Modellazione chemioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

Riepilogo

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Abstract

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Introduzione

The overall goal of the method described is to provide an efficient, cost-effective in vitro approach that supports investigation of the mechanisms that underlie bone marrow supported survival of leukemic cells during chemotherapy exposure. It is well documented that surviving residual tumor cells that persist after treatment contribute to relapse of disease that is often more aggressive than that at diagnosis and is often less effectively treated^1-8. Models that include leukemic cells in isolation, such as those limited to culture of cells in media alone, for testing of therapeutic approaches do not factor in these critical signals, or the heterogeneity of disease that occurs in response to availability of niche derived cues in which tumor cell subpopulations with very specific interactions with niche cells derive enhanced protection. Standard 2D co-culture models that co-culture bone marrow derived stromal cells and leukemic cells have somewhat addressed the contribution of the marrow niche and have shown that interaction with bone marrow microenvironment cells increases their resistance to chemotherapy and alters their growth characteristics^9-14. These models however often fail to recapitulate long term survival of tumor cells and do not accurately inform the outcomes associated with the most resistant leukemic cell populations that contribute to MRD. In vivo models remain critical and define the "gold standard" for investigation of innovative therapies prior to clinical trials but they are often challenged by the time and cost required to test hypotheses related to resistant tumors and relapse of disease. As such, development of more informative 2D models would be of benefit for pilot investigations to better inform the design of subsequent murine based pre-clinical design.

The 2D in vitro model presented in this report lacks the complexity of the true in vivo microenvironment, but provides a cost effective and reproducible means to interrogate tumor interactions with the microenvironment that lends itself specifically to enrichment of the chemoresistant subpopulation of tumor cells. This distinction is valuable as evaluation of the entire population of tumor cells may mask the phenotype of a minor group of therapy resistant tumor cells that comprise the most important target. An additional advantage is the scalability of the model to fit the analysis of interest. Bulk cultures can be established for those analyses requiring significant recovery of tumor cells, while small scale co-cultures in multi-well plates can be utilized for PCR based analysis or microscopy based evaluations.

Based on this need we developed an in vitro model to address the heterogeneity of disease that is characteristic of B-lineage acute lymphoblastic leukemia (ALL). We demonstrate that ALL cells, which share many characteristics in common with their healthy counterparts, localize to distinct compartments of BMSC or OB co-culture. Three populations of tumor cells are generated that have distinct phenotypes that are valuable for investigation of therapeutic response. Specifically, we demonstrate that (ALL) cells recovered from the "phase dim" (PD) population of co-culture are consistently refractory to therapy with survival that approximates tumor cells that have not been exposed to cytotoxic agents. These ALL cells, from either established cell lines or primary patient samples, migrate beneath adherent stromal cells or osteoblast layers but can be captured following trypsinization of cultures and separation of cell types by utilization of gel type 10 cross-linked dextran (G10) particle columns¹⁵.

Here we present a setup of a 2D co-culture that can be employed to model interactions between bone marrow microenvironment stromal cells (BMSC/OB) and leukemic cells. Of particular importance is the observation that leukemic cells form three spatial subpopulations relative to the stromal cell monolayer and that the PD population represents a chemotherapy resistant tumor population due to its interaction with the BMSC or OB. Furthermore, we demonstrate how to effectively isolate the leukemic cell populations by G10 columns. Of note, we have found that isolation of these subpopulations allows for downstream analysis of the most resistant PD population to determine potential modes of resistance that are conferred to these cells due to their interaction with the bone marrow microenvironment stromal cells or osteoblasts. Techniques that we have utilized downstream of this co-culture and isolation model include flow cytometric evaluation, proteomic analysis and targeted protein expression evaluation as well as more recently developed laser ablation electrospray ionization (LAESI) and Seahorse analysis to evaluate metabolic profiles. Through use of this model in combination with the techniques above we have found that the PD population of leukemic cells has a chemotherapy resistant phenotype that is unique when compared to leukemic cells cultured in media alone or those recovered from the other subpopulations in the same co-culture. As such, this model lends itself to more rigorous evaluation to test strategies targeting the most chemotherapy resistant leukemic cells which derive their resistant phenotype through interaction with the bone marrow microenvironment.

