להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Summary

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

Abstract

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Introduction

המטרה הכללית של שיטה זו היא להעריך במדויק ולכמת ב phagocytosis microglial vivo. Microglia הם מקרופאגים תושב רקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). הם לבצע מגוון של פונקציות כדי להבטיח תחזוקה של הומאוסטזיס רקמות. אלה כוללים מעקב חיסוני, הפרשת גורמי neurotrophic ו, בעל חשיבות מרכזית, phagocytosis ^1. Phagocytosis microglial הוא מפתח בכמה אירועים חשובים במהלך ההתפתחות של מוח הרשתית, כגון phagocytosis של סינפסות רלוונטי (גיזום סינפטי) והסרה של נוירונים אפופטוטיים ^2-4. יתר על כן, phagocytosis microglial של נוירונים פגומים או אפופטוטיים, פסולת הסלולר, חיידקים פולשים הוכח להיות חיוני לשמירה על הומאוסטזיס CNS לבגרות ^5. לבסוף, phagocytosis microglial היה מעורב בפתוגנזה של מספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר וגיל הקשורותניוון מקולרי, שם הוצע כי קיבולת phagocytic פגום או לא מספיק עלולים לתרום הצטברות של עמילואיד-β (Aβ) כרזות דרוזן, בהתאמה ^6,7.

פונקצית microglial מוסדרת בחוזקה על ידי microenvironment שלהם, בעיקר על ידי גורמים מסיסים כגון β גורם-צמיחת גידול או תאי תאי אינטראקציות. נוירונים constitutively להביע כמה הליגנדים פני התא, כגון CD200 ו CX3CL1, תוך microglia בלעדי להביע את הקולטנים המתאימים CD200R ו CX3CR1. קולטנים אלה מכילים מוטיבי העיכוב מבוסס טירוזין immunoreceptor (ITIMs) בחלק תאיים שלהם. אלה מעכבים קולטניים הם קריטיים למניעת גירוי היתר של microglia, אשר יכול לתרום neuroinflammation. לכן, בתנאים פיסיולוגיים נורמליים, תאים תאים אינטראקציות בין נוירונים microglia לשמור microglia במצב שקט. במהלך פגיעה ברקמות, לעומת זאת, הנוירונים יכול למטה להסדיר expression של ליגנדים אלה, הסרת ההשפעה המעכבת שלהם על הפעלת שריר כלשהו. פונקצית microglial (כולל phagocytosis) ובכך היא קשורה קשר הדוק microenvironment שלהם ^8. אף על פי כן, עד כה, אין מבחנים סטנדרטיים ללמוד phagocytosis microglia בהקשר פיסיולוגי או באופן מלא משכפל microenvironment שלהן במערכת העצבים המרכזי.

מבחני כמה פותחו כדי למדוד את פעילות phagocytic של microglia במבחנה, שבו microglia ראשוני או שורות תאים microglia מתורבתים עם תאים היעד (למשל, הנוירונים אפופטוטיים) או חרוזים שכותרתו fluorescently. ספיגת יעד נבחנת מכן באמצעות מיקרוסקופ הדמיה ניאון או cytometry זרימה ^9-12. מבחנים אלה מאפשרים בדיקה של כמה מניפולציה תרופתית או גנטית עשויה להשפיע phagocytosis microglial, ובעוד אינפורמטיבי, לא מצליח לשחזר את המורכבות באופן מלא בסביבת vivo. שיטות עקיפות לבחינת phagocytosis microglialin vivo דווח: הם השיגו אלה על ידי מכתים של מולקולות חשבו להיות מעורבים phagocytosis (למשל, CD68), בהערכת קרבה פיזית של המיקרוגליה מטרות עבור phagocytosis (למשל, הנוירונים נפגעים או אלמנטים הסינפטי), או על ידי זיהוי immunohistochemical של phagocytic מטרות בתוך תאי microglial (למשל, Aβ) ^13-17. שני מחקרים השתמשו בגישות ישירות יותר להעריך phagocytosis microglia in vivo. יוז ועמיתיו השתמשו בטכניקות הדמיה כדי למדוד ספיגת microglial של חרוזים שיועברו דרך המסלול תוך גולגולתי ^18. סיירה et al. פיתח שיטה מעודן להעריך microglia phagocytosis של תאים אפופטוטיים כמותית תוך שימוש בטכניקות הדמיה מורכבות ^4. עם זאת, שיטות אלה כרוכים פרוטוקולים מסובכים עבור הכנת רקמה, חתך, הדמיה, וניתוח. השתמשנו בעבר ניתוח תזרים cytometric להעריך phagocytosis של קולטי האור החוצהמגזרים אה באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) התאים בתרבית ^19. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעריך ספיגת במהירות של fluorescently חלקיקים שכותרתו ידי microglia הרשתית כמו מדד כמותי של phagocytosis microglia in vivo.

