. Chargement de co-culture des cellules sur la colonne G10

NOTE: Assurez-vous que le robinet est complètement fermé avant d'ajouter les cellules des milieux contenant la colonne G10. En outre, chaque sous-population doit être exécuté sur une colonne G10 séparée afin de ne pas Introduce toute polarisation entre les populations dans l'analyse en aval.

  1. En utilisant une pipette de 1000 pi, ajouter 1 ml de chaque sous-population de cellules dans des milieux préchauffées à une colonne séparée G10 goutte à goutte. Assurez-vous que le support contenant les cellules reste au-dessus ou au sein du G10 culot. Laisser les cellules incuber le G10 culot pendant 20 min à température ambiante.
    NOTE: Robinet reste fermé pendant la durée de l'incubation.

6. Recueillir les cellules leucémiques du G10 Colonne

  1. Ajouter 1-3 ml de milieu préchauffé à chaque colonne G10. Ouvrir robinet d'arrêt et de permettre aux médias de sortir lentement la colonne goutte à goutte.
    NOTE: Il est essentiel de maintenir un débit lent de la colonne ou le culot G10 contenant BMSC / OB peut laver de la colonne et de contaminer les cellules leucémiques isolées.
  2. Continuer à ajouter des médias préchauffées par petits incréments (1-2 ml) à la colonne de G10 jusqu'à un total de 15 à 20 ml a traversé la colonne et a été recueilli. Fermer le robinet vatube de collecte LVE et le bouchon.
    NOTE: Si un culot G10 de particules est observée à la base du tube de collecte, retirez délicatement les médias du tube laissant culot de particules G10 intact et le transfert dans un nouveau tube.
  3. Centrifugeuse recueilli médias à 400 g pendant 7 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans un tampon approprié pour application en aval.
  4. Les cellules sont maintenant une population pure de cellules leucémiques libres de BMSC ou contamination OB et sont prêtes à être appliquées à des applications en aval, à la discrétion de l'utilisateur.
    NOTE: la viabilité cellulaire leucémique devrait rester inchangée lors du passage des cellules à travers des colonnes du G10.

Résultats

Installation réussie et la culture de ce modèle de co-culture se traduira par la création de 3 sous-populations de cellules leucémiques par rapport à la BMSC ou OB monocouche adhérente. La figure 1 montre comment toutes cellules ensemencées dans une monocouche BMSC apparaissent d'abord comme une seule population de suspension les cellules leucémiques. Au cours des 4 jours cellules leucémiques interagissent avec le BMSC pour former 3 sous-populations de cellu...

Discussion

maladie résiduelle minimale (MRD), qui contribue à la rechute de la maladie continue à être un défi clinique majeure dans le traitement de réfractaires agressive ALL, ainsi que, une foule d'autres hémopathies malignes. Le microenvironnement de la moelle osseuse est le site le plus fréquent de rechute chez ALL 3,8. En tant que tel, les modèles qui modélisent le microenvironnement de la moelle osseuse sont des outils indispensables pour tester des hypothèses relatives à la survie des cellules tu...

Déclarations de divulgation

The authors have no competing financial interests.

Remerciements

Supported by National Institutes of Health (NHLBI) R01 HL056888 (LFG), National Cancer Institute (NCI) RO1 CA134573NIH (LFG), P30 GM103488 (LFG), WV CTR-IDEA NIH 1U54 GM104942, the Alexander B. Osborn Hematopoietic Malignancy and Transplantation Program, and the WV Research Trust Fund. We are grateful for the support of Dr. Kathy Brundage and the West Virginia University Flow Cytometry Core Facility, supported by NIH S10-OD016165 and the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (CoBRE P30GM103488 and INBRE P20GM103434).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
G10 sephadex beadsSigmaG10120Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringeBD309604
Glass woolPyrex3950
1-way stopcocksWorld Precision Instruments, Inc.14054-10
50 ml conical centrifuge tubesWorld Wide Medical Products41021039Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubesWorld Wide Medical Products41021037Used for cell collection
Fetal Bovine SerumSigmaF6178
0.05% Trypsin Mediatech, Inc.25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture DishesGreiner Bio-One664160
Culture media
Osteoblast culture media PromoCellC-27001For human osteoblast media 
RPMI 1640 mediaMediatech, Inc.15-040For tumor media prepation 
Cell lines
Adherent Cells:
Human OsteoblastsPromoCellC-12720Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. 
Human Bone Morrow Stromal CellsWVU Biospecimen CoreDe-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REHATCCATCC-CRL-8286REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
SD-1DSMZACC 366SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.

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