Protocollo

1. Preparazione avanzata

1. Preparazione particelle G10 destrano.
   1. Preparare G10 impasto con l'aggiunta di 50 ml di PBS 1X a 10 particelle g G10. Mescolare per inversione e consentire G10 a stabilirsi fuori tampone fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
   2. Il giorno del G10 di separazione colonna, aspirare PBS dalle particelle del G10 stanziali e aggiungere 50 ml di PBS fresco. Mescolare per inversione. Ripetere due volte, aggiungendo 50 ml PBS fresco di particelle G10 stabiliti e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
2. Coltura BMSC e OB.
   1. Mantenere sia BMSC o OB a 37 ° C in 6% CO _{2 e} coltivati ​​su 10 cm piastre di coltura tissutale fino al raggiungimento del 90% di confluenza.
   2. Trypsinize BMSC o cellule OB e dividere 1: 2 su nuove piastre di 10 cm. Le cellule sono coltivate a tali norme fino al momento leucemica co-coltura.

2. Stabilire e mantenere Co-cultura

1. Aggiungere 5-20 x 10 ^{6 cellule} leucemiche in 10 ml di specifici terreni di coltura del tumore Onto un 80% -90% confluenti BMSC o la piastra OB.
   NOTA: Il nostro laboratorio mantiene co-colture a 37 ° C in 5% O ₂ ricapitolare meglio microambiente midollare che ha dimostrato variare da 1% al 7% ^16-18. Tuttavia, il mantenimento co-colture in questa tensione di ossigeno non è critico per l'istituzione dei tre sottopopolazioni leucemiche ed è a discrezione del laboratorio.
2. Ogni 4 ^{° giorno} rimuovere tutti ma 1 ml di media (tra cui le cellule leucemiche in sospensione) e sostituirlo con 9 ml di terreni di coltura leucemica fresco. Durante la rimozione 9 ml di media dal piatto, fare attenzione a non disturbare il lardo aderente BMSC o OB.
   1. Rimuovere supporti inclinando piastra al supporto laterale e aspirato in un angolo della piastra. Inoltre, quando si aggiunge mezzi freschi, assicurarsi di aggiungere goccia a goccia in un angolo del piatto contro la parete laterale per garantire il minimo disturbo dello strato aderente BMSC o OB.
3. Dopo il 12 ^{° giorno di} co-coltura, lavare le cellule leucemiche da BMSC o strato OB pipettando terreni di coltura dal piatto su e giù delicatamente sopra il piatto di circa 5 a 10 volte e poi raccogliere in tubo da 15 ml. Reseed sul nuovo 80% -90% BMSC confluenti o piastra OB come descritto al punto 2.1.
   NOTA: Il dolce risciacquo della co-coltura come descritto al punto 2.3 verrà rimosso S e PB cellule leucemiche senza interrompere il monostrato BMSC o OB. Questo permette alle cellule tumorali solo per essere trasferite nel successivo piastra di co-coltura. Questo ciclo di 12 giorni può essere ripetuto tante volte quante sono necessarie in base alle esigenze degli utenti.

3. Preparazione Colonne G10 Bead

NOTA: Se è richiesta l'analisi a valle sterile o coltura dopo la separazione colonna G10 le seguenti operazioni devono essere eseguite con tecnica sterile e le colonne del G10 dovrebbe essere messa a punto in una cappa biologica sterile.