הפרוטוקול מתואר כאן מאפשר מדידה אמינה וכמותית של phagocytosis microglial רשתית בתוך פחות משש שעות בשלושה שלבים קריטיים: (1) משלוח intravitreal של חלקיקים שכותרתו fluorescently, (2) קציר והכנת רקמת רשתית, ו (3) זרימה ניתוח cytometric. השיטה שפתחנו היא שיטה חזקה כדי להעריך phagocytosis microglial ברשתית, והוא יכול לשמש בהצלחה לבחון כיצד תרכובות שונות או מניפולציה גנטית לשנות את תפקוד microglial מפתח זאת בהגדרות פיסיולוגיות. כתוצאה אזור מיוחד של מערכת העצבים המרכזית, הרשתית היא מערכת מודל נגישים בקלות ללמוד microglia פונקציה ^20. אמנם שיטה זו פותחה ב tהוא עין, אנחנו מאמינים שזה יכול להיות שימושי עבור כל מדעני מוח חוקרת פונקצית phagocytic microglia.

Protocol

כל החיות טופלו בהתאם להנחיות האתיות הוקמו על ידי מכון המחקר סקריפס.

1. הכנת חומרים להזרקה

1. לעקר 33 G מחט מזרק: לפרק חיטוי ב 115 ^ο ג כן מחטים להזרקה על ידי עולה בופר פוספט סטרילית (PBS).
2. להפשיר חלקיקים שכותרתו fluorescently בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות. הכן פתרון החלקיקים להזרקה ידי reconstituting לפתרון 50 מ"ג / מ"ל ב PBS סטרילי עם Ca ^{2 +} / Mg ^2+.
   הערה: AF488 שכותרתו לחלקיקים מן פטרייתי כי אומתו על מבחני phagocytosis משמשים בפרוטוקול זה ^21-23. לספיגה אופטימלית, להכין חלקיקים טריים מיד לפני ההזרקה.
   הערה 2: ריכוזי חלקיקים עשויים להיות מותאמים עבור כל ניסוי ספציפי.

2. הזרקת intravitreal של פתרון חרוז

הערה: שני people נדרש לבצע את הזריקה, בצורה כזאת שהאדם בביצוע ההזרקה יכול להחזיק את העכבר ולשמור את הפוקוס על גלגל העין, בעוד האדם האחר עובר את המזרק הטעון ודוחף את הבוכנה.

1. לטשטש את המכרסם בזריקה intraperitoneal של 100 מ"ג / מ"ל ​​קטמין ו xylazine 10 מ"ג / מ"ל ​​במינון של 20 μl / 10 גרם של משקל גוף. לפני הזריקה, להשתמש קמצוץ הבוהן כדי להעריך את רמת הרדמה.
   הערה: Isoflurane יש השפעה עמוקה על תפקוד התאים מיאלואידית, ובכך, השימוש בו לאורך assay זה יש להימנע ^24,25.
2. מחט טען 0.5 μl של פתרון חלקיקים שכותרתו fluorescently.
3. הנח את העכבר הצידה תחת מיקרוסקופ כירורגי (איור 1A-B). השתמש חומר רך, למשל, חפיסת ג'ל, עבור מיקום טוב יותר של העכבר. עבור עכברים צעירים בה העיניים עדיין לא פתוחות, בעדינות לפתוח את העפעפיים בעזרת 45 בסדר ^o מלקחיים זוויתי ידי יצירת fissuמחדש לאורך החריץ שממנו העפעפיים יהיה בסופו של דבר פתוח.
   1. בעזרת מלקחיים 45 ^o זוויתי בסדר להפעיל לחץ בזהירות סביב העפעף, כך גלגל העין קופצת מעט מתוך השקע. להחזיק את הראש עם שתי אצבעות בדיוק מעל האוזן ועל ידי הלסת שלו בעדינות למתוח את העור במקביל העפעפיים כדי לשמור על העין מעט מתוך השקע. היזהר שלא לתפוס קרוב מדי אל הגרון (איור 1B).
4. כדי לנקב את גלגל העין, הכנס המחט של המזרק ב לימבוס הקרנית (שבו הקרנית בלובן העין להתחבר). זה גלוי כעיגול אפור בעכברים פיגמנט. לחזור בו את המחט מעט לגרש נפח קטן של נוזל זגוגי ואז מזריקים. האדם בביצוע ההזרקה צריך להחזיק את העכבר בעדינות ביד אחת ואת המחט עם אחרים; האדם השני צריך לדחוף את הבוכנה לאט.
5. לחזור בו מזרק לאט. החל עיניים לחות טיפות כדי לשמור על העין hydrated.
6. תנו מכרסם להתאושש בכלוב על כרית חום ולהמשיך לפקח החיה. אם עובד עם גורים, לא להחזיר את בעל החיים לכלוב עם חיות התראה אחרות עד שהוא נושם ומסוגל תנועה ספונטנית. אם עובד עם מבוגרים, לא מחזיר את המכרסם לכלוב עם חיות התראה אחרות, עד שהיא חוזרת recumbence sternal.

