망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

요약

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

초록

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

서문

이 방법의 전반적인 목표는 정확하게 평가하고 생체 내 미세 아교 식균 작용에 정량화하는 것입니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 조직 거주자 대식 세포이다. 이들은 조직의 항상성의 유지를 보장하기 위해 다양한 기능을 수행한다. 이러한 면역 감시, 신경 영양 인자의 분비의 중요한 중요성, 식세포 작용 ^{(1)을 포함한다.} 소교 식세포는 관련이없는 시냅스 (시냅스 가지 치기) 및 세포 사멸 뉴런 ^2-4의 제거 식균 작용으로 뇌와 망막의 개발하는 동안 몇 가지 중요한 사건의 열쇠입니다. 또한, 손상 또는 사멸 신경 세포 파편 및 침입 미생물 소교 식세포는 성인 ^1-5 CNS 항상성 유지에 필수적인 것으로 나타났다. 마지막으로, 소교 탐식 알츠하이머 병 및 나이 관련 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 병인에 연루되어있다이 결함이 있거나 불충분 식세포 용량이 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 드루 젠, 각각 ^{6, 7의} 축적에 기여할 수 있음을 제안하고있다 황반변.

소교 함수 단단히 특히 종양 성장 인자 β 또는 세포 간 상호 작용과 같은 가용성 인자에 의해 그 미세 환경에 의해 조절된다. 미세 아교 세포가 독점적으로 각각의 수용체 CD200R 및 CX3CR1을 표현하면서 뉴런은 구조적으로, 이러한 CD200 및 CX3CL1 등 여러 가지 세포 표면 리간드를 표현한다. 이 수용체는 세포 내 부분에 면역 수용체 티로신 기반 금지 모티브 (ITIMs)를 포함한다. 이러한 수용체는 신경 염증에 기여할 수있는 미세 아교 세포의 과도한 자극을 방지하기위한 중요한 억제제. 따라서, 정상적인 생리적 조건 하에서, 뉴런 및 미세 아교 세포 간의 세포 - 세포 상호 작용은 정지 상태에서 미세 아교 세포를 유지한다. 조직 손상 동안, 그러나, 뉴런 EXP을 하향 조절할 수있다이러한 리간드 ression, 미세 아교 세포 활성에 미치는 억제 효과를 제거하는 단계를 포함한다. (식균 작용 포함) 소교 기능 따라서 밀접하게 자신의 미세 환경 ^(8)에 연결되어 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지, 생리 학적 맥락에서 또는 완전히 자신의 CNS의 미세 환경을 복제하는 방식으로 미세 아교 세포의 식세포 작용을 연구하는 표준화 된 시험 법이 없습니다.

여러 분석은 차 미세 아교 또는 소교 세포주 표적 세포 (예를 들면, 신경 세포 사멸) 또는 형광 표지 구슬 배양 시험관에 미세 아교 세포의 탐식 활성을 측정하기 위해 개발되었다. 목표 흡수 후 형광 현미경 영상을 사용하거나 계측법 ^{9-12 흐름} 평가된다. 이러한 분석은 약물이나 유전자 조작이 유익한 동안, 완전히 생체 내 환경에서 복잡한을 복제하는 데 실패, 소교 식균 작용에 영향을 미칠 수있는 방법의 테스트를 할 수 있습니다. 소교 식균 작용을 검사하는 간접 방법생체 내에서보고되었다 : 이들은 미세 아교 세포 및 대상 식균 작용에 대한 (예를 들어, 손상된 신경 세포 나 시냅스 요소)의 물리적 인 근접성을 평가, 식세포 작용 (예를 들어, CD68)에 관여하는 것으로 생각 분자의 염색에 의해 수행, 또는 식세포의 면역 검출로되어있다 소교 세포 내 표적 (예를 들면, Aβ) ^13-17. 두 연구는 생체 내에서 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하기 위해보다 직접적인 방법을 사용했다. 휴즈와 동료들은 두개 내 경로 ^(18)를 통해 전달 구슬의 소교 흡수를 측정하는 이미징 기술을 사용했다. 시에라는 등. 정량적으로 복잡한 이미징 기술 ^4를 사용 사멸 세포의 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하는 세련된 방법을 개발했다. 그러나 이러한 방법은 조직 준비, 절편, 이미징 및 분석을위한 복잡한 프로토콜을 포함한다. 우리는 이전에 알아 감광체의 식균 작용을 평가하기 위해 유세포 분석을 사용한문화 ¹⁹ 망막 색소 상피 (RPE) 세포에 의한 어 세그먼트. 여기서 우리는 신속하게 생체 내 미세 아교 세포의 식균 작용의 정량적 측정으로 망막 미세 아교 세포로의 형광 표지 된 입자 흡수를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다.

