Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Resumo

fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

Resumo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Introdução

O objetivo geral deste método consiste em avaliar com precisão e quantificar na fagocitose microglial vivo. Microglia são os macrófagos residentes de tecido do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham uma variedade de funções para assegurar a manutenção da homeostase dos tecidos. Estes incluem a vigilância imunológica, a secreção de fatores neurotróficos e, de importância fundamental, fagocitose ^1. Fagocitose microglial é fundamental em diversos eventos importantes durante o desenvolvimento do cérebro e da retina, tais como fagocitose de sinapses irrelevantes (poda sináptica) e remoção dos neurónios apoptóticas ^2-4. Além disso, a fagocitose da microglia de neurónios danificados ou apoptóticas, detritos celulares, e os micróbios invasores foi demonstrado ser essencial para a manutenção da homeostase do SNC através da idade adulta ^5. Finalmente, a fagocitose da microglia tem sido implicada na patogénese de várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer e Age-Relateddegeneração macular, onde tem sido sugerido que a capacidade fagocítica defeituoso ou insuficiente, podem contribuir para a acumulação de amilóide-p placas e drusas (Ap), respectivamente ^6,7.

função da microglia é fortemente regulada por seu microambiente, nomeadamente por factores solúveis, tais como o factor de crescimento tumoral-β ou interacções célula-célula. Os neurónios expressam constitutivamente vários ligandos da superfície celular, tais como CD200 e CX3CL1, enquanto microglia expressam exclusivamente os respectivos receptores CD200R e CX3CR1. Esses receptores contêm imunor motivos de inibição baseada em tirosina (ITIMs) em sua porção intracelular. Estes receptores são críticos inibidor para prevenir a sobre-estimulação da microglia, que pode contribuir para neuroinflama�o. Deste modo, sob condições fisiológicas normais, a interacções célula-célula entre neurónios e microglia microglia manter num estado de repouso. Durante lesão tecidual, no entanto, os neurônios podem infra-regular expression destes ligandos, removendo o seu efeito inibidor na activação da microglia. Função da microglia (incluindo fagocitose) é, portanto, fortemente ligado ao seu microambiente ^8. No entanto, até à data, não existem testes padronizados para estudar a fagocitose da microglia num contexto fisiológico ou de uma maneira que replica totalmente o seu microambiente do SNC.

Vários ensaios foram desenvolvidos para medir a actividade fagocítica de microglia in vitro, em que a microglia primárias ou linhas de células da microglia foram cultivadas com células alvo (por exemplo, neurónios apoptóticos) ou esferas marcadas com fluorescência. Captação alvo é então avaliada por microscopia de imagem fluorescente ou citometria de fluxo ^9-12. Estes ensaios permitir o teste de como a manipulação genética ou farmacológica pode afectar a fagocitose da microglia e, ao mesmo tempo informativo, não conseguem replicar completamente o complexo no ambiente in vivo. Métodos indiretos para examinar a fagocitose microglialin vivo foram relatados: estes são realizadas através de coloração de moléculas que se pensa estarem envolvidos na fagocitose (por exemplo, CD68), avaliando a proximidade física da microglia e alvos para a fagocitose (por exemplo, neurónios comprometidos ou elementos sináptica), ou por detecção imuno-histoquímica de fagocítica alvos dentro das células microgliais (por exemplo, Ap) ^13-17. Dois estudos usaram abordagens mais diretas para avaliar microglia fagocitose in vivo. Hughes e seus colegas usaram técnicas de imagem para medir o aporte de microglial de contas entregues por via intracraniana ^18. Sierra et ai. Desenvolveram um método aperfeiçoado para avaliar quantitativamente a fagocitose da microglia de células apoptóticas, utilizando técnicas de imagem complexas ^4. No entanto, estes métodos envolvem protocolos complicados para a preparação do tecido, corte, de imagem e análise. Temos anteriormente utilizada a análise de citometria de fluxo para avaliar a fagocitose de fotorreceptor para forasegmentos de er por células da retina epitélio pigmentado (RPE) em cultura ^19. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a absorção rápida de marcação fluorescente partículas por microglia da retina como uma medida quantitativa da in vivo microglia fagocitose.

