マウスの腹部癒着の作成

要約

Abdominal adhesions that form after surgery are a major cause of pain, infertility, and hospitalization and reoperation for small bowel obstruction. Our surgical procedure for creating abdominal adhesions in mice is a reliable tool to study the mechanisms underlying the formation of adhesions.

要約

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or intraabdominal infection. The precise mechanisms underlying adhesion formation are poorly understood. Many compounds and physical barriers have been tested for their ability to prevent adhesions after surgery with varying levels of success. The mouse and rat are important models for the study of abdominal adhesions. Several different techniques for the creation of adhesions in the mouse and rat exist in the literature. Here we describe a protocol utilizing abrasion of the cecum with sandpaper and sutures placed in the right abdominal sidewall. The mouse is anesthetized and the abdomen is prepped. A midline laparotomy is created and the cecum is identified. Sandpaper is used to gently abrade the surface of the cecum. Next, several figure-of-eight sutures are placed into the peritoneum of the right abdominal sidewall. The abdominal cavity is irrigated, a small amount of starch is applied, and the incision is closed. We have found that this technique produces the most consistent adhesions with the lowest mortality rate.

概要

腹部癒着は、通常、手術や腹腔内感染後、炎症に反応して腹部に形成瘢痕組織の形態です。癒着は、慢性腹痛や不妊症の主な原因であり、小腸閉塞¹の最も一般的な原因です。癒着の存在は、第二の開腹手術を行うより困難になり、合併症²の可能性を増大させます。

長年の研究にもかかわらず、癒着の形成の基礎となるメカニズムはよくわかっていないままです。腹膜表面への初期の損傷は、その後腸腹壁一緒³の表面に結合する血餅を形成するフィブリンに富む流体の浸出を引き起こすことが知られています。その後、線維芽細胞および他の細胞は、接着剤空間に移行し、結合組織^4を分泌^します 。年に数ヶ月にわたり接着は血管や神経を開発することによって、成熟します ^5。

いくつかの市販の製品は、腹部手術（ 例えば 、Seprafilm）後の癒着の形成を減少させるように設計されているものが存在します。これらの製品のすべては、機械的障壁として作用し、腸のループと腹壁^6,7間の物理的接触を防止することによって、癒着形成を停止させます。外科的癒着バリアは、癒着⁸の形成を減少させる対照試験からの証拠にもかかわらず、多くの外科医は、逸話的、機械的障壁製品の有効性に失望されています。

現在、癒着形成に関与する正確なプロセスが十分に理解されていないという事実を反映しない薬剤ベースの抗接着療法は、存在しません。具体的に接着の形成に関与しているイベントの理解向上を必要とする癒着​​の形成に関与する細胞または分子薬剤を標的に治療を開発します。いくつかのグループSは、癒着形成^9-11にとって重要である分子経路を同定しました。動物モデルは、癒着の形成を研究するための優れた環境を提供します。多くの研究は、いくつかの動物、特にラットおよびマウス^6,12-14に接着の外科的な作成を記述する公開されています。マウスやトランスジェニックマウスとマウスベースの抗体の広い可用性における線維症を研究して私たちの経験を考えると、我々は癒着の研究のための我々のモデルとしてマウスを選択しました。ここで、我々は再現性と確実マウスにおける腹部癒着を作成するために開発した技術を報告しています。

プロトコル

以下のプロトコルは、スタンフォード大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、研究用動物の使用に関するすべての機関の倫理ガイドラインに適合しています。

