Modelagem quimioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

Resumo

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Resumo

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Introdução

The overall goal of the method described is to provide an efficient, cost-effective in vitro approach that supports investigation of the mechanisms that underlie bone marrow supported survival of leukemic cells during chemotherapy exposure. It is well documented that surviving residual tumor cells that persist after treatment contribute to relapse of disease that is often more aggressive than that at diagnosis and is often less effectively treated^1-8. Models that include leukemic cells in isolation, such as those limited to culture of cells in media alone, for testing of therapeutic approaches do not factor in these critical signals, or the heterogeneity of disease that occurs in response to availability of niche derived cues in which tumor cell subpopulations with very specific interactions with niche cells derive enhanced protection. Standard 2D co-culture models that co-culture bone marrow derived stromal cells and leukemic cells have somewhat addressed the contribution of the marrow niche and have shown that interaction with bone marrow microenvironment cells increases their resistance to chemotherapy and alters their growth characteristics^9-14. These models however often fail to recapitulate long term survival of tumor cells and do not accurately inform the outcomes associated with the most resistant leukemic cell populations that contribute to MRD. In vivo models remain critical and define the "gold standard" for investigation of innovative therapies prior to clinical trials but they are often challenged by the time and cost required to test hypotheses related to resistant tumors and relapse of disease. As such, development of more informative 2D models would be of benefit for pilot investigations to better inform the design of subsequent murine based pre-clinical design.

The 2D in vitro model presented in this report lacks the complexity of the true in vivo microenvironment, but provides a cost effective and reproducible means to interrogate tumor interactions with the microenvironment that lends itself specifically to enrichment of the chemoresistant subpopulation of tumor cells. This distinction is valuable as evaluation of the entire population of tumor cells may mask the phenotype of a minor group of therapy resistant tumor cells that comprise the most important target. An additional advantage is the scalability of the model to fit the analysis of interest. Bulk cultures can be established for those analyses requiring significant recovery of tumor cells, while small scale co-cultures in multi-well plates can be utilized for PCR based analysis or microscopy based evaluations.

Based on this need we developed an in vitro model to address the heterogeneity of disease that is characteristic of B-lineage acute lymphoblastic leukemia (ALL). We demonstrate that ALL cells, which share many characteristics in common with their healthy counterparts, localize to distinct compartments of BMSC or OB co-culture. Three populations of tumor cells are generated that have distinct phenotypes that are valuable for investigation of therapeutic response. Specifically, we demonstrate that (ALL) cells recovered from the "phase dim" (PD) population of co-culture are consistently refractory to therapy with survival that approximates tumor cells that have not been exposed to cytotoxic agents. These ALL cells, from either established cell lines or primary patient samples, migrate beneath adherent stromal cells or osteoblast layers but can be captured following trypsinization of cultures and separation of cell types by utilization of gel type 10 cross-linked dextran (G10) particle columns¹⁵.

Here we present a setup of a 2D co-culture that can be employed to model interactions between bone marrow microenvironment stromal cells (BMSC/OB) and leukemic cells. Of particular importance is the observation that leukemic cells form three spatial subpopulations relative to the stromal cell monolayer and that the PD population represents a chemotherapy resistant tumor population due to its interaction with the BMSC or OB. Furthermore, we demonstrate how to effectively isolate the leukemic cell populations by G10 columns. Of note, we have found that isolation of these subpopulations allows for downstream analysis of the most resistant PD population to determine potential modes of resistance that are conferred to these cells due to their interaction with the bone marrow microenvironment stromal cells or osteoblasts. Techniques that we have utilized downstream of this co-culture and isolation model include flow cytometric evaluation, proteomic analysis and targeted protein expression evaluation as well as more recently developed laser ablation electrospray ionization (LAESI) and Seahorse analysis to evaluate metabolic profiles. Through use of this model in combination with the techniques above we have found that the PD population of leukemic cells has a chemotherapy resistant phenotype that is unique when compared to leukemic cells cultured in media alone or those recovered from the other subpopulations in the same co-culture. As such, this model lends itself to more rigorous evaluation to test strategies targeting the most chemotherapy resistant leukemic cells which derive their resistant phenotype through interaction with the bone marrow microenvironment.

Protocolo

1. Preparação avançada

1. A preparação de partículas do G10 dextrano.
   1. Prepare G10 pasta por adição de 50 ml de PBS 1X aos 10 partículas g G10. Misturar por inversão e permitir G10 para resolver fora de salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
   2. No dia da separação coluna G10, aspirado PBS a partir de partículas do G10 assentados e adicionar 50 ml de PBS fresco. Misturar por inversão. Repita duas vezes, adicionando 50 ml PBS fresco às partículas do G10 assentadas e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
2. A cultura de BMSC e OB.
   1. Manter tanto a BMSC OB ou a 37 ° C em 6% de CO ₂ e cultivadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm até 90% de confluência é atingido.
   2. Trypsinize BMSC ou células de OB e dividir 1: 2 para novos cm placas de 10. As células são cultivadas com estas normas até ser necessário para a co-cultura leucémicas.

