Создание спаек в брюшной полости у мышей

Резюме

Abdominal adhesions that form after surgery are a major cause of pain, infertility, and hospitalization and reoperation for small bowel obstruction. Our surgical procedure for creating abdominal adhesions in mice is a reliable tool to study the mechanisms underlying the formation of adhesions.

Аннотация

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or intraabdominal infection. The precise mechanisms underlying adhesion formation are poorly understood. Many compounds and physical barriers have been tested for their ability to prevent adhesions after surgery with varying levels of success. The mouse and rat are important models for the study of abdominal adhesions. Several different techniques for the creation of adhesions in the mouse and rat exist in the literature. Here we describe a protocol utilizing abrasion of the cecum with sandpaper and sutures placed in the right abdominal sidewall. The mouse is anesthetized and the abdomen is prepped. A midline laparotomy is created and the cecum is identified. Sandpaper is used to gently abrade the surface of the cecum. Next, several figure-of-eight sutures are placed into the peritoneum of the right abdominal sidewall. The abdominal cavity is irrigated, a small amount of starch is applied, and the incision is closed. We have found that this technique produces the most consistent adhesions with the lowest mortality rate.

Введение

Спаек в брюшной полости являются формой рубцовой ткани, которые образуют в брюшной полости в ответ на воспаление, как правило, после операции или внутрибрюшного инфекции. Спайки являются основной причиной хронической боли в области живота и бесплодия, и являются наиболее частой причиной непроходимости тонкой кишки ^1. Присутствие спаек делает выполнение второй полостной операции более трудным и увеличивает вероятность осложнений ^2.

Несмотря на многолетние исследования, механизмы, лежащие образование спаек остаются плохо понятыми. Известно , что первоначальное повреждение поверхности брюшины вызывает экссудацией фибрина обогащенной жидкостью, которая затем образует сгусток , который связывает поверхности кишечника и брюшной стенки вместе ^3. Позже, фибробласты и другие клетки мигрируют в адгезивный пространство и секретируют соединительной ткани ^4. В течение месяцев до нескольких лет адгезия созревает путем развития кровеносных сосудов и нервов 5.

Несколько коммерческих продуктов существуют , которые предназначены для уменьшения образования спаек после операции на брюшной полости (например, Seprafilm). Все эти продукты действуют как механические барьеры и остановить образование спаек путем предотвращения физического контакта между петлями кишечника и брюшной стенки ^6,7. Несмотря на доказательства из контролируемого исследования , что хирургическая адгезией барьер уменьшает образование спаек ^8, многие хирурги Занимательно были разочарованы эффективностью механических барьерных продуктов.

В настоящее время нет никаких лекарств на основе анти-адгезионные терапии, которая отражает тот факт, что точные процессы, участвующие в формировании адгезии плохо изучены. Разработка терапии, которая конкретно направлена ​​на клеточных или молекулярных агентов, участвующих в образовании спаек потребует более четкого понимания событий, которые участвуют в формировании адгезии. Несколько группаs выявили молекулярные пути , которые могут быть важны для образования спаек ^9-11. Животные модели обеспечивают превосходную среду для изучения образования спаек. Многие исследования были опубликованы , описывающее хирургическое создание адгезии в нескольких животных особое крысы и мыши ^6,12-14. Учитывая наш опыт с изучением фиброзом у мышей и широкой доступности трансгенных мышей и мышей на основе антител, мы выбрали мышь в качестве нашей модели для изучения спаек. Здесь мы сообщаем о технике, которую мы разработали, чтобы воспроизводимо и надежно создавать спаек в брюшной полости у мышей.

протокол

Следующий протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета Стэнфордского университета (IACUC) путем и соответствует всем институциональным этических принципов в отношении использования лабораторных животных.