1. Pre-warm coltura cellulare supporti a 37 ° C in bagno d'acqua (~ 30 ml per colonna). Usando una siringa monouso ml 10, rimuovere ed eliminare stantuffo. Aggiungere lana di vetro a siringa.
2. Usando le pinzette, separare lana di vetro in trefoli sottili. Aggiungere più strati di lana di vetro leggermente imballato alla siringa fino a quando 2/3 della siringa è pieno di lana di vetro.
   NOTA: La lana di vetro è di fondamentale importanza per evitare che particelle G10 libere di contaminare la raccolta delle cellule leucemiche. Assicurarsi lana di vetro è imballato abbastanza per sostenere le particelle G10, ma non troppo densamente imballato per bloccare il flusso multimediale attraverso la colonna.
3. Attaccare 1-way rubinetto alla punta della siringa nella posizione chiusa.
4. Morsetto colonna siringa per anello di stare abbastanza alto in modo da un tubo conico da 50 ml (tubo di raccolta) può essere posizionato sotto il rubinetto. Mettere tubo di raccolta nella colonna siringa.
5. Usando una pipetta 10 ml aggiungere, goccia a goccia, le particelle G10 risospesi in PBS alla colonna in cimala lana di vetro. Continuare aggiungendo particelle G10 fino a ml pellet ~ 2 (come misurato dal graduazioni sulla siringa) di G10 particelle forme sopra della lana di vetro.
6. Equilibrare la colonna G10 con i media pre-riscaldato.
   1. Aggiungere 2 ml di media pre-riscaldato a colonna. Aprire la valvola rubinetto lentamente in modo che il supporto fuoriesce colonna goccia a goccia.
   2. Ripetere il punto 3.6.1 fino ad un totale di 10 ml di media pre-riscaldato è stato eseguito attraverso la colonna.
      NOTA: Se le particelle G10 si vedono nel flusso attraverso il tubo di raccolta, o 1) aggiungere più particelle del G10 di mantenere ~ 2 ml pellet assicurandosi che nessuna particella aggiuntivi G10 fuga dalla colonna o 2) sostituzione della colonna con uno inutilizzato e ripetere passi 3.4-3.6.1.
   3. Dopo gli scarichi dei media pre-riscaldato dalla colonna, chiudere il rubinetto e scartare tubo di raccolta con flusso attraverso. Aggiungere un nuovo tubo di raccolta sotto la colonna. Colonna è pronto per essere caricato con supporti + miscela di cellule.
      NOTA: Colonnedeve essere usato immediatamente e non ha permesso di asciugare.

4. Separare 3 sottopopolazioni all'interno di Co-cultura

1. Raccolta di sottopopolazione di sospensione (S) del tumore.
   1. supporti Aspirare dalla piastra di co-coltura con pipetta e delicatamente riapplicare lo stesso supporto per sciacquare la piastra e raccogliere supporti contenenti cellule leucemiche in un tubo da 15 ml. Le cellule leucemiche raccolti sono la sottopopolazione S.
2. Raccolta di Fase Bright (PB) sottopopolazione tumorale.
   1. Aggiungere 10 ml di mezzi freschi di nuovo sul piatto co-coltura. Risciacquare vigorosamente pipettando mezzi aggiunti su e giù per circa 5 volte per rimuovere le cellule leucemiche aderenti ma non abbastanza difficile da staccare aderente / OB componente BMSC.
   2. Aspirare con pipetta e raccogliere i media in un tubo da 15 ml. Le cellule raccolte sono la sottopopolazione PB.
3. Raccolta di Fase Dim (PD) sottopopolazione tumorale.
   1. Piastra Risciacquare con 1 ml di PBS a remsupporti rimanenti ove. Trypsinize piastra di co-coltura con 3 ml di tripsina e posto in 37 ° C incubatore per 5 min.
   2. Rimuovere la piastra di incubatore e picchiettare delicatamente lati della piastra per rimuovere aderente BMSC / OB.
   3. Aggiungere 1 ml di siero fetale bovino (FBS) e pipetta su e giù 3-5 volte di spezzare grandi aggregati di cellule.
   4. Raccogliere media con cellule in una provetta da 15 ml. Queste cellule sono sottopopolazione PD non purificata con BMSC / OB pure.
4. Centrifuga 3 isolato sottopopolazioni a 400 xg per 7 minuti. Aspirare e scartare il surnatante quindi risospendere individualmente pellet in 1 ml di media pre-riscaldato. Le cellule sono pronte per essere caricata su una colonna G10.