형광 표지 된 입자 (1) 체내 전달, (2) 수확 및 망막 조직의 준비, (3) 흐름 : 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 신뢰할 수있는 정량적 세 가지 중요한 단계의 바로 아래 6 시간 망막 미세 아교 식균 작용의 측정이 가능 세포 계측 분석. 우리가 개발 한 방법은 망막 소교 식균 작용을 평가하기위한 강력한 방법이며, 성공적으로 다양한 화합물 또는 유전자 조작 생리 설정이 키 소교 기능을 변경하는 방법을 테스트하기 위해 사용될 수있다. 중추 신경계의 전문 영역으로, 망막 미세 아교 세포 기능 ^(20)을 연구 쉽게 접근 할 수있는 모델 시스템입니다. 이 방법은 t에서 개발되었지만그는 눈에, 우리는 미세 아교 세포의 식세포 기능을 조사하는 모든 신경 과학자에 유용 할 수 있다고 생각합니다.

프로토콜

모든 동물은 스크립스 연구소에 의해 설립 된 윤리 지침에 따라 처리 하였다.

사출 용 재료 1. 준비

1. 33 G 바늘과 주사기를 소독 : C. ^ο 115 분해 및 오토 클레이브 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)의 상승에 의해 주사 바늘을 준비합니다.
2. 10 분 - 5 상온에서 형광 표지 된 입자를 녹여. ^칼슘 / 마그네슘 ^2+와 멸균 PBS에서 50 ㎎ / ㎖ 용액에 재구성하여 주입 입자 용액을 준비합니다.
   참고 : 식균 작용 분석을위한 검증 된 곰팡이 원산지 AF488 표지 입자는이 프로토콜 ^21-23에 사용됩니다. 최적의 흡수를 들어, 신선하고 즉시 주입하기 전에 입자를 준비합니다.
   주 2 : 입자 농도는 각각의 특정 실험을 위해 최적화 될 수있다.

구슬 솔루션 2. 유리체 강내 주입

참고 : 두 페이지eople 방식으로, 주입을 수행하기 위해 요구되도록 다른 사람이로드 된 주사기를 통과하고, 상기 플런저를 가압하는 동안, 마우스를 길게 안구의 초점을 유지할 수있는 주입을 수행하는 사람.

1. 20 μL / 체중 10 g의 투여 량으로 100 ㎎ / ㎖ 케타민 10 ㎎ / ㎖의 자일 라진 복강 내 주사하여 쥐를 마취. 주입 전에 마취의 수준을 평가하기 위해 발가락 핀치를 사용합니다.
   참고 : 아이소 플루 란은 골수 세포 기능에 큰 효과가있다, 따라서,이 분석을 통해 그것의 사용은 ^{24, 25을} 피해야한다.
2. 0.5 μL의 형광 표지 된 입자 용액과로드 바늘.
3. 옆으로 수술 현미경 (그림 1A-B)에서 마우스를 놓습니다. 마우스의 더 나은 위치에 대한 부드러운 소재, 예를 들면, 젤 팩을 사용합니다. 눈이 아직 열려 있지있는 젊은 쥐를 들어, 부드럽게 fissu을 만들어 좋은 45 ^오 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀을 엽니 다이로부터 눈꺼풀 것이다 결국 오픈 슬릿을 따라 다시.
   1. 안구가 소켓에서 약간 튀어 있도록 각도 ^오 (45) 미세 집게의 도움으로 조심스럽게, 눈꺼풀 주위에 압력을 적용합니다. 그냥 귀 위의 두 손가락과 턱으로 머리를 잡고 조심스럽게 소켓에서 약간 눈을 유지하기 위해 눈꺼풀에 병렬로 피부를 스트레칭. 목 (그림 1B)에 너무 가까이 파악하지 않도록주의하십시오.
4. (각막과 공막을 연결하는 지점) 각막 윤부에서 주사기의 바늘을 삽입, 안구 천공합니다. 이 색소 마우스의 회색 원으로 표시됩니다. 유리 체액의 작은 볼륨을 추방하고 주입하기 위해 약간의 바늘을 철회. 부드럽게 한 손으로 다른과 바늘로 마우스를 보유해야 주입을 수행하는 사람; 두 번째 사람은 천천히 플런저를 밀어해야합니다.
5. 천천히 주사기를 철회. 적용을 눈 보습은 수화 눈을 유지하기 위해 삭제합니다.
6. 설치류는 열 패드를 통해 새장에 복구하고 동물을 계속 모니터링 할 수 있습니다. 새끼와 함께 작업을하면, 호흡과 자발적 운동 할 때까지 다른 경고 동물 케이지에 동물을 반환하지 않습니다. 성인과 함께 작업하는 경우가 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지, 다른 경고 동물 케이지에 쥐를 반환하지 않습니다.