O protocolo aqui descrito permite a medição fiável e quantitativa da fagocitose da microglia da retina em pouco menos de seis horas em três passos críticos: (1) a entrega intravítrea de partículas marcado por fluorescência, (2) da colheita e da preparação de tecido retiniano, e (3) o fluxo A análise de citometria. O método que desenvolvemos é um método robusto para avaliar a fagocitose da microglia na retina, e pode ser utilizado com sucesso para testar como vários compostos ou manipulação genética alterar esta função chave na microglia configurações fisiológicas. Como uma área especializada do sistema nervoso central, a retina é um sistema modelo facilmente acessível para estudar a função microglia ^20. Enquanto este método foi desenvolvido no tele olho, acreditamos que ele pode ser útil para todos os neurocientistas que investigam função microglia fagocítica.

Protocolo

Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Instituto de Pesquisa Scripps.

1. Preparação de materiais para Injection

1. Esterilizar uma agulha de 33 G e seringa: desmontar e autoclave a 115 ^ο C. Prepare agulhas para injecção pelo aumento em fosfato salino estéril (PBS).
2. Descongelar partículas marcadas por fluorescência à temperatura ambiente durante 5 - 10 min. Preparar a solução de partículas para injecção através da reconstituição de uma solução a 50 mg / ml em PBS estéril com Ca ²⁺ / Mg ^2+.
   NOTA: partículas AF488-rotulados de origem fúngica que foram validados por ensaios de fagocitose são utilizados neste protocolo ^21-23. Para a absorção óptima, preparar partículas fresco e imediatamente antes da injeção.
   Nota 2: As concentrações de partículas pode ser optimizado para cada experiência específica.

2. A injeção intravítrea de Solução Bead

NOTA: Dois pessoas são necessários para realizar a injecção, de uma maneira tal que a pessoa que executa a injecção pode conter o rato e manter o foco sobre o globo ocular, enquanto a outra pessoa passa a seringa carregada e empurra o êmbolo.

1. Anestesiar a roedores por injecção intraperitoneal de 100 mg / ml de cetamina e 10 mg / ml de xilazina na dose de 20 mL / 10 g de peso corporal. Antes da injecção, utilize toe pitada para avaliar o nível de anestesia.
   NOTA: O isoflurano tem um profundo efeito sobre a função de células mielóides, assim, a sua utilização ao longo deste ensaio devem ser evitados ^24,25.
2. Carga agulha com 0,5 ul de solução de partículas marcado por fluorescência.
3. Coloque o mouse de lado sob um microscópio cirúrgico (Figura 1A-B). Usar um material macio, por exemplo, um pacote de gel, para um melhor posicionamento do rato. Para ratos jovens em que os olhos ainda não estão abertas, abrir suavemente as pálpebras com a ajuda de finos 45 ^o forceps ângulos, criando um fissure ao longo da fenda de onde as pálpebras acabará aberto.
   1. Com a ajuda de uma pinça fina 45 ^o ângulo cuidadosamente aplicar pressão em torno da pálpebra, para que o globo ocular aparece ligeiramente para fora do soquete. Segure a cabeça com dois dedos logo acima da orelha e pela sua mandíbula e delicadamente esticar a pele em paralelo com as pálpebras para manter o olho ligeiramente para fora do soquete. Tenha cuidado para não entender muito perto da garganta (Figura 1B).
4. Para perfurar o globo ocular, inserir a agulha da seringa no limbo da córnea (onde a córnea e esclera conectar). Isto é visível como um círculo cinzento em ratos pigmentados. Retrair a agulha ligeiramente para expulsar um pequeno volume de fluido vítreo e depois injectar. A pessoa que executa a injecção deve gentilmente segure o mouse com uma mão e a agulha com a outra; a segunda pessoa deve lentamente empurre o êmbolo.
5. Retrair a seringa lentamente. hidratante aplicar colírio para manter o olho hidratado.
6. Deixe o roedor se recuperar em uma jaula sobre uma almofada de calor e continuar a monitorar o animal. Se trabalhar com filhotes, não devolver o animal para uma gaiola com outros animais de alerta até que seja respiração e capazes de movimento espontâneo. Se trabalhar com adultos, não devolva o roedor a uma gaiola com outros animais de alerta até que ele recupere decúbito esternal.