2. Estabelecer e manter Co-cultura

1. Adicionar 5-20 x 10 ⁶ células leucémicas in 10 ml de tumor meios de cultura específicos para um 80% -90% confluentes BMSC ou placa OB.
   NOTA: O nosso laboratório mantém co-culturas a 37 ° C em 5% de O ₂ para melhor recapitular o microambiente da medula óssea, o que tem sido demonstrado que variam de 1% a 7% ^16-18. No entanto, a manutenção de co-culturas neste tensão de oxigênio não é crítica para o estabelecimento das três subpopulações leucêmicas e fica a critério do laboratório.
2. Cada ^4º dia remover todos, mas 1 ml de mídia (incluindo células leucêmicas em suspensão) e substituir com 9 ml meio de cultura leucêmica fresco. Ao remover 9 ml de mídia da placa, tome cuidado para não perturbar a camada aderente BMSC ou OB.
   1. Remova a mídia pela inclinação placa para o lado e aspirado de mídia no canto da placa. Além disso, quando a adição de meio fresco, não se esqueça de adicionar gota a gota, no canto da placa contra a parede lateral para garantir o mínimo de interrupção da camada aderente BMSC ou OB.
3. Após ^o 12º dia da co-cultura, lavar as células leucêmicas BMSC ou camada OB pipetando meios de cultura de prato cima e para baixo suavemente sobre o prato de aproximadamente 5 a 10 vezes e, em seguida, recolher no tubo de 15 ml. Propagar novamente para nova 80% -90% confluentes BMSC ou placa de OB como descrito na etapa 2.1.
   NOTA: O enxaguamento suave da co-cultura, tal como descrito na etapa 2.3 irá remover as células leucémicas S e PB, sem perturbar a monocamada de BMSC ou OB. Isto permite que apenas as células de tumor a ser transferido para a próxima placa de co-cultura. Este ciclo de 12 dias pode ser repetido tantas vezes quanto necessário, com base nas necessidades do usuário.

3. Preparar Colunas G10 Bead

NOTA: Se a análise a jusante estéril ou cultura é necessária após a separação coluna G10 os seguintes passos devem ser realizados utilizando uma técnica estéril e colunas G10 deve ser configurado em uma capa biológica estéril.

1. Pré-warm meio de cultura celular a 37 ° C em banho de água (~ 30 mL por coluna). Usando uma seringa descartável ml 10, remover e descartar o êmbolo. Adicionar a lã de vidro para seringa.
2. Com uma pinça, puxe a lã de vidro em fios soltos finas. Adicionar várias camadas de lã de vidro ligeiramente embalado para a seringa até 2/3 da seringa é preenchido com lã de vidro.
   NOTA: A lã de vidro é crucial para evitar que partículas soltas do G10 de contaminar a recolha de células leucêmicas. Certifique-se de lã de vidro é embalado o suficiente para suportar as partículas do G10, mas não muito densamente para bloquear o fluxo de mídia através da coluna.
3. Anexar uma torneira de sentido para a ponta de seringa na posição fechada.
4. Braçadeira coluna seringa para anel ficar alto o suficiente para um tubo de 50 ml (tubo de coleta) pode ser colocado debaixo torneira. Coloque tubo de coleta na coluna seringa.
5. Usando a 10 ml pipeta adicionar, gota a gota, partículas do G10 novamente suspensas em PBS para a coluna na parte superior doa lã de vidro. Continue a adição de partículas até um G10 ml sedimento ~ 2 (tal como medido por graduações na seringa) de G10 formas partículas na parte superior da lã de vidro.
6. Equilibrar a coluna G10 com mídia pré-aquecido.
   1. Adicionar 2 ml de meio de pré-aquecida até à coluna. Abra a válvula de torneira lentamente, de modo que a mídia flui para fora da coluna de gota a gota.
   2. Repetir o passo 3.6.1, até um total de 10 ml de meio pré-aquecido ter sido atravessou a coluna.
      NOTA: Se as partículas G10 são vistos no fluxo de passagem no tubo de recolha, ou 1) adicionar mais partículas G10 para manter ~ 2 ml de sedimento para garantir que não há partículas adicionais G10 escapar a partir da coluna ou 2) substituir coluna com um um não utilizada e de repetição passos 3.4-3.6.1.
   3. Depois que os drenos de mídia pré-aquecido a partir da coluna, feche a torneira e descartar tubo de coleta com fluxo através. Adicionar um novo tubo de recolha na coluna. Coluna está pronta para ser carregada com meios + mistura de células.
      NOTA: Colunasdeve ser utilizado imediatamente e não deixa-se secar.