망막 조직의 3 수확

주 : 형광 표지 된 입자 주입하지 눈의 망막 조직을 유세포 분석 대조군으로 수집되어야한다. 분석은 단일 망막을 사용하여 수행 될 수 있지만, 최적의 성능을 위해 두 개의 망막 함께 풀링한다.

1. 형광 표지 된 입자의 유리체 강내 주입 후 망막 조직 3 시간을 수집합니다.
   참고 : 입자 용액의 주입 후 시간이 각각의 특정 실험에 최적화 될 수 있지만, 우리는 3 시간 주사 후, 입자의 흡수는 O 대부분의 계층에서 볼 수 있다는 것을 발견망막 (그림 1C-D) 바.
2. 경추 탈구로 쥐를 희생.
3. 부드럽게 안구를 proptose하기 좋은 45 ^오 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀에 눌러 안구를 수집합니다. 안구 및 풀 뒤 집게를 놓습니다.
4. 해부 현미경으로 망막을 해부하다. ^칼슘 / 마그네슘 ²⁺ PBS 소량을 함유하는 페트리 접시에 안구 전송. 페트리 접시의 건조 지역에서 극상 집게의 끝 각막 윤부에서 안구를 관통.
5. 각막 윤부 둘레의 약 절반이 절단 될 때까지, 좋은 45 ^오 각도 집게의 도움으로 안구를 잡고 각막 윤부 주위에 잘라 봄 가위를 사용합니다.
6. 벌금 45 ^오 각도 집게로 안구를 잡고 PBS로 안구를 가져온다. 좋은 45 ^오 각도 집게의 두 번째 쌍으로 떨어져 각막과 공막 눈물. 렌즈와 망막이 나올 나는 것의 ntact.
7. 렌즈와 망막을 분리합니다. 망막 모아서 ^칼슘 / 마그네슘 ²⁺ PBS 2 ㎖을 함유하는 5.4 ml의 폴리스티렌 시험관에 옮긴다.

4. 단일 세포 현탁액을 준비

1. 제조업체의 지침에 약간의 수정과 신경 조직 분리 키트를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 요약하면, 최대 피펫 팅 및 P1000 피펫과 함께 아래로 흔들어없이 37 ^℃로 효소 소화를 수행하여 씹다 망막.

유세포 분석 5. 염색 단일 세포 현탁액

1. 염색 완충액 200 μL에 재현 탁 셀은 U 바닥 96 웰 플레이트 및 전사 (0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 0.09 %의 아 지드 화 나트륨을 가진 둘 베코 인산염 완충 염수). 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
   참고 : 나트륨 아 지드는 인간과 환경에 유해한입니다. 적절한 개인 보호 장비 a를 사용하여차 지역 규정에 따라 폐기물을 폐기합니다.
2. 상층 액을 버리고 싱크대 위에 접시를 반전. 5 ㎍ / 항 - 마우스 CD16 / CD32 항체 ml의 웰 당을 포함하는 얼룩 버퍼의 25 μL로 된 Fc 수용체에 resuspend 세포를 차단합니다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
3. 항 - 마우스 Ly6C-APC-Cy7 0.5 ㎍ / ml의 항 - 마우스 Ly6G-PE-Cy7 0.5 ㎍ / ㎖의 항 - 마우스 CD11b를-AF650의 2.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 25 μl를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
4. 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 상층 액을 버리고 접시를 반전. 염색 버퍼의 200 μl의 세포를 재현 탁하여 씻으십시오.
5. 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 요오드화 프로피 듐 (PI), 0.5 ㎍ / ml를 함유 염색 완충액 200 μL에 재현 탁. 1.2 ml의 마이크로 타이 튜브에 전송합니다.
6. 의 이전 200 μL와 PI 및 수영장 0.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 추가 100 μL와 우물을 씻으십시오1.2 ml의 마이크로 타이 튜브. 염색 된 세포 300 μl의 총 부피를 얻을 수있다.