3. קציר רקמת הרשתית

הערה: רקמת הרשתית מעיניים לא הזריקו חלקיקים שכותרתו fluorescently יש לאסוף כביקורת על ניתוח תזרים cytometric. למרות assay יכול להתבצע באמצעות רשתית יחידה, עבור ביצועים הטובים ביותר, שתי רשתיות צריכות להיות ונקווה יחד.

1. אסוף hr 3 רקמת הרשתית לאחר ההזרקה intravitreal של חלקיקים שכותרתו fluorescently.
   הערה: בעוד זמן לאחר ההזרקה של הפתרון חלקיק יכול להיות מותאם עבור כל ניסוי ספציפי, מצאנו כי 3 שעות לאחר ההזרקה, ספיגת החלקיקים ניתן היה לראות לאורך רוב שכבות of הרשתית (איור 1 ג-ד).
2. הקורבן עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם.
3. אסוף את העיניים על ידי לחיצה עדינה על העפעף בעזרת מלקחיים בסדר 45 ^o הקטומה proptose גלגל העין. מקם את המלקחיים מאחורי גלגל העין ולמשוך.
4. לנתח את הרשתית תחת מיקרוסקופ לנתח. מעביר את גלגל העין כדי בצלחת פטרי המכילה כמות קטנה של PBS עם Ca ^{2 +} / Mg ^2+. באזור יבש של צלחת פטרי, לחורר את גלגל העין בבית לימבוס הקרני עם קצה המלקחיים איכותיים מאוד.
5. החזק את גלגל העין בעזרת בסדר 45 ^o מלקחיים זוויתי ולהשתמש מספרי האביב לחתוך סביב לימבוס הקרני, עד כמחצית מן ההיקף לימבוס קרנית נחתכה.
6. החזק את גלגל העין עם קנס 45 ^o מלקחיים זוויתי ולהביא את גלגל העין לתוך PBS. עם זוג נוסף של קנס 45 ^o מלקחיים זוויתי לקרוע את הקרנית ואת בלובן העין בנפרד. העדשה ואת הרשתית ייצאה intact.
7. הפרד את העדשה לרשתית. אסוף הרשתית ולהעביר מבחנה קלקר 5.4 מ"ל המכיל 2 מ"ל של PBS עם Ca ^{2 +} / Mg ^2+.

4. הכנת תרחיף תא בודד

1. כן השעיות תא בודדים באמצעות ערכת דיסוציאציה רקמה עצבית עם שינויים קלים בצורה להוראות היצרן. בקצרה, הרשתיות triturate ידי pipetting מעלה ומטה עם טפטפת P1000 וביצוע עיכול אנזימטי ב 37 ^o C בלי לרעוד.

