Création d'abdominaux adhérences chez la souris

Résumé

Abdominal adhesions that form after surgery are a major cause of pain, infertility, and hospitalization and reoperation for small bowel obstruction. Our surgical procedure for creating abdominal adhesions in mice is a reliable tool to study the mechanisms underlying the formation of adhesions.

Résumé

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or intraabdominal infection. The precise mechanisms underlying adhesion formation are poorly understood. Many compounds and physical barriers have been tested for their ability to prevent adhesions after surgery with varying levels of success. The mouse and rat are important models for the study of abdominal adhesions. Several different techniques for the creation of adhesions in the mouse and rat exist in the literature. Here we describe a protocol utilizing abrasion of the cecum with sandpaper and sutures placed in the right abdominal sidewall. The mouse is anesthetized and the abdomen is prepped. A midline laparotomy is created and the cecum is identified. Sandpaper is used to gently abrade the surface of the cecum. Next, several figure-of-eight sutures are placed into the peritoneum of the right abdominal sidewall. The abdominal cavity is irrigated, a small amount of starch is applied, and the incision is closed. We have found that this technique produces the most consistent adhesions with the lowest mortality rate.

Introduction

adhérences abdominales sont une forme de tissu cicatriciel qui se forment dans l'abdomen en réponse à l'inflammation, généralement après une intervention chirurgicale ou une infection intra-abdominale. Les adhérences sont une cause majeure de douleurs abdominales chroniques et l' infertilité, et sont la cause la plus fréquente de l' intestin grêle obstruction ^1. La présence d'adhérences rend la réalisation d' une seconde opération abdominale plus difficile et augmente le risque de complications ^2.

Malgré des années de recherche, les mécanismes sous-jacents de la formation d'adhérences restent mal connus. Il est connu qu'une lésion initiale à la surface péritonéale provoque une exsudation de fibrine riche en fluide, qui constitue alors un caillot qui se lie à la surface des intestins et de la paroi abdominale , ainsi que ^3. Plus tard, des fibroblastes et d' autres cellules migrent dans l'espace de l' adhésif et du tissu conjonctif sécrètent ^4. Au cours des mois à des années l'adhésion arrive à maturité en développant les vaisseaux sanguins et les nerfs ^5.

Il existe plusieurs produits commerciaux qui sont conçus pour réduire la formation d'adhérences après une chirurgie abdominale (par exemple Seprafilm®). Tous ces produits agissent comme des barrières mécaniques et arrêter la formation d'adhérences en empêchant le contact physique entre les boucles de l' intestin et le ^6,7 de la paroi abdominale. En dépit des preuves d'un essai contrôlé qu'une barrière d'adhérence chirurgicale réduit la formation d'adhérences ^8, de nombreux chirurgiens ont été déçus anecdotique avec l'efficacité des produits de barrière mécanique.

Actuellement, il n'y a pas de traitements anti-adhérence à base de médicaments, ce qui reflète le fait que les processus précis impliqués dans la formation d'adhérences sont mal comprises. Le développement d'une thérapie qui cible spécifiquement les agents cellulaires et moléculaires impliqués dans la formation d'adhérences, il faudra une meilleure compréhension des événements qui sont impliqués dans la formation de l'adhérence. Plusieurs groupess ont identifié les voies moléculaires qui peuvent être importants pour la formation d'adhérences ^9-11. Des modèles animaux fournissent un environnement exceptionnel pour étudier la formation d'adhérences. De nombreuses études ont été publiées décrivant la création chirurgicale d'adhérence chez plusieurs animaux, notamment le rat et la souris ^6,12-14. Compte tenu de notre expérience avec l'étude de la fibrose chez la souris et la grande disponibilité des souris transgéniques et des anticorps à base de souris, nous avons choisi la souris comme modèle pour l'étude des adhérences. Ici, nous rapportons la technique que nous avons mis au point pour créer de façon reproductible et fiable des adhérences abdominales chez la souris.

Protocole

Le protocole suivant a été approuvé par le Institutional soin et l'utilisation des animaux Comité Université Stanford (IACUC) et respecte toutes les directives éthiques institutionnelles relatives à l'utilisation des animaux de recherche.

