Modeling Chemotherapie beständig Leukämie<em&gt; In Vitro</em

Zusammenfassung

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Zusammenfassung

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Einleitung

The overall goal of the method described is to provide an efficient, cost-effective in vitro approach that supports investigation of the mechanisms that underlie bone marrow supported survival of leukemic cells during chemotherapy exposure. It is well documented that surviving residual tumor cells that persist after treatment contribute to relapse of disease that is often more aggressive than that at diagnosis and is often less effectively treated^1-8. Models that include leukemic cells in isolation, such as those limited to culture of cells in media alone, for testing of therapeutic approaches do not factor in these critical signals, or the heterogeneity of disease that occurs in response to availability of niche derived cues in which tumor cell subpopulations with very specific interactions with niche cells derive enhanced protection. Standard 2D co-culture models that co-culture bone marrow derived stromal cells and leukemic cells have somewhat addressed the contribution of the marrow niche and have shown that interaction with bone marrow microenvironment cells increases their resistance to chemotherapy and alters their growth characteristics^9-14. These models however often fail to recapitulate long term survival of tumor cells and do not accurately inform the outcomes associated with the most resistant leukemic cell populations that contribute to MRD. In vivo models remain critical and define the "gold standard" for investigation of innovative therapies prior to clinical trials but they are often challenged by the time and cost required to test hypotheses related to resistant tumors and relapse of disease. As such, development of more informative 2D models would be of benefit for pilot investigations to better inform the design of subsequent murine based pre-clinical design.

The 2D in vitro model presented in this report lacks the complexity of the true in vivo microenvironment, but provides a cost effective and reproducible means to interrogate tumor interactions with the microenvironment that lends itself specifically to enrichment of the chemoresistant subpopulation of tumor cells. This distinction is valuable as evaluation of the entire population of tumor cells may mask the phenotype of a minor group of therapy resistant tumor cells that comprise the most important target. An additional advantage is the scalability of the model to fit the analysis of interest. Bulk cultures can be established for those analyses requiring significant recovery of tumor cells, while small scale co-cultures in multi-well plates can be utilized for PCR based analysis or microscopy based evaluations.

Based on this need we developed an in vitro model to address the heterogeneity of disease that is characteristic of B-lineage acute lymphoblastic leukemia (ALL). We demonstrate that ALL cells, which share many characteristics in common with their healthy counterparts, localize to distinct compartments of BMSC or OB co-culture. Three populations of tumor cells are generated that have distinct phenotypes that are valuable for investigation of therapeutic response. Specifically, we demonstrate that (ALL) cells recovered from the "phase dim" (PD) population of co-culture are consistently refractory to therapy with survival that approximates tumor cells that have not been exposed to cytotoxic agents. These ALL cells, from either established cell lines or primary patient samples, migrate beneath adherent stromal cells or osteoblast layers but can be captured following trypsinization of cultures and separation of cell types by utilization of gel type 10 cross-linked dextran (G10) particle columns¹⁵.

Here we present a setup of a 2D co-culture that can be employed to model interactions between bone marrow microenvironment stromal cells (BMSC/OB) and leukemic cells. Of particular importance is the observation that leukemic cells form three spatial subpopulations relative to the stromal cell monolayer and that the PD population represents a chemotherapy resistant tumor population due to its interaction with the BMSC or OB. Furthermore, we demonstrate how to effectively isolate the leukemic cell populations by G10 columns. Of note, we have found that isolation of these subpopulations allows for downstream analysis of the most resistant PD population to determine potential modes of resistance that are conferred to these cells due to their interaction with the bone marrow microenvironment stromal cells or osteoblasts. Techniques that we have utilized downstream of this co-culture and isolation model include flow cytometric evaluation, proteomic analysis and targeted protein expression evaluation as well as more recently developed laser ablation electrospray ionization (LAESI) and Seahorse analysis to evaluate metabolic profiles. Through use of this model in combination with the techniques above we have found that the PD population of leukemic cells has a chemotherapy resistant phenotype that is unique when compared to leukemic cells cultured in media alone or those recovered from the other subpopulations in the same co-culture. As such, this model lends itself to more rigorous evaluation to test strategies targeting the most chemotherapy resistant leukemic cells which derive their resistant phenotype through interaction with the bone marrow microenvironment.