3. Colheita de tecido da retina

NOTA: tecido da retina dos olhos não injetadas com partículas fluorescente etiquetado deve ser coletado como um controle para análise de citometria de fluxo. Embora o ensaio pode ser realizado utilizando um único retina, para melhor desempenho, duas retinas devem ser reunidas em conjunto.

1. Recolha de tecido da retina de 3 horas após a injecção intravítrea de partículas marcadas com fluorescência.
   NOTA: Enquanto o tempo após a injecção da solução de partículas pode ser optimizada para cada experiência específica, verificou-se que três horas após a injecção, a absorção da partícula poderia ser visto ao longo maioria das camadas óf a retina (Figura 1C-D).
2. Sacrificar os ratos por deslocamento cervical.
3. Recolher os globos oculares pressionando suavemente contra a pálpebra com a ajuda de 45 ^o forceps angulares finos para proptose do globo ocular. Posicionar a pinça por trás do globo ocular e puxar.
4. Dissecar a retina sob um microscópio de dissecação. Transferir o globo ocular para uma placa de Petri contendo uma pequena quantidade de PBS com Ca ²⁺ / Mg ^2+. Em uma área seca da placa de Petri, perfurar o globo ocular no limbo da córnea com a ponta da pinça superfina.
5. Segurar o globo ocular com o auxílio de uma pinça fina 45 ^o ângulo e utilize uma tesoura para cortar mola em torno do limbo da córnea, até cerca de metade da circunferência do limbo da córnea é cortado.
6. Segure o globo ocular com as finas 45 ^o forceps angulares e trazer o globo ocular em PBS. Com um segundo par de fórceps finos 45 ^o rasgo angular da córnea e esclera separados. A lente e retina vai sair intact.
7. Separe a lente e retina. Recolhe-se o retina e transferir para um tubo de ensaio de 5,4 ml de poliestireno contendo 2 mL de PBS com Ca ²⁺ / Mg ^2+.

4. Preparar uma suspensão única célula

1. Preparar suspensões de células individuais utilizando um kit de dissociação de tecido neuronal com pequenas modificações com as instruções do fabricante. Resumidamente, retinas Triturar por pipetagem cima e para baixo com uma pipeta P1000 e realizar uma digestão enzimática a 37 ^° C sem agitação.

5. suspensões de células individuais de coloração para Análise de Citometria de Fluxo

1. Ressuspender as células em 200 ul de tampão de coloração (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com albumina de soro bovino 0,2% (BSA) e 0,09% de azida de sódio) e transferência para uma placa com fundo em U de 96 poços. Centrifugar durante 5 minutos a 130 x g.
   NOTA: A azida de sódio é prejudicial aos seres humanos e ao meio ambiente. Uso adequado de protecção pessoal equipamentos dend descartar os resíduos de acordo com os regulamentos locais.
2. Inverter a placa sobre uma pia para descartar sobrenadante. Para bloquear os receptores Fc, ressuspender as células em 25 ul de tampão de coloração contendo 5 ug / ml de anticorpo anti-ratinho de CD16 / CD32 por poço. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
3. Adicionar 25 ul de tampão de coloração contendo 0,5 ug / ml de anti-ratinho de Ly6C-APC-Cy7, 0,5 ug / ml de anti-rato Ly6G-Pe-Cy7 e 2,5 ug / ml de anti-rato-CD11b AF650. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
4. Centrifugar durante 5 minutos a 130 x g. Inverta a placa para descartar o sobrenadante. Lavar as células por ressuspensão em 200 ul de tampão de coloração.
5. Centrifugar durante 5 minutos a 130 x g. Ressuspender em 200 ul de tampão de coloração contendo 0,5 ug / ml de iodeto de propídio (PI). Transferir 1,2 ml para tubos de microtitulação.
6. Lavar os poços com um adicional de 100 ul de tampão de coloração contendo 0,5 ug / ml de PI e piscina com as anteriores em 200 ul do1,2 ml de tubos de microtitulação. Obtém-se um volume total de 300 ul de células coradas.