1. Création d'adhérences abdominales

1. Commencez la souris sur l'antibiotique chow régime une semaine avant la procédure.
2. Autoclave les instruments chirurgicaux et préchauffer la solution d'irrigation saline.
3. Anesthetize la souris en utilisant 2% d'isoflurane inhalée.
4. En utilisant une tondeuse à cheveux suivie d'une application rapide (5 à 10 sec) d'un agent épilatoire, retirer les cheveux de la majorité de la surface de l'abdomen. Retirer soigneusement l'agent dépilatoire en essuyant doucement avec de la gaze humide et, éventuellement, par tremper soigneusement la moitié inférieure de la souris dans l'eau chaude. Sécher soigneusement l'animal.
5. Placez le museau de l'animal dans le cône de nez anesthésique. Pendant toute la chirurgie, suivre attentivement la rtaux espiratory de l'animal et titrer le débit anesthésique au besoin.
6. Utilisez un dispositif de réchauffement, comme un coussin chauffant ou une lampe chauffante, pour prévenir l'hypothermie.
7. Avant de préparer l'abdomen, sécuriser la souris avec des bandes de ruban adhésif placé au-dessus et au-dessous de l'abdomen pour empêcher la souris de se déplacer pendant la chirurgie. Désinfecter l'abdomen avec de la bétadine, puis suivre avec 70% d'éthanol. Inclure autant d'espace que possible dans la préparation, y compris les cheveux sur les bords de la zone rasée. Placez un champ stérile sur la souris. (Figure 1)
8. Injecter par voie sous- cutanée 0,1 mg / kg de buprénorphine ou 3 ug pour une souris de 30 g.
9. Faire l'incision de la peau.
   1. A partir de la ligne médiane abdominale inférieure, saisir la peau avec une pince et faire une coupe verticale peu profonde dans la peau en utilisant des ciseaux pointus.
   2. Effectuer la coupe supérieurement à la xiphoïde avec les ciseaux. Prenez soin d'entrer seulement la peau.
10. Comme la musculature abdominale est un groupe now visible couvrant les viscères, saisir la ligne médiane de la musculature avec une pince et très soigneusement faire une petite incision dans l'aide de ciseaux pointus. Assurez-vous de ne pas couper accidentellement dans un organe abdominal.
11. Après avoir entré l'espace péritonéal avec une petite coupure et de voir la couche musculaire tirer loin des organes abdominaux, étendre la coupe haut et en bas en insérant les ciseaux dans l'ouverture et la découpe soigneusement dans les deux sens. Prolongez l'incision de la xiphoïde supérieurement au-dessus de la vessie inférieurement. (Figure 2)
12. Maintenant que les intestins sont exposés, localiser le caecum et extérioriser doucement. Éviter de saisir le caecum avec une pince à dents ou tranchants. Au lieu d'utiliser une pince atraumatique comme un Adson pince dentelées.
13. Poncer le caecum avec du papier de verre.
    1. abraser doucement la surface entière des deux côtés de la caecum avec 100 papier de verre grain pour 30 - 60 secondes jusqu'à ce que la surface devient Appea moins brillante et pétéchiesr sur la surface. Si le chirurgien est droitier, il contribue à orienter le caecum avec la pointe tournée vers la droite et le drapé du caecum sur l'index gauche du chirurgien. (Figure 3)
    2. Effectuer le ponçage en douceur, comme il est facile de provoquer accidentellement une perforation de la paroi du caecum mince. Une petite quantité de granularité doit être ressentie comme le papier de verre est déplacé le long de la surface du caecum. Si le papier de verre se fait sentir à plusieurs reprises sur la capture du caecum, cela va probablement provoquer une déchirure de la paroi du caecum. Regardez attentivement pour assurer que les particules de papier de verre ne délogent et restent dans l'abdomen, car cela pourrait provoquer une réaction de corps étranger excessive.
    3. Si une déchirure de la paroi caecale se produit, mettre fin à la procédure et euthanasier l'animal.