1. Создание спаек брюшной полости

1. Запуск мыши на антибактериальной чау диеты за одну неделю до процедуры.
2. Автоклав хирургических инструментов и предварительно согреть солевой раствор для орошения.
3. Обезболить мышь, используя 2% вдыхаемого изофлуран.
4. С помощью машинки для стрижки волос с последующим быстрым приложением (5 - 10 сек) для депиляции агента, удалить волосы из большинства поверхности живота. Тщательно удалите депиляции средство, аккуратно протерев влажной марлей и, необязательно, осторожно макая нижнюю половину мыши в теплую воду. Тщательно высушите животное.
5. Поместите морду животного в анестезирующего конусообразной. В течение всей операции, внимательно следить за гespiratory скорость животного и титруют скорость потока анестетика по мере необходимости.
6. Используйте устройство потепления, таких как грелку или согревающий лампы, чтобы предотвратить переохлаждение.
7. До готовя живота, закрепить мышь с полосками ленты, расположенных выше и ниже живота, чтобы предотвратить мышь от смещения во время операции. Лечить живота с бетадин, а затем следуют с 70% -ным этанолом. Укажите как можно больше площади, как это возможно в стадии подготовки, в том числе волосы на краях бритой области. Поместите стерильную драпировка над мышью. (Рисунок 1)
8. Подкожно вводят 0,1 мг / кг бупренорфина, или 3 мкг в течение 30 г мыши.
9. Делают разрез кожи.
   1. Начиная с нижней части живота средней линии, захватите кожу с пинцетом и сделать неглубокий вертикальный разрез в коже, используя острые ножницы.
   2. Провести разрез главно к xyphoid с ножницами. Позаботьтесь, чтобы войти только кожу.
10. По мере того как брюшная мускулатура пвл видны покрытия внутренностей, возьмитесь за среднюю линию мускулатуры с пинцетом и очень осторожно делают небольшой разрез в нее с помощью острыми ножницами. Убедитесь в том, чтобы случайно не разрезать на брюшной орган.
11. После ввода в брюшную пространство с небольшим разрезом и, видя мышечный слой отстраниться от органов брюшной полости, расширить разрез главно и книзу, вставляя ножницы в отверстие и тщательно резки в обоих направлениях. Продлить разрез от xyphoid главно выше мочевого пузыря книзу. (Рисунок 2)
12. Теперь, когда кишечник подвергаются, найдите слепая кишка и осторожно экстериоризоваться его. Избегайте захватывая слепая кишка с зубчатыми или острыми щипцами. Вместо того, чтобы использовать атравматической щипцами, такой как зубчатыми щипцами Адсон.
13. Обработайте слепая кишка с наждачной бумагой.
    1. Аккуратно обдирать всю поверхность обеих сторон слепая кишка с 100 наждачной бумаги в течение 30 - 60 секунд, пока поверхность не станет менее блестящей и петехии appeaг на поверхности. Если хирург правой рукой, она помогает ориентировать слепая кишка с наконечником, обращенной вправо и драпировка слепая кишка над левым указательным пальцем хирурга. (Рисунок 3)
    2. Выполните шлифовальную осторожно, так как это легко случайно вызвать перфорацию тонкой стенки слепой кишки. Небольшое количество зернистости должно восприниматься как наждачная бумага перемещается вдоль поверхности слепой кишки. Если наждачная бумага ощущается неоднократно ловить на слепую, это, вероятно, вызовет разрыв в стенке слепой кишки. Внимательно следите, чтобы гарантировать, что частицы наждачной бумаги не смещать и остаются в брюшной полости, так как это может привести к чрезмерной реакции на инородное тело.
    3. Если разрыв в стенке слепой кишки происходит, прекратить процедуру и усыпить животное.
    4. Если слепокишечный кровеносный сосуд срезается с помощью наждачной бумаги и вызывает кровотечение, удерживая давление в течение до двух минут с марлей. Однако, если кровотечение продолжается после этого времени, поместите фигурное из восьми 7-0 мононити шов вокруг да околоточка кровотечения. Это позволит надежно остановить кровотечение почти во всех случаях. Заботьтесь, чтобы не включать большое количество слепой кишки стены в шовного материала, так как это вызывает риск некроз пораженной части стены.
14. Травмировать правой брюшной боковой стенки.
    1. Используйте полосу наждачной бумагой, чтобы обдирать перитонеальный поверхность мышцы правой брюшной боковой стенки. Будьте более агрессивными с шлифовкой здесь, чем на слепую и продолжайте, пока вся поверхность правой брюшной боковой стенки не появится разогнали. Избегайте шлифования так сильно, что кожа видна через отверстия в мышечном слое. (Рисунок 4)
    2. Использование драйвера Кастро-Вьехо иглы, место между двумя и четырьмя термоэлектрическую восемь 4-0 шелковые швы в мышечный слой правой брюшной боковой стенки. Оставьте хвосты длиной примерно 5 мм. Будьте осторожны, чтобы случайно не поймать стенку кишечника в шовного материала. (Рисунок 5)
15. С помощью 10 мл шприц, заполненный WIth нагретый солевой раствор, орошают Кишечник несколько раз. Прямой поток солевого раствора в брюшную полость, чтобы орошать интерьер, а также. Если поверхность под мышью становится замачивают, переместить курсор или заменить поверхность, чтобы избежать гипотермии.
16. Используйте стерильную марлю, расположенную над надрез, чтобы впитать избыток орошения.
17. Возьмем щепотку крахмала и посыпать его на поверхность правой брюшной боковой стенки и на обе стороны слепой кишки. (Рисунок 6)
18. Убедитесь, что нет активного кровотечения. Если есть, использовать марлевую губкой, чтобы оказать давление непосредственно на точку кровотечения, пока он не остановится. Если кровотечение делает легко не остановить, поместите кровоостанавливающее швом, как описано выше.
19. Используя тупой конец щипцами и пальцем, осторожно надавите кишечники обратно в брюшную полость. Поместите слепую кишку рядом с швами в правой брюшной боковой стенки, с тем, чтобы максимально увеличить образование спаек.
20. Спотерять брюшной разрез.
    1. Использование 6-0 рассасывающийся плетеный шовный материал, поместите бегущий стежок в мышечный слой в верхней части разреза.
    2. Запуск шовного материала вниз по направлению к нижней части разреза, в результате чего вместе мышечный слой. Путешествие примерно 3 мм и принимать 3 мм укусы с каждой новой строчкой. Будьте осторожны, чтобы случайно не принять укус кишечника при размещении швов.
    3. В нижней части разреза, оставьте петлю из нити от предыдущего укуса и использовать это, чтобы инструмент связать шовный материал. Отрежьте нить, оставив 5 мм хвосты.
    4. Повторите вышеуказанные три шага с 6-0 нейлоновой мононити швом, чтобы закрыть кожу.
21. Администрирование 20 мл / кг подкожно-солевой болюса (примерно 0,5 мл на 30 г мыши).
22. С помощью сухой марлей, тщательно высушить все животное, как спинной мех имеет тенденцию становиться влажным во время полива.
23. Неплотно заверните клей повязка вокруг живота, чтобы покрыть надрез. Заботьтесь, чтобы не ограничивать Aноги Нимал в дыхательные или механика с заправкой.
24. Внимательно следить за состоянием животного, как он оправится от анестезии. Администрирование бупренорфина каждые 12 ч в течение 2-3 дней после процедуры для контроля боли.

