יצירת הידבקויות בטן עכברים

Summary

Abdominal adhesions that form after surgery are a major cause of pain, infertility, and hospitalization and reoperation for small bowel obstruction. Our surgical procedure for creating abdominal adhesions in mice is a reliable tool to study the mechanisms underlying the formation of adhesions.

Abstract

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or intraabdominal infection. The precise mechanisms underlying adhesion formation are poorly understood. Many compounds and physical barriers have been tested for their ability to prevent adhesions after surgery with varying levels of success. The mouse and rat are important models for the study of abdominal adhesions. Several different techniques for the creation of adhesions in the mouse and rat exist in the literature. Here we describe a protocol utilizing abrasion of the cecum with sandpaper and sutures placed in the right abdominal sidewall. The mouse is anesthetized and the abdomen is prepped. A midline laparotomy is created and the cecum is identified. Sandpaper is used to gently abrade the surface of the cecum. Next, several figure-of-eight sutures are placed into the peritoneum of the right abdominal sidewall. The abdominal cavity is irrigated, a small amount of starch is applied, and the incision is closed. We have found that this technique produces the most consistent adhesions with the lowest mortality rate.

Introduction

הידבקויות בטן הן סוג של רקמה צלקתית היוצרות בבטן בתגובה לדלקת, בדרך כלל לאחר ניתוח או זיהום intraabdominal. הידבקויות הם גורם עיקרי של כאבי בטן כרוניים פוריות, והם הגורם השכיח ביותר של חסימה קטן מעי ^1. הנוכחות של הידבקויות ומאפשרת לבצע פעולת בטן שנייה קשה יותר ומגדילה את הסיכון לסיבוכים ^2.

למרות שנים של מחקר, המנגנונים להיווצרות הידבקויות להישאר ממעטים להבין. זה ידוע כי פגיעה ראשונית אל פני שטח הצפק גורמת דיות של נוזל הפיברין-עשיר, אשר לאחר מכן יוצר קריש שקושר את פני השטח של מעי ואת דופן הבטן יחד ^3. מאוחר יותר, פיברובלסטים ותאים אחרים נודדים לחלל דבק ומפרישי רקמת חיבור ^4. במהלך חודשים ארוכים ואף שנתי ההידבקות מתבגרת על ידי פיתוח כלי דם ועצבים ^5.

מוצרים מסחריים קיימים מספר אשר נועדו להפחית את היווצרות הידבקויות לאחר ניתוח בטן (למשל, Seprafilm). כל המוצרים הללו לשמש מחסומים מכניים לעצור היווצרות הידבקות על ידי מניעת מגע פיזי בין לולאות של המעי ואת ^6,7 דופן הבטן. למרות ראיות מניסוי מבוקר מחסום הידבקות כירורגית מפחית את היווצרות של הידבקויות ^8, רבים המנתחים כאנקדוטה התאכזבו עם האפקטיביות של מוצרי מחסום מכני.

כיום אין טיפולים אנטי הידבקות מבוססת תרופה, אשר משקף את העובדה כי התהליכים המדויקים המעורבים ביצירת הדבקה הם הבינו היטב. פיתוח טיפול שמתמקד במיוחד סוכנים הסלולר או המולקולריים המעורבים ביצירת הידבקויות ידרוש הבנה טובה יותר של האירועים שבהם מעורבים היווצרות של הידבקות. בקבוצה קיים מספרהים זיהה מסלולים מולקולריים כי עשוי להיות חשוב עבור היווצרות הידבקות ^9-11. במודלים של בעלי חיים לספק סביבה מעולה עבור חקר היווצרות הידבקויות. מחקרים רבים פורסמו המתאר ויצירה כירורגית של הידבקות בכמה חיות, בפרט חולדה ועכבר ^6,12-14. בהינתן הניסיון שלנו עם לומד פיברוזיס העכבר ואת הזמינות הרחבה של עכברים טרנסגניים ונוגדנים מבוססי עכבר, בחרנו את העכבר כמודל שלנו לחקר הידבקויות. בזאת, אנו מדווחים על טכניקה שפיתחנו כדי reproducibly ומהימנה ליצור הידבקויות בטן בתוך העכבר.

Protocol

הפרוטוקול הבא אושר על ידי הטיפול בבעלי החיים מוסדי אונ' סטנפורד ועדת שימוש (IACUC) ואת עומד בכל ההנחיות האתיות המוסדיות לגבי השימוש בבעלי חיים למחקר.