    4. Si un vaisseau sanguin caecum est cisaillé par le papier de verre et provoque des saignements, maintenez la pression pendant deux minutes avec de la gaze. Cependant, si le saignement persiste après cette heure, placez un monofilament de suture figure-de-huit 7-0 autour de lapoint de saignement. Cela arrêtera de manière fiable le saignement dans presque tous les cas. Prenez soin de ne pas incorporer une grande quantité de paroi caecale dans la suture, car cela risque de provoquer une nécrose de la partie impliquée de la paroi.
14. Blesser le flanc droit de l'abdomen.
    1. Utilisez une bande de papier de verre pour poncer la surface péritonéale du muscle de la paroi latérale abdominale droite. Soyez plus agressif avec le ponçage ici que sur le caecum et continuer jusqu'à ce que toute la surface de la paroi latérale abdominale droite apparaît malmené. Éviter le ponçage si dur que la peau est visible à travers des ouvertures dans la couche musculaire. (Figure 4)
    2. L'utilisation d'un pilote d'aiguille Castro-Viejo, placer entre deux et quatre huit figure-de-4-0 points de suture de soie dans la couche musculaire de la paroi latérale abdominale droite. Laissez les queues d'environ 5 mm de long. Prenez soin de ne pas attraper accidentellement la paroi intestinale dans la suture. (Figure 5)
15. En utilisant une seringue de 10 ml remplie with chauffé une solution saline, irriguer les intestins à plusieurs reprises. Diriger le flux de solution saline dans la cavité abdominale pour irriguer l'intérieur aussi bien. Si la surface sous la souris devient trempé, déplacer la souris sur ou remplacer la surface, afin d'éviter l'hypothermie.
16. Utilisez une gaze stérile placée au-dessus de l'incision pour absorber l'excès d'irrigation.
17. Prenez une pincée d'amidon et saupoudrer sur la surface de la paroi latérale abdominale droite et sur les deux côtés du caecum. (Figure 6)
18. Assurez-vous qu'il n'y a pas de saignement actif. S'il y a, utilisez une éponge de gaze pour appliquer une pression directement sur le point de saignement jusqu'à ce qu'il arrête. Si le saignement ne cesse pas facilement, placer une suture hémostatique tel que décrit ci-dessus.
19. Utilisation de l'extrémité émoussée de la pince et un doigt, pousser doucement les intestins dans la cavité abdominale. Positionner le caecum à côté des points de suture dans la paroi latérale abdominale droite afin de maximiser la formation d'adhérences.
20. Cperdre l'incision abdominale.
    1. En utilisant 6-0 absorbable suture tressée, placez un point en cours d'exécution dans la couche musculaire en haut de l'incision.
    2. Exécuter la suture vers le fond de l'incision, qui réunit la couche musculaire. Voyage d'environ 3 mm et prendre 3 piqûres mm avec chaque nouveau point. Prenez soin de ne pas prendre accidentellement un morceau d'intestin en plaçant des sutures.
    3. Au fond de l'incision, laisser une boucle de suture de la morsure précédente et l'utiliser pour instrument attacher la suture. Couper le fil de suture en laissant 5 mm queues.
    4. Répétez les trois étapes ci-dessus avec 6-0 en nylon monofilament de suture pour fermer la peau.
21. Administrer un 20 ml / kg sous-cutanée saline bolus (environ 0,5 ml pour une souris de 30 g).
22. L'utilisation d'une gaze sèche, bien sécher l'animal entier, comme la fourrure dorsale a tendance à se mouiller lors de l'irrigation.
23. Enroulez un pansement adhésif autour de l'abdomen pour couvrir l'incision. Prenez soin de ne pas contraindre l'unles jambes nimal ou respiration mécanique avec le pansement.
24. Surveiller attentivement l'animal car il se remet de l'anesthésie. Administrer buprénorphine toutes les 12 heures pendant 2-3 jours après la procédure de contrôle de la douleur.