Protokoll

1. Advanced Vorbereitung

1. Vorbereiten Dextran G10 Partikel.
   1. Bereiten G10 Aufschlämmung durch Zugabe von 50 ml 1x PBS zu 10 g G10 Teilchen. Mischen durch Umdrehen und lassen G10 aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° CO / N zu regeln.
   2. Der Tag des G10-Säule Trennung absaugen PBS aus der ständigen G10-Partikel und 50 ml frischem PBS hinzufügen. Mischen durch Umdrehen. Zweimal wiederholen, Zugabe von 50 ml frischem PBS ständiger G10 Teilchen und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
2. Kultivieren BMSC und OB.
   1. Halten beide BMSC oder OB bei 37 ° C in 6% _{CO 2} und 10 cm-Gewebekulturplatten gezüchtet, bis 90% Konfluenz erreicht wird.
   2. Trypsinize BMSC oder OB-Zellen und spalten 1: 2 auf neue 10 cm-Platten. Die Zellen werden auf diese Normen herangezogen, bis für leukämische Co-Kultivierung benötigt wird.

2. Aufbau und Pflege einer Co-Kultur

1. In 5-20 x 10 ⁶ Leukämiezellen in 10 ml tumorspezifischen Kulturmedien auf einem 80% -90% konfluent BMSC oder OB Platte.
   HINWEIS: Unser Labor hält Co-Kulturen bei 37 ° C in 5% _{O 2,} um besser die Knochenmark-Mikroumgebung rekapitulieren, die von 1% bis 7% auf einen Bereich ^16-18 gezeigt ist. Doch bei diesem Sauerstoffspannung Kokulturen Aufrechterhaltung ist nicht kritisch für die Festlegung der drei Leukämie Subpopulationen und liegt im Ermessen des Labors.
2. Jeden ^{4. Tag} alle, aber 1 ml Medium (einschließlich leukämischen Zellen in Suspension) entfernen und mit 9 ml frisch Leukämiekulturmedien ersetzen. Beim Entfernen von 9 ml Medium von der Platte, sein nicht vorsichtig die BMSC oder OB haftende Schicht zu stören.
   1. Entfernen Sie das Medium durch Platte zur Seite und absaugen Medien in der Ecke der Platte zu kippen. Außerdem, wenn frisches Medium hinzufügen, achten Sie darauf, tropfenweise in die Ecke der Platte gegen die Seitenwand hinzuzufügen minimaler Unterbrechung des BMSC oder OB haftende Schicht zu gewährleisten.
3. Nach dem ^12. Tag der Co-Kultur, spülen Leukämiezellen von BMSC oder OB Schicht durch Pipettieren von Kulturmedien von Schale nach oben und unten leicht über der Schale etwa 5 bis 10 mal und dann in 15 ml konischen Röhrchen sammeln. Reseed auf neu 80% -90% konfluent BMSC oder OB Platte als 2,1 in Schritt beschrieben.
   HINWEIS: Die schonende Spülung der Co-Kultur wie in Schritt 2.3 wird S und PB leukämischen Zellen ohne Störung des BMSC oder OB-Monoschicht zu entfernen. Dies ermöglicht nur Tumorzellen auf die nächste Co-Kulturplatte überführt werden. Diese 12-Tage-Zyklus kann so oft wie erforderlich auf Bedürfnisse der Nutzer wiederholt werden.

3. Vorbereitung G10 Bead Columns

HINWEIS: Wenn sterile Downstream-Analyse oder die Kultivierung folgenden G10-Säule Trennung erforderlich ist, die folgenden Schritte steriler Technik zunutze machen sollten, und G10 Spalten sollte in einem sterilen biologischen Haube sein Setup durchgeführt.