1. יצירת הידבקויות בטן

1. הפעל את העכבר על דיאטה צ'או אנטיביוטי שבוע לפני ההליך.
2. חיטוי מכשירי ניתוח טרום חם פתרון ההשקיה המלוחה.
3. להרדים את העכבר באמצעות 2% isoflurane בשאיפה.
4. באמצעות גוזז שיער ואחריו יישום מהיר (5 - 10 שניות) של סוכן מקריח, להסיר את השיער מן הרוב של פני השטח של הבטן. ביסודיות להסיר את סוכן המקריח ידי מנגב בעדינות עם גזה רטובה, לחלופין, על ידי הטבילה בעיון את החצי התחתון של העכבר לתוך מים חמים. ביסודיות לייבש את החיה.
5. מניחים את האף של בעל החיים לתוך חרטומו הרדמה. במהלך הניתוח כולו, בזהירות לפקח על rשיעור espiratory של החיה לכייל את קצב זרימת ההרדמה כנדרש.
6. השתמש במכשיר התחממות, כגון כרית חימום או מנורת חימום, כדי למנוע היפותרמיה.
7. לפני prepping הבטן, לאבטח את העכבר עם רצועות של סרט להציב מעל ומתחת הבטן כדי למנוע את העכבר מן הסטה במהלך הניתוח. לחטא את הבטן עם בבטאדין, ולאחר מכן פעל עם 70% אתנול. כלול כמו הרבה שטח ככל האפשר הכנה, כולל השיער על הקצוות של האזור המגולח. מניחים וילון סטרילי על העכבר. (איור 1)
8. תת עורי להזריק 0.1 מ"ג / ק"ג עצירות, או 3 מיקרוגרם עבור עכבר 30 גרם.
9. הפוך את החתך בעור.
   1. החל קו אמצע הבטן התחתון, לתפוס את העור עם מלקחיים ולעשות חתך אנכי רדוד בעור באמצעות מספריים חדים.
   2. Carry הקיצוץ superiorly אל xyphoid עם המספריים. תשמור על עצמך כדי להזין רק את העור.
10. ככל השרירים בבטן הוא now גלוי מכסה את הקרביים, לתפוס את קו האמצע של השרירים עם מלקחיים ובזהירות מאוד לעשות חתך קטן לתוכו באמצעות מספריים חדים. ודא שלא לחתוך בטעות לתוך איבר בטן.
11. לאחר הזנת שטח הצפק עם חתך קטן רואה את השכבה השרירית להתרחק אברי בטן, להאריך את החתך superiorly ו inferiorly על ידי החדרה המספרית לתוך הפתח והחיתוך בזהירות בשני הכיוונים. הרחב את החתך מן xyphoid superiorly אל מעל השלפוחית ​​inferiorly. (איור 2)
12. עכשיו כי קרבים נחשפים, לאתר את cecum בעדינות exteriorize זה. הימנע לתפוס את cecum עם מלקחי שיניים או חדים. במקום להשתמש במלקחיים atraumatic כגון מלקחיים משוננים Adson.
13. לגרד את cecum עם נייר זכוכית.
    1. בעדינות לגרד את פני השטח של שני הצדדים של cecum עם 100 נייר זכוכית חצץ עבור 30 - 60 שניות עד פני השטח הופך פחות appea מבריק petechiaer על פני השטח. אם המנתח הוא ימני, זה עוזר לכוון את cecum עם הקצה מול ימינה לעטוף את cecum על אצבע המורה השמאלית של המנתח. (איור 3)
    2. בצע את המלטש בעדינות, כפי שהוא קל לגרום ניקוב בטעות של קיר cecal הדק. כמות קטנה של חוליות אמורה להרגיש כמו הנייר הזכוכית מועברת על פני שטח cecal. אם נייר זכוכית מורגשת לתפוס שוב ושוב על cecum, זה צפוי להביא דמעה בקיר cecal. צפה בקפידה על מנת להבטיח כי חלקיקים של נייר זכוכית לא לעקור ולהישאר בבטן, מכיוון שהדבר עלול לגרום לתגובה גוף זר מוגזמת.