2. La récolte Adhérence Tissue

1. Attendre un minimum de sept jours après la chirurgie initiale. Encore une fois, l'autoclave instruments chirurgicaux et anesthésier la souris avec l'isoflurane.
2. Stériliser l'abdomen avec de la bétadine puis 70% d'éthanol. Rasage et depilate cheveux supplémentaire du côté droit de l'abdomen de sorte que l'échantillon d'adhérence contenant la peau ne seront pas couverts dans les cheveux, ce qui rend plus difficile l'histologie.
3. Utilisez une incision paramédiane gauche, puisque l'intestin est souvent collé à l'incision d'origine. À partir de l'extrémité inférieure de l'abdomen, à environ 5 mm à gauche de la partie inférieure de l'incision initiale, saisir la peau avec une petite pince à dents et couper dans la peau avec des ciseaux pointus. Etendre cette coupe supérieurely à la cage thoracique. (Figure 7)
4. Avec des ciseaux, couper dans la couche musculaire et après l'entrée dans l'espace péritonéal, prolonger la coupe vers le haut et le bas de l'incision. Il y aura un tissu adhésif provoquant le caecum et l'intestin grêle à adhérer à la paroi latérale droite de l'abdomen et éventuellement aussi à l'incision initiale. (Figure 8)
5. À l'aide des ciseaux et en commençant sur le bord de l'incision, au-dessus du niveau du caecum, commencer à couper dans la paroi abdominale en cercle autour de la zone où l'intestin est adhérent.
6. Alternant ci-dessus et au-dessous du niveau du caecum, couper progressivement tout le chemin autour de l'adhérence et de compléter le cercle, ce qui donne une «île» de la peau et abdominale adhérente de la paroi à l'intestin. (Figure 9)
7. Encore une fois en utilisant les ciseaux, couper dans l'intestin et de séparer la partie adhérente du reste de l'intestin, ce qui donne un sandwich de tissu qui se compose de la peau et la paroi abdominaled'un côté, de l'intestin de l'autre côté, et le tissu adhésif reliant les deux entre les deux. (Figure 10)
8. Eventuellement, utiliser une paire de ciseaux pointus pour séparer fortement la peau du muscle de la paroi abdominale. Pour l'histologie envisager de laisser la peau attachée, mais pour la digestion et l'isolement cellulaire de la peau peut être enlevée. Si le tissu sera utilisé pour l'histologie, assurez-vous d'enlever le plus de matériel de suture que possible sans trop perturber l'interface adhésive. Pour la digestion et l'isolement de la cellule, il est acceptable de laisser les fils de suture en place aussi longtemps que le tissu de digestion est filtré.
9. Après l'excision des tissus d'adhérence, euthanasier la souris à l'aide d'une méthode humaine approuvée par votre comité institutionnel de l'utilisation des animaux.

Résultats

A sept jours après la chirurgie, le caecum et éventuellement le côlon ascendant, le foie et les boucles de l'intestin grêle doit être adhérente à la paroi abdominale du côté droit. (Figure 8) de tissu excisé peut être intégré et sectionné et donnera d' excellentes lames histologiques. (Figure 11, 12)

Lorsque la procédure est exécutée correctement, 100% des souris...

Discussion

Les étapes essentielles de cette procédure sont: abraser soigneusement le caecum sans provoquer la perforation, en plaçant des sutures dans la paroi latérale abdominale, et appliquer la bonne quantité d'amidon. Seulement appliquer du papier de verre pour le caecum, ou à une petite partie spécifique de l'intestin. Une large utilisation de papier de verre sur de grandes quantités de l'intestin grêle a tendance à provoquer un iléus significatif. Prenez soin d'abraser le caecum avec suffisamment d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole of the appropriate size
Isothesia isoflurane	Henry Schein	050033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/mL	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27G	Becton  Dickinson	329412
Povidone Iodine Prep Solution	Medline	MDS093944H
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
General-Purpose Labarotory Labeling tape	VWR	89097-912
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
100 grit 1/4 sheet sandpaper	ACE Hardware	1010446	Cut into strips
4-0 silk suture, 30", SH needle	Ethicon	K831
7-0 PDS II absorbable monofilament suture, 30", BV-1 needle	Ethicon	Z135	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Rice starch	MP Biomedicals	102955
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37° C prior to use
10 mL syringe	Becton Dickinson	309604
6-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", RB-1 taper needle	Ethicon	J212H
6-0 Ethilon nylon monofilament  suture, 18", P-3 needle,	Ethicon	1698G
Tegaderm Transparent Film Dressing Frame Style, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half lengthwise