1. Pre-warm Zellkulturmedien auf 37 ° C in einem Wasserbad (~ 30 ml pro Säule). Mit einem 10-ml-Einwegspritze, zu entfernen und Kolben verwerfen. In Glaswolle Spritze.
2. Mit einer Pinzette auseinanderziehen Glaswolle in dünne lose Stränge. In mehreren Schichten aus leicht verpackt Glaswolle an der Spritze, bis 2/3 der Spritze mit Glaswolle gefüllt ist.
   HINWEIS: Die Glaswolle ist entscheidend Verunreinigungen der Leukämiezell Sammlung lose G10 Partikel zu verhindern. Stellen Sie sicher, Glaswolle gepackt genug, um die G-10-Partikel zu unterstützen, aber nicht zu dicht gepackten Medienstrom durch die Säule zu blockieren.
3. Bringen 1-Wege-Hahn auf die Spitze der Spritze in die geschlossene Position.
4. Clamp Spritze Spalte Ring stehen hoch genug, so eine 50 ml konischen Röhrchen (Sammelrohr) kann unter Absperrhahn platziert werden. Zeigen Sammelröhrchen unter Spritze Spalte.
5. Mit einem 10 ml-Pipette hinzufügen, tropfenweise, Partikel G10 in PBS auf die Säule oben aufdie Glaswolle. Fügen Sie weitere G10 Partikel bis zu einem ~ 2 ml Pellet aus G10-Teilchen bildet sich auf der Oberseite des Glaswolle (wie von Abstufungen auf die Spritze gemessen).
6. Gleichgewicht kommen die G-10-Säule, die mit vorgewärmten Medien.
   1. 2 ml vorgewärmten Medien Spalte. Offene Absperrventil langsam, so dass Medien fließt aus der Spalte tropft.
   2. Wiederholen Sie Schritt 3.6.1 bis insgesamt 10 ml vorgewärmtes Medium wurden über die Säule lief.
      HINWEIS: Wenn G10 Partikel in der Strömung durch die Sammelrohr gesehen werden, entweder 1) mehr G10-Partikel in den halten ~ 2 ml Pellet dafür, dass keine zusätzlichen G10 Partikel aus der Kolonne entweichen oder 2) ersetzen Säule mit einem unbenutzten ein und wiederholen Schritte 3.4-3.6.1.
   3. Nach den vorgewärmten Medien Abflüsse aus der Säule, den Wasserhahn schließen und Sammelrohr mit Fluss durch verwerfen. Hinzufügen neuer Sammelröhrchen unter Spalte. Spalte ist bereit, mit Medien + Zellgemisch geladen werden.
      HINWEIS: Spaltensofort und nicht erlaubt sollten zum Trocknen verwendet werden.

4. Die Trennung 3 Subpopulationen in Co-Kultur

1. Sammlung von Suspension (S) Tumor Subpopulation.
   1. Absaugen Medien von Co-Kulturplatte mit Pipette und sanft wieder gelten die gleichen Medien, um die Platte zu spülen und Medien, die Leukämiezellen in einem 15 ml konischen Röhrchen sammeln. Die Leukämiezellen gesammelt sind die S-Subpopulation.
2. Sammlung von Phase Bright (PB) Tumor Subpopulation.
   1. 10 ml frisches Medium wieder auf Co-Kulturplatte. Spülen Sie kräftig durch hinzugefügte Medien Auf- und Abpipettieren etwa 5 mal haftLeukämieZellen zu entfernen, aber nicht hart genug haft BMSC / OB Komponente zu entfernen.
   2. Saugen Sie mit Pipette und sammeln Medien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Die gesammelten Zellen sind die PB Subpopulation.
3. Sammlung von Phase-Dim (PD) Tumor Subpopulation.
   1. Rinse-Platte mit 1 ml PBS zu remove Stoffreste. Trypsinize Co-Kulturplatte mit 3 ml Trypsin und Ort in 37 ° C Inkubator für 5 min.
   2. Entfernen Platte von Inkubator und sanft tippen Seiten der Platte haft BMSC / OB zu entfernen.
   3. 1 ml fötales Rinderserum (FBS) und Pipette auf und ab 3-5 mal abgesehen große Zellaggregate zu brechen.
   4. Sammeln Medien mit Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Diese Zellen sind das ungereinigte PD Subpopulation mit BMSC / OB als auch.
4. Zentrifuge 3 Subpopulationen bei 400 g für 7 min isoliert. Saugen und Überstand verwerfen dann individuell resuspendieren Pellets in 1 ml vorgewärmten Medien. Zellen sind bereit, auf einer G10-Säule geladen werden.