腹部癒着の1創出

1. 1週間前の手順への抗生物質の固形飼料の上でマウスを開始します。
2. 手術器具とプリ暖かい生理食塩水の洗浄溶液をオートクレーブ。
3. 2％吸入イソフルランを用いてマウスを麻酔。
4. 迅速なアプリケーションが続くバリカン使用 - 脱毛剤の（5〜10秒）、腹部の表面の大部分から毛を取り除きます。徹底的に優しく慎重に温水中にマウスの下半分を液体につけることにより、任意に湿ったガーゼと、で拭いて除毛剤を除去。徹底的に動物を乾燥させます。
5. 麻酔ノーズコーンに動物の鼻を置きます。全体の手術中、慎重にRを監視espiratory動物の速度、必要に応じて麻酔流速を滴定します。
6. 低体温症を防止するために、加熱パッドまたは加温ランプ等の加温装置を使用します。
7. 腹部を準備中に先立ち、手術中にシフトするからマウスを防ぐために、腹部の上方および下方に配置されたテープのストリップでマウスを固定します。ベタジンで腹部を消毒し、その後、70％エタノールで従ってください。剃った領域の端の毛など、準備中のできるだけ多くの地域が含まれます。マウスオーバー滅菌ドレープを配置します。 （ 図1）
8. 皮下に0.1ミリグラム/キログラムブプレノルフィン、または30グラムのマウスのための3μgのを注入します。
9. 皮膚切開を行います。
   1. 下腹部の正中線に出発し、鉗子で皮膚をつかみ、鋭いハサミを用いて皮膚内の浅い縦カットをします。
   2. ハサミで剣状突起に上方カットを運びます。皮膚のみを入力するように注意してください。
10. 腹部の筋肉組織は、nであるようにOW内臓を覆って見え、鉗子で筋肉組織の正中線を把握し、非常に慎重に鋭いハサミを使用して、その中に小さなカットをします。誤って腹部臓器にカットしないように注意してください。
11. 小さなカットで腹膜腔に進入し、筋層は腹部臓器から引き離す見た後、開口部にはさみを挿入し、慎重に両方の方向に切断することにより、上方と下方カットを拡張します。剣状突起から上方に下方膀胱の上に切開を拡張します。 （ 図2）
12. 今腸が露出していることを、盲腸を見つけて静かに体外に出します。歯付きまたは鋭いピンセットで盲腸を把握することは避けてください。代わりに、このようなAdson鋸歯状の鉗子として、非外傷性鉗子を使用しています。
13. 紙やすりで盲腸をすり減らします。
    1. 表面はあまり光沢があり、点状出血appeaになるまで60秒 - ゆっくり30 100グリットのサンドペーパーで盲腸の両側の表面全体を研磨表面上のR。外科医が右利きの場合は、先端が右に向けて盲腸を向けると、外科医の左人差し指の上に盲腸をドレープするのに役立ちます。 （ 図3）
    2. 誤って薄い盲腸壁の穿孔を引き起こすことは容易であるように、軽くサンディングを行います。サンドペーパーは、盲腸の表面に沿って移動されるようにざらつき感の少量が感じされるべきです。サンドペーパーを繰り返し盲腸に引っ掛かる感じられる場合、これはおそらく、盲腸壁に涙の原因となります。サンドペーパーの粒子が外れると、これは過剰な異物反応を引き起こす可能性があるとして、腹部に残っていないことを確実にするために注意して観察してください。
    3. 盲腸壁に涙が発生した場合は、手順を終了し、動物を安楽死させます。
    4. 盲腸血管がサンドペーパーにより剪断や出血が発生した場合は、ガーゼで最大2分間圧力を保持します。出血がこの時間後に解消されない場合は、周囲に8の字7-0モノフィラメント縫合糸を配置出血のポイント。これは確実に、ほぼすべてのケースで出血を停止します。これは、壁の関与部分の壊死を引き起こすリスクとして、縫合糸に盲腸壁を大量に取り込まないように注意してください。
14. 右腹部の側壁を傷つけます。
    1. 右腹部の側壁の筋肉の腹膜表面を研磨するためにサンドペーパーのストリップを使用してください。サンディングとここより盲腸にもっと積極的に、右腹部側壁の表面全体がアップ荒れ表示されるまで継続します。皮膚は筋層内の開口部を介して表示されるようにハードサンディング避けてください。 （ 図4）
    2. カストロ・ビエホ針ドライバを使用して、右腹部側壁の筋層に4-0 8の字2〜4シルクのステッチを配置します。約5mm長い尾を残します。誤って縫合糸に腸壁をキャッチしないように注意してください。 （ 図5）
15. wが充填された10mlのシリンジを使用してi番目は、腸を数回灌漑、生理食塩水を温めました。同様に、内部を洗浄するために腹腔内に生理食塩水の流れを向けます。マウスの下の表面がずぶぬれになった場合、低体温を避けるために、表面を上にマウスを移動したり、交換してください。
16. 過剰な灌漑を吸収するために切開の上に置か滅菌ガーゼを使用してください。
17. 澱粉のピンチを取ると右腹部側壁の表面に盲腸の両側にそれを振りかけます。 （ 図6）
18. アクティブな出血がないことを確認します。ある場合は、それが停止するまで出血のポイントに直接圧力を適用するために、ガーゼスポンジを使用します。出血が容易に停止しない場合は上記のように、止血縫合糸を配置します。
19. 鉗子や指の平滑末端を使用して、静かに腹腔内に戻って腸を押してください。癒着形成を最大化するために、次の右腹部の側壁における縫合糸に盲腸を置きます。
20. C言語腹部切開を失います。
    1. 6-0吸収性編組縫合糸を使用して、切開部の上部にある筋層にランニングステッチを配置します。
    2. 筋層を結集し、ダウン切開の底に向かって縫合糸を実行します。約3mmで旅行すると、それぞれの新しいステッチで3ミリメートル刺さを取ります。縫合糸を配置しながら、誤って腸の一口を取るしないように注意してください。
    3. 切開部の底部には、前のbiteから縫合糸のループを残し、縫合糸を結ぶ機器にこれを使用しています。 5ミリメートル尾を残して縫合糸をカットします。
    4. 皮膚を閉じるには、6-0ナイロンモノフィラメント縫合糸で上記の3つの手順を繰り返します。
21. 20ミリリットル/ kgの皮下生理食塩水ボーラス（30グラムのマウスのためのおよそ0.5ミリリットル）を管理します。
22. 背の毛皮は、灌漑の間に濡れする傾向があるとして、ドライガーゼを使用して、徹底的に、動物全体を乾燥させます。
23. ゆるく切開部をカバーするために、腹部の周りに包帯接着剤を包みます。 Aを拘束しないように注意してくださいドレッシングニマルの足や呼吸力学。
24. それは麻酔から回復するように慎重に動物を監視します。疼痛管理のための手順の後にブプレノルフィンを2〜3日ごとに12時間を管理します。