    3. אם דמעה בקיר cecal מתרחשת, לסיים את ההליך להרדימו.
    4. אם כלי דם cecal הוא טעון על ידי נייר הזכוכית וגורמים לדימום, להחזיק לחץ עד שתי דקות עם גזה. עם זאת, אם הדימום נמשך אחרי הפעם, במקום תפר הספרה שמונה 7-0 monofilament סביבנקודת הדימום. זה יעצור את הדימום באופן מהימן כמעט בכל המקרים. יש להיזהר שלא לשלב כמות גדולה של קיר cecal לתוך התפר, כמו זה סיכוני גרימת נימק של חלק המעורב של הקיר.
14. לפצוע את דפנות בטן התקינות.
    1. השתמש ברב של נייר זכוכית כדי לגרד את פני השטח הצפק של השריר של דפנות בטן התקינות. להיות יותר אגרסיביים עם מלטש כאן מאשר על cecum ולהמשיך עד פני השטח של דפנות תקין בטן מופיע מחוסל. הימנע מלטש כל כך קשה כי העור גלוי דרך פתחים בשכבת השרירים. (איור 4)
    2. שימוש נהג מחט קסטרו-Viejo, למקם בין שתיים לארבע הספרה שמונה 4-0 תפרים משי לתוך שכבת השרירים של דפנות בטן תקין. השאר את הזנבות באורך 5 מ"מ. יש להיזהר שלא לתפוס מעי קיר בטעות לתוך התפר. (איור 5)
15. באמצעות מזרק 10 מ"ל מלא wה- i חמם מלוח, להשקות את המעיים כמה פעמים. כוון את הזרם של מי מלח לתוך חלל הבטן כדי להשקות את פן גם כן. אם השטח מתחת העכבר הופך ספוג, להזיז את העכבר מעל או להחליף את השטח, כדי למנוע היפותרמיה.
16. השתמש גזה סטרילי להציב על החתך כדי לספוג השקיה עודפת.
17. קח קמצוץ של עמילן ומפזר אותו על פני השטח של הדפנות התקינים בטן על שני הצדדים של cecum. (איור 6)
18. ודא כי אין דימום פעיל. אם יש, להשתמש בספוג גזה להפעיל לחץ ישיר על נקודת הדימום עד שייעצר. אם הדימום לא נעצר בקלות, למקם תפר עוצר דמום כמתואר לעיל.
19. שימוש בקצה הקהה של מלקחי אצבע, בעדינות לדחוף את המעיים בחזרה לתוך חלל הבטן. מקם את cecum ליד התפרים בתוך דפנות הבטן הנכונות על מנת למקסם את היווצרות הידבקות.
20. Cלאבד את החתך בבטן.
    1. באמצעות 6-0 תפר קלוע נספג, במקום תפר רץ לתוך השכבה השרירית בראש החתך.
    2. הפעל את התפר למטה לכיוון חלק התחתון של החתך, וקירוב השכבה השרירית. מסעות בכ -3 מ"מימ ולקחת 3 ביסים מ"מ עם כל תפר חדש. תשמור על עצמך לא לקחת בטעות ביס של מעי תוך שימת תפרים.
    3. בתחתית החתך, לעזוב לולאה של תפר מהנשיכה הקודמת ולהשתמש זה מכשיר לקשור התפר. חותך את התפר עוזב 5 מ"מ זנבות.
    4. חזור על שלושת השלבים לעיל עם תפר 6-0 ניילון monofilament כדי לסגור את העור.
21. לנהל 20 מ"ל / בולוס מלוחים תת עורית ק"ג (בערך 0.5 מ"ל עבור עכבר 30 גרם).
22. באמצעות גזה יבשה, לייבש את החיה כולה ביסודיות, כמו הפרווה הגבה נוטה להירטב במהלך השקיה.
23. רופף לעטוף דבק ההלבשה סביב הבטן כדי לכסות את החתך. יש להיזהר שלא להגביל אהרגליים או מכניקת נשימה של nimal עם הרוטב.
24. בזהירות לפקח על בעלי החיים כפי שהוא מתאושש מן ההרדמה. נהל עצירות כל 12 שעות במשך 2-3 ימים לאחר ההליך לשליטה בכאב.