5. Caricamento co-coltura cellule su G10 Colonna

NOTA: Assicurarsi che il rubinetto sia completamente chiuso prima di aggiungere le cellule supporti contenenti la colonna G10. Inoltre, ogni sottopopolazione deve essere eseguito su una colonna G10 separato in modo da non introducuna e ogni pregiudizio tra le popolazioni in analisi a valle.

1. Usando una pipetta 1000 ml, aggiungere 1 ml di ciascuna sottopopolazione di cellule nei media pre-riscaldato a una colonna G10 separata goccia a goccia. Assicurarsi che il supporto contenente le cellule rimane sopra o all'interno G10 pellet. Consentono alle cellule di incubare il G10 a pellet per 20 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Stopcock rimane chiuso per durata dell'incubazione.

6. Raccolta cellule leucemiche da G10 Colonna

1. Aggiungere 1-3 ml supporti pre-riscaldato a ogni colonna G10. Valvola rubinetto aperto e consentire mezzi per uscire lentamente la colonna goccia a goccia.
   NOTA: E 'fondamentale per mantenere una portata lenta dalla colonna o il pellet contenente G10 BMSC / OB può lavare fuori della colonna e contaminare le isolate cellule leucemiche.
2. Continuare ad aggiungere supporti pre-riscaldato con piccoli incrementi (1-2 ml) a colonna G10 fino a un totale di 15 a 20 ml ha attraversato colonna e sono state raccolte. Chiudere il rubinetto vatubo di raccolta lve e cappuccio.
   NOTA: se una pallina G10 particella è visto nella parte inferiore della provetta di raccolta, rimuovere delicatamente il supporto dal tubo lasciando G10 grano di particella indisturbati e trasferimento al nuovo tubo.
3. Centrifuga raccolte supporto a 400 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in tampone appropriato per l'applicazione a valle.
4. Le cellule sono ora una popolazione pura di cellule leucemiche gratuitamente BMSC o contaminazione OB e sono pronti per essere applicato ad applicazioni a valle a discrezione dell'utente.
   NOTA: vitalità cellulare leucemica dovrebbe rimanere invariato quando si passa celle attraverso le colonne del G10.

Risultati

L'installazione di successo e la cultura di questo modello di co-coltura comporterà la creazione di 3 sottopopolazioni di cellule leucemiche relativi alla aderenti BMSC o OB monostrato. Figura 1 mostra come tutte le cellule seminate in un monostrato BMSC appaiono inizialmente come una sola popolazione di sospensione cellule leucemiche. Nel corso di 4 giorni cellule leucemiche interagiscono con il BMSC per formare 3 sottopopolazioni spaziali di cellule leucemiche (so...

Discussione

malattia residua minima (MRD) che contribuisce alla ricaduta della malattia continua ad essere una sfida clinica nel trattamento aggressivo refrattario ALL, nonché una serie di altre neoplasie ematologiche. Il microambiente del midollo osseo è il sito più comune di recidiva in ALL ^3,8. In quanto tale, i modelli che modellano il microambiente del midollo osseo sono strumenti essenziali per testare ipotesi legate alla sopravvivenza delle cellule tumorali leucemiche e manutenzione di MRD durante l'esposiz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 sephadex beads	Sigma	G10120	Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe	BD	309604
Glass wool	Pyrex	3950
1-way stopcocks	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021039	Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes	World Wide Medical Products	41021037	Used for cell collection
Fetal Bovine Serum	Sigma	F6178
0.05% Trypsin	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes	Greiner Bio-One	664160
Culture media
Osteoblast culture media	PromoCell	C-27001	For human osteoblast media
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	For tumor media prepation
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts	PromoCell	C-12720	Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations.
Human Bone Morrow Stromal Cells	WVU Biospecimen Core		De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.