5. Laden Co-Kulturzellen auf G10-Säule

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Hahn wird vor der Zugabe von Medien, die Zellen zu G10-Säule vollständig geschlossen. Außerdem muss jede Unterpopulation über einen separaten G10-Säule lief, so nicht zu introducE keine Vorspannung zwischen Populationen in Downstream-Analyse.

1. Mit einem 1000 ul Pipette, 1 ml von jeder Zell-Subpopulation in vorgewärmten Medien zu einem separaten G10-Säule tropft. Stellen Sie sicher, dass die Medien die Zellen bleibt an der Spitze oder innerhalb G10 Pellet enthält. Erlauben Zellen für 20 min bei RT auf G10 Pellet inkubiert.
   HINWEIS: Absperrhahn geschlossen bleibt für die Dauer der Inkubation.

6. Sammeln Leukämiezellen von G10-Säule

1. In 1-3 ml vorgewärmt Medien zu den G-10-Säule. Offene Absperrventil und erlauben Medien die Spalte tropfenweise langsam zu beenden.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine langsame Fließgeschwindigkeit aus der Säule oder der G10-Pellet, das BMSC / OB zu pflegen können aus der Säule zu waschen und die isolierten Leukämiezellen kontaminieren.
2. Weiter hinzuzufügen vorgewärmten Medien in kleinen Schritten (1-2 ml) auf G10-Säule, bis insgesamt 15 bis 20 ml hat durch die Säule laufen und gesammelt wurde. Absperrhahn schließen vaSammelröhrchen lve und Kappe.
   HINWEIS: Wenn ein G10 Partikel-Pellet am Boden des Sammelrohrs gesehen wird, sanft entfernen Medien aus dem Rohr verlassen G10 Partikel-Pellet ungestört und Übertragung auf neue Röhre.
3. Zentrifuge gesammelt Medien bei 400 × g für 7 min bei RT. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in Puffer geeignet für Folgeanwendungen.
4. Die Zellen sind nun eine reine Population von Leukämiezellen frei von BMSC oder OB Kontamination und sind bereit, bei der Benutzer Ermessen zu Downstream-Anwendungen angewendet werden.
   HINWEIS: Leukämiezelllebensfähigkeit sollten unverändert bleiben, wenn die Zellen durch G10 Säulen vorbei.

Ergebnisse

Erfolgreichen Aufbau und die Kultur dieser Co-Kultur-Modell wird bei der Errichtung von drei Subpopulationen von Leukämiezellen gegenüber dem haft BMSC oder OB-Monoschicht führen. Abbildung 1 zeigt, wie alle in einem BMSC Monoschicht ausgesät Zellen zunächst als nur eine einzige Population von suspendierten erscheinen Leukämiezellen. Im Laufe von 4 Tagen mit dem BMSC Leukämiezellen interagieren 3 Raum Subpopulationen von Leukämiezellen zu bilden (gesperrt (S), Ph...

Diskussion

Minimaler Resterkrankung (MRD), das mit Rückfall der Krankheit beiträgt wie vor eine große klinische Herausforderung bei der Behandlung von aggressiven refraktärer ALL, sowie eine Vielzahl von anderen hämatologischen Malignitäten zu sein. Das Knochenmark-Mikroumgebung ist die häufigste Lokalisation eines Rückfalls in ALLEN ^3,8. Als solche Modelle, die das Knochenmark-Mikroumgebung sind wichtige Werkzeuge zu testen Hypothesen während der Chemotherapie Exposition gegenüber leukämischen Überleben von...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 sephadex beads	Sigma	G10120	Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe	BD	309604
Glass wool	Pyrex	3950
1-way stopcocks	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021039	Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021037	Used for cell collection
Fetal Bovine Serum	Sigma	F6178
0.05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes	Greiner Bio-One	664160
Culture media
Osteoblast culture media	PromoCell	C-27001	For human osteoblast media
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	For tumor media prepation
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts	PromoCell	C-12720	Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations.
Human Bone Morrow Stromal Cells	WVU Biospecimen Core		De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.