2. Заготовка Адгезия ткани

1. Подождите, как минимум семи дней после первоначальной операции. Опять же, автоклав хирургические инструменты и обезболить мышь с изофлуран.
2. Стерилизовать живота с последующим бетадин 70% этанола. Бритье и депилировать дополнительные волосы с правой стороны живота, так что адгезия образца, содержащего кожу не будут покрыты волосами, что делает более трудным гистологии.
3. Используйте левую парасрединную надрез, так как кишечник часто прилипает к первоначальному надрез. Начиная с нижнего конца живота, около 5 мм слева от нижней части первоначального разреза, схватить кожу с маленькими зубчатыми щипцами и нарезать на кожу с острыми ножницами. Продлить это сократить превосходствоLY к ребрам. (Рисунок 7)
4. С помощью ножниц, разрезают на мышечный слой и после ввода в брюшную пространство, расширить разрез на верхней и нижней части разреза. Там будет клеевой ткани вызывает слепую кишку и тонкую кишку, чтобы прилипать к правой боковой стенки живота и, возможно, также к первоначальному разреза. (Рисунок 8)
5. С помощью ножниц и, начиная от края разреза, выше уровня слепой кишки, начинают резки в брюшную стенку в круг вокруг области, где кишка клейкий.
6. Переменный выше и ниже уровня слепой кишки, постепенно сократить весь путь вокруг адгезией и замкнуть круг, что дает "остров" кожи и брюшной стенки прилежит к кишечника. (Рисунок 9)
7. Опять же с помощью ножниц, разрезают на кишечник и отделить прилипшие часть от остальной части кишечника, что дает сэндвич ткани, которая состоит из кожи и брюшной стенкис одной стороны, кишечника, с другой стороны, и клеевой ткани, соединяющей два между ними. (Рисунок 10)
8. Необязательно использовать заостренным ножницы, чтобы резко отделить кожу от брюшной стенки мышцы. Для гистологии рассмотреть оставляя кожу прилагается, но для пищеварения и выделения клеток кожи может быть удален. Если ткань будет использоваться для гистологии, убедитесь, чтобы удалить как можно больше шовного материала, насколько это возможно без чрезмерного нарушения интерфейс клеевой. Для пищеварения и выделения клеток допустимо оставить швы на месте до тех пор, как ткань фильтруют дайджеста.
9. После иссечения спаек ткани, усыпить мышь, используя гуманный метод, одобренный вашим институциональном использования животных комитета.

Результаты

В семь дней после операции, слепой кишки и, возможно, восходящей ободочной кишки, печени и петли тонкой кишки должен быть приверженцем правосторонней брюшной стенки. (Рисунок 8) иссекают ткань может быть вложена и секционного и даст отличные гистологически...

Обсуждение

Критические шаги в этой процедуре являются: тщательно абразивной слепой кишки, не вызывая перфорацию, размещение швов в брюшной боковой стенки, и применяя нужное количество крахмала. применять наждачную бумагу только в слепую кишку, или в небольшой определенной части кишечника. Широк?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole of the appropriate size
Isothesia isoflurane	Henry Schein	050033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/mL	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27G	Becton  Dickinson	329412
Povidone Iodine Prep Solution	Medline	MDS093944H
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
General-Purpose Labarotory Labeling tape	VWR	89097-912
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
100 grit 1/4 sheet sandpaper	ACE Hardware	1010446	Cut into strips
4-0 silk suture, 30", SH needle	Ethicon	K831
7-0 PDS II absorbable monofilament suture, 30", BV-1 needle	Ethicon	Z135	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Rice starch	MP Biomedicals	102955
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37° C prior to use
10 mL syringe	Becton Dickinson	309604
6-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", RB-1 taper needle	Ethicon	J212H
6-0 Ethilon nylon monofilament  suture, 18", P-3 needle,	Ethicon	1698G
Tegaderm Transparent Film Dressing Frame Style, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half lengthwise