5. השעיות תא בודדות מכתימות עבור ניתוח התזרים Cytometric

1. תאים Resuspend ב 200 μl של חיץ מכתים (פוספט שנאגרו מלוחים של Dulbecco עם אלבומין 0.2% שור (BSA) ו אזיד הנתרן 0.09%) ו ומעבירים לצלחת U-התחתון 96-היטב. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 130 x.
   הערה: אזיד הנתרן הוא מזיק לאדם ולסביבה. השתמש בציוד מגן אישי מתאיםnd להשליך פסולת בהתאם לתקנות המקומיות.
2. הפוך את הצלחת מעל הכיור כדי להשליך supernatant. כדי לחסום קולטני Fc, תאים resuspend ב 25 μl של חיץ כתם המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של נוגדן אנטי עכבר CD16 / CD32 לכל טוב. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הוסף 25 μl של חיץ מכתים המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אנטי עכבר Ly6C-APC-Cy7, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אנטי עכבר Ly6G-PE-Cy7 ו -2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אנטי עכבר CD11b-AF650. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
4. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 130 x. הפוך את הצלחת להשליך supernatant. שטפו ידי resuspending התאים 200 μl של חיץ מכתים.
5. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 130 x. Resuspend ב 200 μl של חיץ כתם המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של יודיד propidium (PI). העברת צינורות microtiter 1.2 מיליליטר.
6. לשטוף בארות עם חיץ 100 μl של מכתים נוסף המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של PI ובריכה עם 200 μl הקודם1.2 מ"ל צינורות microtiter. בהיקף כולל של 300 μl של תאים מוכתמים מתקבל.

6. ניתוח תזרים Cytometric

1. באמצעות ליזר שלוש קונבנציונלי (סגול, כחול, ליזר אדום), להימנע PE, PerCP-Cy5.5, BV510, ו PI צבע בשל זליגה משמעותית מן AF488-חלקיקי ניאון בהירים מאוד. השתמש לייזר הרביעי (צהוב) כדי לייעל assay זה, שכן היא מאפשרת עבור נוגדנים PE שכותרתו PI (בערוץ mCherry במקום ערוץ PerCP-Cy5.5) לשמש (איור 2).
   הערה: אם ליזר צהוב אינו זמין, להשתמש לצבוע הדרת תאים מתה באפיק אחר.
2. שער על PI תאים שליליים (נרדף למלק) להוציא תאים מתים (איור 2 ב).
3. לאחר הוצאת תאים מתים, שער על תאים חיוביים CD11b (CD11b ^+), זה יכלול את כל תאי מיאלואידית (איור 2 ג).
4. בתוך האוכלוסייה ⁺ CD11b, השער על Ly6C ^- / Ly6G ^- למעטנויטרופילים (CD11b ⁺ / Ly6G ⁺⁾ ומונוציטים (CD11b ⁺ / Ly6C ^+; איור 2 ד). לאחר gating על microglia (כאן המוגדרים CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^- לפשטות), שתי אוכלוסיות ברורות צריכות להיות גלויות; אחד שלילי ואחד חיובי עבור החלקיקים שכותרתו fluorescently. תאי Phagocytic יינקטו חלקיקים ולכן הם AF488 ⁺ (איור 2E).
   הערה: Ly6C החיובי או Ly6G אוכלוסיות חיוביות יכולה גם להיות מנותחת למדוד ספיגת חלקיקים באמצעות גישה מכתימה זה. אחוז phagocytic CD11b ⁺ תאים וקושרת היטב עם אחוז microglia phagocytic (איור 2F). לחוקרים ללא ניסיון cytometry זרימה, ניתוח פשוט עם מכתים CD11b לבד יכול להתבצע, אם כי זה יכלול נויטרופילים ומונוציטים phagocytic, כמו גם שריר כלשהו. בתוך זה CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^{- <}/ Sup> אוכלוסייה, תאים אלה הם> microglia 99% כמו להישפט על ידי צביעה עם הסמנים F4 / 80 ו CX3CR1; סמנים אלה ניתן להוסיף אך הן אינן הכרחיות בידינו.

תוצאות

כאן אנו מתארים שיטה במהירות ובאמינות לכמת את מספר microglia רשתית phagocytic בסביבה פיזיולוגית באמצעות ניתוח התזרים cytometric (איור 2). שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות ו / או מניפולציה גנטית על קיבולת phagocytic של microglia (?...

Discussion

ישנם שלושה שלבים קריטיים בשיטה זו: (1) הזרקת intravitreal של חלקיקים שכותרתו fluorescently; (2) קציר והכנת רקמת הרשתית; ו (3) ניתוח תזרים cytometric. אנו ממליצים החוקרים לתרגל זריקות intravitreal קודם לביצוע השיטה שאנו מציגים כאן. עכברים לבקנים (למשל, BALB / ג) ופתרון בצבע (למשל, חלקיקים שכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Nikon	Discontinued
Hamilton syringe, 600 series	Sigma	26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Prepare immediately before injection
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Need two
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-10	Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube	Falcon	352054
96 well U-bottom plate	Falcon	353077
Stain Buffer (BSA)	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 Antibody	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend	128025
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidium Iodide	BD Biosciences	556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101301