6. análise citométrica de fluxo

1. Usando um laser convencional de três (violeta, azul e laser vermelho), evitar o PE, PerCP-Cy5.5, BV510 e corantes PI devido ao transbordamento significativo dos AF488-partículas fluorescentes extremamente brilhantes. Utilize uma quarta laser (amarelo) para optimizar este ensaio, uma vez que permite um PI e anticorpos marcados com PE (no canal mCherry em vez do canal PerCP-Cy5.5) a ser usado (Figura 2).
   NOTA: Se um laser amarelo não estiver disponível, use um corante de exclusão de células mortas em outro canal.
2. Portão em células negativas para PI (PI-) para excluir as células mortas (Figura 2B).
3. Depois de excluir as células mortas, porta de células positivas CD11b (CD11b ^+), isso vai incluir todas as células mielóides (Figura 2C).
4. Dentro da população CD11b ^+, portão Ly6C ^- / Ly6G ^- para excluirneutrófilos (CD11b ⁺ / ⁺ Ly6G) e monócitos (CD11b ⁺ / ⁺ Ly6C; Figura 2D). Depois de gating em microglia (aqui definido como CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^- para simplificar), duas populações claras deve ser visível; uma negativa e uma positiva para as partículas marcadas com fluorescência. As células fagocíticas terá tomado as partículas e, portanto, AF488 ⁺ (Figura 2E).
   NOTA: populações Ly6C positivo ou Ly6G positivos podem também ser analisados ​​para medir a absorção de partículas usando esta abordagem coloração. A percentagem de células fagocíticas CD11b ⁺ correlaciona-se bem com a percentagem de microglia fagocítica (Figura 2F). Para os investigadores sem experiência de citometria de fluxo, uma análise mais simples apenas com CD11b de coloração pode ser realizado, embora este incluirá neutrófilos e monócitos fagocíticas, bem como microglia. Dentro deste CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^{- <}/ Sup> população, estas células são> 99% da microglia, como avaliado por coloração com os marcadores de F4 / 80 e CX3CR1; estes marcadores podem ser adicionados, mas não são necessárias nas nossas mãos.

Resultados

Descrevemos aqui um método para rapidamente e de forma fiável quantificar o número de microglia da retina fagocíticas num ambiente fisiológico utilizando análise de citometria de fluxo (Figura 2). Este método pode ser adaptado para testar o efeito dos compostos e / ou manipulação genética sobre a capacidade fagocítica de microglia (Figuras 3A, 3B). Ele também pode ser usado em jovens (10 - 20 dias pós-parto) ou ratinhos adultos

Discussão

Existem três passos críticos neste método: (1) injecção intravítrea de partículas marcado por fluorescência; (2) a colheita e preparação do tecido da retina; e (3) análise de citometria de fluxo. Recomendamos que os pesquisadores praticar injeções intravítreas antes de realizar o método que aqui apresentamos. Murganhos albinos (por exemplo, murganhos BALB / C) e uma solução de cor (por exemplo, partículas marcadas por fluorescência) pode ser utilizado para facilitar a visualização ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Nikon	Discontinued
Hamilton syringe, 600 series	Sigma	26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Prepare immediately before injection
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Need two
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-10	Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube	Falcon	352054
96 well U-bottom plate	Falcon	353077
Stain Buffer (BSA)	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 Antibody	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend	128025
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidium Iodide	BD Biosciences	556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101301