モデル化学療法抵抗性白血病<em&gt;インビトロ</em

要約

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

要約

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

概要

The overall goal of the method described is to provide an efficient, cost-effective in vitro approach that supports investigation of the mechanisms that underlie bone marrow supported survival of leukemic cells during chemotherapy exposure. It is well documented that surviving residual tumor cells that persist after treatment contribute to relapse of disease that is often more aggressive than that at diagnosis and is often less effectively treated^1-8. Models that include leukemic cells in isolation, such as those limited to culture of cells in media alone, for testing of therapeutic approaches do not factor in these critical signals, or the heterogeneity of disease that occurs in response to availability of niche derived cues in which tumor cell subpopulations with very specific interactions with niche cells derive enhanced protection. Standard 2D co-culture models that co-culture bone marrow derived stromal cells and leukemic cells have somewhat addressed the contribution of the marrow niche and have shown that interaction with bone marrow microenvironment cells increases their resistance to chemotherapy and alters their growth characteristics^9-14. These models however often fail to recapitulate long term survival of tumor cells and do not accurately inform the outcomes associated with the most resistant leukemic cell populations that contribute to MRD. In vivo models remain critical and define the "gold standard" for investigation of innovative therapies prior to clinical trials but they are often challenged by the time and cost required to test hypotheses related to resistant tumors and relapse of disease. As such, development of more informative 2D models would be of benefit for pilot investigations to better inform the design of subsequent murine based pre-clinical design.

The 2D in vitro model presented in this report lacks the complexity of the true in vivo microenvironment, but provides a cost effective and reproducible means to interrogate tumor interactions with the microenvironment that lends itself specifically to enrichment of the chemoresistant subpopulation of tumor cells. This distinction is valuable as evaluation of the entire population of tumor cells may mask the phenotype of a minor group of therapy resistant tumor cells that comprise the most important target. An additional advantage is the scalability of the model to fit the analysis of interest. Bulk cultures can be established for those analyses requiring significant recovery of tumor cells, while small scale co-cultures in multi-well plates can be utilized for PCR based analysis or microscopy based evaluations.

Based on this need we developed an in vitro model to address the heterogeneity of disease that is characteristic of B-lineage acute lymphoblastic leukemia (ALL). We demonstrate that ALL cells, which share many characteristics in common with their healthy counterparts, localize to distinct compartments of BMSC or OB co-culture. Three populations of tumor cells are generated that have distinct phenotypes that are valuable for investigation of therapeutic response. Specifically, we demonstrate that (ALL) cells recovered from the "phase dim" (PD) population of co-culture are consistently refractory to therapy with survival that approximates tumor cells that have not been exposed to cytotoxic agents. These ALL cells, from either established cell lines or primary patient samples, migrate beneath adherent stromal cells or osteoblast layers but can be captured following trypsinization of cultures and separation of cell types by utilization of gel type 10 cross-linked dextran (G10) particle columns¹⁵.

Here we present a setup of a 2D co-culture that can be employed to model interactions between bone marrow microenvironment stromal cells (BMSC/OB) and leukemic cells. Of particular importance is the observation that leukemic cells form three spatial subpopulations relative to the stromal cell monolayer and that the PD population represents a chemotherapy resistant tumor population due to its interaction with the BMSC or OB. Furthermore, we demonstrate how to effectively isolate the leukemic cell populations by G10 columns. Of note, we have found that isolation of these subpopulations allows for downstream analysis of the most resistant PD population to determine potential modes of resistance that are conferred to these cells due to their interaction with the bone marrow microenvironment stromal cells or osteoblasts. Techniques that we have utilized downstream of this co-culture and isolation model include flow cytometric evaluation, proteomic analysis and targeted protein expression evaluation as well as more recently developed laser ablation electrospray ionization (LAESI) and Seahorse analysis to evaluate metabolic profiles. Through use of this model in combination with the techniques above we have found that the PD population of leukemic cells has a chemotherapy resistant phenotype that is unique when compared to leukemic cells cultured in media alone or those recovered from the other subpopulations in the same co-culture. As such, this model lends itself to more rigorous evaluation to test strategies targeting the most chemotherapy resistant leukemic cells which derive their resistant phenotype through interaction with the bone marrow microenvironment.