4. Separar 3 subpopulações dentro Co-cultura

1. Coleção de subpopulação de suspensão (S) tumor.
   1. media aspirado de placa co-cultura com pipeta e suavemente voltar a aplicar os mesmos meios para lavar o prato e recolher a mídia contendo células leucêmicas em um tubo de 15 ml. As células leucémicas são recolhidos a subpopulação S.
2. Coleção de subpopulação tumor Fase Bright (PB).
   1. Adicionar 10 ml de mídia fresco de volta para placa co-cultura. Lavar vigorosamente pipetando mídia adicionados cima e para baixo cerca de 5 vezes para remover as células leucêmicas aderentes, mas não forte o suficiente para desalojar aderente BMSC / OB componente.
   2. Aspirar com pipeta e recolher meios de comunicação em um tubo de 15 ml. As células são recolhidas a subpopulação PB.
3. Coleção de subpopulação tumor Fase Dim (PD).
   1. placa de lavagem com 1 ml PBS para remmídia restante ove. Tripsinizar placa de co-cultura com 3 ml de tripsina e o local em 37 ° C incubadora durante 5 min.
   2. Retire a placa para fora da incubadora e bata suavemente os lados da placa para desalojar aderente BMSC / OB.
   3. Adicionar 1 ml de soro fetal de bovino (FBS) e pipeta cima e para baixo 3-5 vezes para quebrar grandes agregados celulares.
   4. Recolhe meios de comunicação com as células num tubo cónico de 15 ml. Estas células são o subpopulação PD não purificado com BMSC / OB bem.
4. Centrifugar 3 isolado subpopulações a 400 xg durante 7 minutos. Aspirar e elimine o sobrenadante em seguida, ressuspender individualmente pelotas em 1 ml de mídia pré-aquecido. As células estão prontas para serem carregadas numa coluna G10.

5. Carregando Co-cultura de células nas G10 Coluna

NOTA: Certifique-se de torneira está completamente fechada antes de adicionar as células de mídia contendo a coluna G10. Além disso, cada subpopulação deve ser executado através de uma coluna G10 separada de modo a não Introducum e qualquer preconceito entre as populações na análise a jusante.

1. Com uma pipeta de 1000 mL, adicione 1 ml de cada uma das subpopulações de células em meios de pré-aquecido a uma coluna G10 separada gota a gota. Certifique-se de que a mídia contendo as células permanece em cima ou dentro de pellet G10. Permitir que as células a incubar em pelete G10 durante 20 min à TA.
   NOTA: Torneira permanece fechado para a duração da incubação.

6. Coleta de células leucêmicas de G10 Coluna

1. Adicionar 1-3 media ml pré-aquecido a cada coluna G10. Abra a válvula de torneira e deixar a mídia para sair lentamente gota a gota a coluna.
   NOTA: É crucial para manter uma taxa de fluxo lento a partir da coluna ou o pellet contendo G10 BMSC / OB pode lavar para fora da coluna e contaminam as células leucémicas isoladas.
2. Continuar a adicionar meios pré-aquecido em pequenos incrementos (1-2 ml) a coluna G10 até um total de 15 a 20 ml foi executado através da coluna e foi recolhido. Fechar a torneira vatubo de recolha de lve e boné.
   NOTA: Se um pellet G10 partícula é visto na parte inferior do tubo de coleta, remover suavemente a mídia do tubo deixando G10 grânulo de partícula imperturbado e transferência para o novo tubo.
3. Centrifugar meios recolhidos a 400 xg durante 7 minutos à TA. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento de células em tampão apropriado para aplicação a jusante.
4. As células são agora uma população pura de células leucêmicas livres de BMSC ou contaminação OB e está pronto para ser aplicado a aplicações a jusante, a critério do usuário.
   NOTA: viabilidade celular de leucemia devem permanecer inalterados ao passar células através de colunas do G10.

Resultados

Configuração bem-sucedida e cultura deste modelo de co-cultura irá resultar no estabelecimento de 3 subpopulações de células leucémicas em relação ao aderente BMSC ou OB monocamada. A Figura 1 mostra como todos as células semeadas em uma monocamada BMSC inicialmente aparece como uma única população de suspenso células leucêmicas. Ao longo de 4 dias as células leucémicas interagem com a BMSC para formar 3 subpopulações de células leucémicas espaciais ...

Discussão

doença residual mínima (MRD), que contribui para a recidiva da doença continua a ser um grande desafio para o tratamento clínico de refractário agressivo ALL, bem como, uma série de outras doenças malignas hematológicas. O microambiente da medula óssea é o local mais comum de recidiva em ALL ^3,8. Como tal, os modelos que modelam o microambiente da medula óssea são ferramentas vitais para testar hipóteses relacionadas com a sobrevivência das células tumorais leucêmicas e manutenção de MRD dur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 sephadex beads	Sigma	G10120	Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe	BD	309604
Glass wool	Pyrex	3950
1-way stopcocks	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021039	Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021037	Used for cell collection
Fetal Bovine Serum	Sigma	F6178
0.05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes	Greiner Bio-One	664160
Culture media
Osteoblast culture media	PromoCell	C-27001	For human osteoblast media
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	For tumor media prepation
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts	PromoCell	C-12720	Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations.
Human Bone Morrow Stromal Cells	WVU Biospecimen Core		De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.