6. 유세포 분석

1. 기존의 세 가지 레이저 (보라색, 파란색과 빨간색 레이저)를 사용하여, PE,를 PerCP-Cy5.5, BV510, 그리고 매우 밝은 형광 AF488 입자에서 상당한 파급에 의한 PI 염료을 피하십시오. 그것은 (대신를 PerCP-Cy5.5 채널의 mCherry 채널)은 PE 표지 항체 및 PI 수 있습니다로 (그림 2)를 사용,이 분석을 최적화하기 위해 네 번째 (노란색) 레이저를 사용합니다.
   참고 : 옐로우 레이저를 사용할 수없는 경우, 다른 채널에서 죽은 세포 제외 염료를 사용합니다.
2. PI 부정적인 세포 (PI-)에 게이트 죽은 세포 (그림 2B)를 제외합니다.
3. 죽은 세포, CD11b를 양성 세포 (CD11b를 ^+)에 게이트를 제외하면이 모든 골수 세포 (그림 2C)를 포함한다.
4. Ly6C에 CD11b를 ^{+ 인구,} 게이트 내 ^- / Ly6G는 ^- 제외 할호중구 (CD11b를 ⁺ / Ly6G ^+)와 단핵구 (CD11b를 ⁺ / Ly6C ^+도 2D). 미세 아교 세포 ^(- / Ly6G ^- 여기 CD11b를 ⁺ / Ly6C로 정의 단순화를 위해)에 게이팅 후,이 명확 인구가 볼 수 있어야합니다; 음 하나는 형광 표지 된 입자 긍정적. 식세포 입자를 촬영 한 것입니다 AF488 ⁺ (그림 2E)는 그러므로 있습니다.
   주 : 양수 또는 Ly6C Ly6G 양성 집단의이 염색 방법을 사용하여 입자의 흡수를 측정하기 위하여 분석 될 수있다. 식세포는 CD11b ⁺ 세포의 비율은 식세포 미세 아교 세포의 비율 (그림 2 층)과 잘 상관 관계. 이 균성 호중구 및 단핵 세포뿐만 아니라, 미세 아교 세포를 포함 불구 유세포 경험이없는 연구자 단독는 CD11b 염색과 간단한 분석이 수행 될 수있다. / Ly6G ^{- -이} CD11b를 ⁺ / Ly6C 내 ^</ SUP> 인구, 마커 F4 / 80과 CX3CR1 염색에 의해 판단 이러한 세포가> 99 % 미세 아교 세포이다; 이러한 마커를 추가하지만 우리의 손에 필요하지 않습니다 수 있습니다.

결과

다음은 신속하고 확실하게 유세포 분석을 (도 2)를 이용하여 생리 환경에서 포식성 망막 미세 아교 세포의 수를 정량하는 방법을 설명한다.이 방법의 탐식 능력의 화합물 및 / 또는 유전자 조작의 효과를 테스트하기 위해 적용될 수있다 미세 아교 세포 (도 3A, 3B). (- 이십일 생후 10) 또는 성체 마우스 (도 3c) 또한 젊은 사용될 수?...

토론

이 방법의 세 가지 중요한 단계가 있습니다 형광 표지 된 입자 (1) 유리체 강내 주입; (2) 수확 망막 조직의 제조; (3) 세포 계측 분석을 흐른다. 우리는 연구자들이 우리가 여기서 제시하는 방법을 수행하기 전에 유리체 강내 주사를 연습하는 것이 좋습니다. 알비노 마우스 (예를 BALB / c) 및 착색 된 용액 (예를 들어, 형광 표지 된 입자) 바늘로 쉽게 시각화 주사 용액에 사용될 수있다. 유...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Nikon	Discontinued
Hamilton syringe, 600 series	Sigma	26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Prepare immediately before injection
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Need two
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-10	Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube	Falcon	352054
96 well U-bottom plate	Falcon	353077
Stain Buffer (BSA)	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 Antibody	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend	128025
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidium Iodide	BD Biosciences	556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101301