プロトコル

1.高度な準備

1. デキストランG10粒子を調製します。
   1. 10グラムのG10粒子にPBS 1×50ミリリットルを追加することで、G10のスラリーを準備します。反転によって混合し、G10が4°CO / Nでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）から沈降することを可能にします。
   2. 定住G10粒子からG10カラム分離、吸引PBSの日と50ミリリットルの新鮮なPBSを追加します。転倒混和します。使用する準備ができるまで4℃で落ち着いG10粒子とストアに50ミリリットルの新鮮なPBSを追加して、二回繰り返します。
2. BMSCとOBを培養します。
   1. 90％の密集度に到達するまで、6％CO ₂中37℃でBMSCまたはOBの両方を維持し、10cmの組織培養プレート上で増殖させました。
   2. 新しい10cmプレート上に2：トリプシン処理BMSCまたはOB細胞とは、1を分割します。共培養白血病のために必要とされるまで細胞をこれらの標準に成長させます。

2.共培養の確立と維持

1. 5-20×10 ⁶白血病細胞iを追加nは、80％-90％コンフルエントBMSCまたはOB板上に腫瘍特異培地10mlの。
   注：私たちの研究室は、より良い1％から^7％16-18の範囲であると示されている骨髄微小環境を再現するために、5％のO ₂中で37℃で共培養を維持します。しかし、この酸素張力で共培養を維持することが3白血病の亜集団の確立のために重要ではなく、ラボの裁量です。
2. すべての4 ^日目は、（懸濁液中の白血病細胞を含む）は、メディアの1ミリリットルが、すべてを削除し、9ミリリットルの新鮮な白血病培養培地と交換してください。プレートからのメディアの9ミリリットルを取り外すときは、BMSC又はOB付着層を乱さないように注意してください。
   1. プレートの隅に側と吸引メディアにプレートを傾けることによってメディアを取り出します。新鮮な培地を追加するときにまた、BMSC又はOB付着層の最小限の中断を確実にするために、側壁に対するプレートの隅に一滴ずつ追加してください。
3. 共培養の12 ^日目の後、ディッシュアップから培養培地をピペットでBMSCまたはOB層から白血病細胞を洗浄し、ダウン静かに皿の上に約5〜10倍にした後、15ミリリットルコニカルチューブに集めます。ステップ2.1で説明したように新たな80％-90％コンフルエントのBMSC又はOBプレート上に再播種。
   注：ステップ2.3で説明したように、共培養の穏やかなすすぎは、BMSCまたはOB単層を破壊することなく、S、PBの白血病細胞を除去します。これは、腫瘍細胞は、次の同時培養プレートに移すことを可能にします。この12日のサイクルでは、ユーザーのニーズに基づいて、必要な数回繰り返すことができます。

3.準備G10ビーズカラム

注：次の手順は、無菌テクニックとG10カラムを用いて行われるべきである無菌下流の分析や培養が必要な場合は、次のG10カラム分離は、無菌の生物学的フードでセットアップする必要があります。

1. 事前WA水浴中で37°CまでRM細胞培養培地（カラムあたり約30 ml）を。 10ミリリットル使い捨て注射器を使用して、削除し、プランジャーを捨てます。シリンジにグラスウールを追加します。
2. ピンセットを使用して、薄い緩いストランドにグラスウールを引き離します。注射器の2/3をガラスウールで充填されるまで注射器に軽く充填したグラスウールの複数の層を加えます。
   注：グラスウールは、白血病細胞のコレクションを汚染から緩いG10粒子を防ぐことが重要です。グラスウールはG10粒子をサポートするのに十分な詰めが、あまりにも密に列を介してメディアの流れを遮断するためにパックされていないことを確認してください。
3. 閉鎖位置に注射器の先端に1方活栓を取り付けます。
4. リングへのクランプシリンジの列が50ミリリットルコニカルチューブ（コレクションチューブ）がコックの下に配置することができる十分な高さに立ちます。シリンジ列の下にコレクションチューブを置きます。
5. 10ミリリットルのピペットを使用すると、G10粒子がの上欄にPBSに再懸濁し、滴下、追加しますグラスウール。グラスウールの上にG10粒子の形の（注射器の目盛りによって測定される）〜2ミリリットルペレットまでG10粒子を追加し続けます。
6. 予熱したメディアとG10カラムを平衡化します。
   1. 列に予熱したメディアの2ミリリットルを追加します。ようにオープンコックバルブはゆっくりとメディアを滴下カラムから流出します。
   2. 予熱したメディアの10ミリリットルの合計までの手順を繰り返し3.6.1は、列を横切って走ってきました。
      注：G10粒子をコレクションチューブを通る流れで見られ、いずれか1）より多くのG10粒子を追加している場合は、追加G10粒子がカラムから逃げないことを確認すること〜2ミリリットルペレットを維持するか、2）未使用の1繰り返しでカラムを交換します3.4-3.6.1を繰り返します。
   3. カラムからの予熱したメディア・ドレイン後、コックを閉じて、フロースルーとコレクションチューブを捨てます。列の下に新しいコレクションチューブを追加します。列は、メディア+細胞混合物をロードする準備ができています。
      注：列すぐに使用し、乾燥させないようにする必要があります。