2. רקמות קציר הדבקה

1. חכה לפחות שבעה ימים לאחר הניתוח הראשוני. שוב, חיטוי מכשירי ניתוח להרדים את העכבר עם isoflurane.
2. לעקר את הבטן עם בבטאדין ואחריו אתנול 70%. להתגלח את שער שיער נוסף מהצד הימני של הבטן, כך דגימת ההידבקות המכילה עור לא תהיה מכוסית בשיער, מה שהופך היסטולוגיה יותר קשה.
3. השתמש חתך paramedian עזב, מאז מעי לעתים קרובות דבוק החתך המקורי. החל בקצה התחתון של הבטן, כ -5 מ"מימ מהשמאל בתחתית החתך המקורי, לתפוס את העור עם מלקחיים קטנים שיניים וחותכים את העור עם מספריים חדים. הרחב זה לחתוך מעולהly אל בית החזה. (איור 7)
4. בעזרת מספריים, לחתוך לתוך שכבת השרירים ואחרי הכניסה למקום הצפק, להאריך את לחתוך את החלק העליון והתחתון של החתך. תהיינה רקמות דבקות בגרימת cecum ואת המעי דק לדבוק דפנות ימין של הבטן ואולי גם החתך המקורי. (איור 8)
5. בעזרת מספריים והחל מ קצה של החתך, מעל לרמה של cecum, להתחיל לחתוך לתוך דופן הבטן במעגל מסביב לאזור שבו המעי הוא חסיד.
6. לסירוגין מעל ומתחת לרמה של cecum, בהדרגה לחתוך את כל הדרך סביב ההידבקות לסגור את המעגל, מניב "אי" של עור חסיד דופן בטן אל המעי. (איור 9)
7. שוב באמצעות מספריים, לחתוך לתוך המעי ולהפריד החלק חסיד משאר המעי, מניב כריך של רקמות שמורכבת העור דופן הבטןמצד אחד, מעי בצד השני, ורקמות דבקות מחבר בין שני שביניהם. (איור 10)
8. לחלופין, להשתמש במספריים מחודדים כדי להפריד את העור בצורה חדה מן השריר בדופן בטן. עבור היסטולוגיה לשקול לעזוב את העור המצורף, אבל לבידוד עיכול תא העור ניתן להסיר. אם הרקמה ישמש היסטולוגיה, הקפד להסיר חומר תפר ככל האפשר מבלי להפריע ממשק דבק יתר על המידה. לעיכול לצינוק מקובל להשאיר את התפרים במקום כל עוד הרקמה לעכל מסונן.
9. לאחר מוציא רקמות הידבקות, להרדים את העכבר באמצעות שיטה הומנית שאושרה על ידי ועדת השימוש בבעלי חיים המוסדית שלך.

תוצאות

בשבעה ימים לאחר ניתוח, את cecum ואולי עולה מעי גס, כבד, ולולאות של מעי דק אמורים להיות חסיד אל דופן הבטן הימנית צדדית. (איור 8) רקמת ניכרת יכול להיות מוטבעת מחולק ויניב שקופיות היסטולוגית מעולות. (איור 11, 12)

Discussion

השלבים הקריטיים בהליך זה הם: ביסודיות ששרטו את cecum מבלי לגרום ניקוב, צבת תפרים בתוך דפנות הבטן, וליישם את הכמות הנכונה של עמילן. רק להחיל נייר זכוכית אל cecum, או לחלק מסוים קטן של המעי. שימוש רחב של נייר זכוכית על כמויות גדולות של מעי דק נוטה לגרום ileus משמעותי. תשמור על עצמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole of the appropriate size
Isothesia isoflurane	Henry Schein	050033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/mL	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27G	Becton  Dickinson	329412
Povidone Iodine Prep Solution	Medline	MDS093944H
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
General-Purpose Labarotory Labeling tape	VWR	89097-912
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
100 grit 1/4 sheet sandpaper	ACE Hardware	1010446	Cut into strips
4-0 silk suture, 30", SH needle	Ethicon	K831
7-0 PDS II absorbable monofilament suture, 30", BV-1 needle	Ethicon	Z135	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Rice starch	MP Biomedicals	102955
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37° C prior to use
10 mL syringe	Becton Dickinson	309604
6-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", RB-1 taper needle	Ethicon	J212H
6-0 Ethilon nylon monofilament  suture, 18", P-3 needle,	Ethicon	1698G
Tegaderm Transparent Film Dressing Frame Style, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half lengthwise