2.収穫接着組織

1. 最初の手術後7日以上の間隔をあけてください。ここでも、手術器具をオートクレーブし、イソフルランでマウスを麻酔。
2. 70％エタノール、続いベタジンで腹部を滅菌します。皮膚を含む接着片を組織学をより困難にする、髪でカバーされないように、腹部の右側から追加の毛を剃ると毛を抜きます。
3. 腸は、多くの場合、元の切開部に貼り付けられているので、左paramedian切開を使用してください。腹部の下端に出発し、元の切開部の下部の左側に約5ミリメートルは、小さな歯付き鉗子で皮膚をつかみ、鋭いハサミで皮膚にカット。優れたこのカットを拡張胸郭へLY。 （ 図7）
4. はさみを使用して、筋層に切断し、腹膜腔に入った後、切開部の上部と下部に切り込みを拡張します。盲腸と小腸が元の切開部にも可能性が腹部の右側の側壁に付着し、させる接着剤の組織があります。 （ 図8）
5. 盲腸のレベルを超えて、はさみを使用して、切開部の端に開始、腸が付着している領域の周囲に円形に腹壁に切断開始。
6. 徐々に密着周りのすべての方法をカットし、円を完了し、腸、皮膚、腹壁の付着の「島」をもたらす、盲腸のレベルの上方と下方に交互に。 （ 図9）
7. 再び皮膚および腹壁から構成された組織のサンドイッチを得、腸に切断し、腸の残りの部分から付着部分を分離し、はさみを使用して一方の側、反対側の腸、および接着剤の組織上の間に2つを接続します。 （ 図10）
8. 必要に応じて、急激に腹壁筋から皮膚を分離するために先の尖ったハサミを使用しています。組織学のために取り付けられた皮膚を残して検討したが、消化し、細胞単離のために皮膚を除去することができます。組織は、組織学のために使用される場合、過度に接着界面を乱すことなく、できるだけ多くの縫合糸材料を除去するようにしてください。消化および細胞単離のためには、限り、ダイジェストがフィルタリングされる組織として所定の位置に縫合糸を残すことが許容可能です。
9. 接着組織を切除した後、あなたの制度的動物使用委員会によって承認された人道的な方法を用いてマウスを安楽死させます。

結果

手術、盲腸、おそらく上行結腸、肝臓、および小腸のループ後の7日目に右側腹壁に付着すべきです。 （ 図8）切除した組織が ​​埋め込 ​​まれており、切断し、優れた組織スライドをもたらすことができます。 （ 図11、12）

手順が正しく行われた場合、100％のマウスは、7日目にかなりの...

ディスカッション

この手順の重要なステップは次のとおりです。徹底的に、穿孔を引き起こすことなく、盲腸を研磨腹部側壁に縫合糸を配置し、及びデンプンの適切な量を適用します。盲腸まで、または腸の小さな特定の部分に紙やすりをのみ適用されます。小腸大量のサンドペーパーの普及が著しいイレウスを引き起こす傾向があります。表面が粗くなり、十分な力で盲腸を研磨するように注意してくださ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole of the appropriate size
Isothesia isoflurane	Henry Schein	050033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/mL	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27G	Becton  Dickinson	329412
Povidone Iodine Prep Solution	Medline	MDS093944H
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
General-Purpose Labarotory Labeling tape	VWR	89097-912
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
100 grit 1/4 sheet sandpaper	ACE Hardware	1010446	Cut into strips
4-0 silk suture, 30", SH needle	Ethicon	K831
7-0 PDS II absorbable monofilament suture, 30", BV-1 needle	Ethicon	Z135	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Rice starch	MP Biomedicals	102955
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37° C prior to use
10 mL syringe	Becton Dickinson	309604
6-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", RB-1 taper needle	Ethicon	J212H
6-0 Ethilon nylon monofilament  suture, 18", P-3 needle,	Ethicon	1698G
Tegaderm Transparent Film Dressing Frame Style, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half lengthwise