4.共培養内の3亜集団を分離

1. 懸濁液（S）は、腫瘍亜集団のコレクション。
   1. 吸引ピペットとの共培養プレートからメディアと静かに再適用されるのと同じメディアのプレートを洗浄し、15ミリリットルコニカルチューブに白血病細胞を含む培地を収集します。収集した白血病細胞は、S亜集団です。
2. フェーズブライト（PB）腫瘍亜集団のコレクション。
   1. 共培養プレートに戻って10ミリリットルに新鮮な培地を追加します。接着性白血病細胞が、付着BMSC / OBの成分を除去するのは難しい十分ではありませんを削除するには、上下約5倍を追加したメディアをピペットで勢いよくすすいでください。
   2. ピペットで吸引し、15ミリリットルコニカルチューブにメディアを収集します。回収した細胞は、PBの亜集団です。
3. フェーズ点心のコレクション（PD）は、腫瘍亜集団。
   1. レムに1ミリリットルPBSですすぎ、プレートオベ残りのメディア。 5分間37℃のインキュベーターに3ミリリットルのトリプシンと場所とのトリプシン処理共培養プレート。
   2. インキュベーターからプレートを外し、静かに付着BMSC / OBを取り除くために、プレートの側面をタップします。
   3. 離れて大きな細胞凝集体を壊すために1ミリリットルのウシ胎児血清（FBS）およびピペット上下に3-5回を追加します。
   4. 15ミリリットルコニカルチューブ内の細胞でメディアを収集します。これらの細胞は、同様にBMSC / OBを有する未精製のPD亜集団です。
4. 遠心分離器3は、7分間400×gで亜集団を単離しました。吸引し、1ミリリットル予め温めメディアでペレットを再懸濁し、個別に、その後、上清を捨てます。細胞はG10カラムにロードする準備ができています。

G10カラムに5読み込んで共培養細胞

注：必ずコックはG10カラムに細胞を含む培地を添加する前に完全に閉じていることを確認します。また、それぞれの亜集団はintroducしないよう個別のG10カラム上で実行する必要があります下流の分析における集団間の偏りを電子。

1. 千μlのピペットを用いて、滴下別々のG10カラムに予熱した培地中に各細胞亜集団の1ミリリットルを追加します。細胞を含む培地が上またはG10ペレット内に残ることを確認してください。細胞を室温で20分間、G10ペレットにインキュベートすることを可能にします。
   注：活栓は、インキュベーションの期間のための閉じられたまま。

6. G10カラムから白血病細胞を収集

1. 各G10カラムに1〜3ミリリットル予め温めたメディアを追加します。オープンストップコックバルブとメディアがゆっくりコラム滴下を終了することができます。
   注：これは、列または列の外に洗い流し、分離された白血病細胞を汚染する可能性がBMSC / OBを含むG10ペレットからの遅い流れの速度を維持することが重要です。
2. 15〜20ミリリットルの合計までG10カラムに少しずつ（1-2 ml）に予熱したメディアを追加していきカラムに通しており、収集されています。閉じるコックVALVEとキャップコレクションチューブ。
   注：G10粒子ペレットを回収チューブの底に見られる場合は、ゆっくり乱されていないG10粒子ペレットを残してチューブからメディアを取り出し、新しいチューブに移します。
3. 遠心分離は、室温で7分間、400×gでメディアを集めました。上清を除去し、下流側のアプリケーションのための適切な緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。
4. 細胞は、今BMSC又はOB汚染のない白血病細胞の純粋な集団であり、ユーザーの裁量で、下流のアプリケーションに適用する準備ができています。
   注：G10カラムを通して細胞を通過する際に白血病細胞の生存率は変わらないはずです。

結果

この共培養モデルの成功セットアップと文化が。付着BMSC又はOB単層に比べて白血病細胞の3亜集団の確立につながる1は、BMSCの単層に播種ALL細胞は、最初に中断のようにのみ単一集団をどのように表示されるかを示しています白血病細胞。 4日間のコースで白血病細胞は、3空間白血病細胞の亜集団（一時停止（S）、位相明るい（PB）、および位...

ディスカッション

病気の再発に寄与する微小残存病変（MRD）は、積極的な難治性ALLの治療、ならびに、他の血液悪性腫瘍のホストに主要な臨床課題であり続けています。骨髄微小環境は、ALL ^3,8における再発の最も一般的な部位です。このように、骨髄微小環境をモデル化したモデルは、化学療法の露光中にMRDの白血病腫瘍細胞の生存および維持に関連する仮説をテストするための重要なツールです。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 sephadex beads	Sigma	G10120	Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe	BD	309604
Glass wool	Pyrex	3950
1-way stopcocks	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021039	Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021037	Used for cell collection
Fetal Bovine Serum	Sigma	F6178
0.05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes	Greiner Bio-One	664160
Culture media
Osteoblast culture media	PromoCell	C-27001	For human osteoblast media
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	For tumor media prepation
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts	PromoCell	C-12720	Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations.
Human Bone Morrow Stromal Cells	WVU Biospecimen Core		De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.