Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Zusammenfassung

Mikroglia Phagozytose ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebe und unzureichende phagozytischen Funktion hat in der Pathologie in Verbindung gebracht. Allerdings ist die Bewertung Mikroglia - Funktion in vivo technisch anspruchsvoll . Wir haben eine einfache, aber robuste Technik für die präzise Überwachung entwickelt und die phagozytische Potenzial von Mikroglia in einer physiologischen Umgebung zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es , genau zu beurteilen und in vivo Mikroglia Phagozytose zu quantifizieren. Mikroglia werden die Gewebe Makrophagen des zentralen Nervensystems (ZNS). Sie führen eine Vielzahl von Funktionen, die Wartung von Gewebshomöostase zu gewährleisten. Dazu gehören Immunüberwachung, Sekretion von neurotrophen Faktoren und von zentraler Bedeutung, Phagozytose ^1. Mikroglia Phagozytose ist der Schlüssel in mehrere wichtige Ereignisse während der Entwicklung des Gehirns und der Netzhaut, wie Phagozytose irrelevanter Synapsen (synaptic pruning) und Entfernung von apoptotischen Neuronen ^2-4. Weiterhin wurde für die Aufrechterhaltung der Homöostase CNS durch Erwachsenenalter ⁵ wesentlich zu sein Mikroglia Phagozytose von beschädigten oder apoptotischen Neuronen, Zelltrümmer und eindringenden Mikroben gezeigt. Schließlich hat Mikroglia Phagozytose in der Pathogenese von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, einschließlich Alzheimer-Krankheit und altersbedingteMakula - Degeneration, wo es wurde vermutet , dass defekte oder unzureichende Phagozytosekapazität zum Aufbau von Amyloid-β (Aß) Plaques und Drusen, die jeweils ^6,7 beitragen können.

Mikroglia-Funktion wird fest durch ihre Mikroumgebung geregelt, insbesondere durch lösliche Faktoren wie Tumor-Wachstumsfaktor-β oder Zell-Zell-Interaktionen. Neuronen exprimieren konstitutiv mehrere Zelloberflächenliganden, wie beispielsweise CD200 und CX3CL1, während Mikroglia ausschließlich die jeweiligen Rezeptoren CD200R und CX3CR1 exprimieren. Diese Rezeptoren enthalten immunoreceptor Tyrosin-basierte Hemmung Motive (ITIMs) in ihrem intrazellulären Teil. Dieser Inhibitor Rezeptoren sind wichtig zur Verhinderung der Überstimulation der Mikroglia, die neuroinflammation beitragen kann. Somit wird unter normalen physiologischen Bedingungen, Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Mikroglia halten Mikroglia in einem Ruhezustand. Bei Gewebeverletzungen kann jedoch Neuronen regulieren unten expression dieser Liganden, ihre hemmende Wirkung auf die Mikroglia-Aktivierung zu entfernen. Mikroglia - Funktion (einschließlich Phagozytose) wird so fest an ihrer Mikro - ⁸ verbunden. Dennoch Bis heute gibt es keine standardisierten Assays Mikroglia Phagozytose in einem physiologischen Kontext oder in einer Weise zu studieren, die vollständig ihre ZNS-Mikroumgebung repliziert.

Phagozytische Aktivität von Mikroglia in vitro zu messen entwickelt, bei denen primäre Mikroglia oder Mikroglia - Zelllinien kultiviert werden , mit den Zielzellen (zB apoptotischen Neuronen) oder fluoreszenzmarkierte Kügelchen mehrere Assays wurden. Zielaufnahme wird dann Fluoreszenz - Imaging - Mikroskopie oder Durchflusszytometrie ^9-12 beurteilt werden. Diese Tests ermöglichen Tests, wie pharmakologische oder genetische Manipulation Mikroglia Phagozytose beeinflussen können , und während informativ, nicht in vollem Umfang den Komplex in vivo - Umgebung replizieren. Indirekte Methoden zur Prüfung von Mikroglia Phagozytosein vivo berichtet worden: diese durch Anfärben von Molekülen erreicht werden gedacht , um in Phagocytose beteiligt sein (beispielsweise CD68), die physische Nähe der Mikroglia und Ziele für die Phagozytose (zB kompromittiert Neuronen oder synaptische Elemente) Beurteilung oder durch immunhistochemischen Nachweis von phagozytischen Ziele innerhalb von Mikroglia - Zellen (zB Aß) ^13-17. Zwei Studien haben mehr direkte Ansätze verwendet , um Mikroglia Phagozytose in vivo zu beurteilen. Hughes und Kollegen haben Bildgebungstechniken verwendet Mikroglia Aufnahme von Perlen über die intrakranielle Route ¹⁸ geliefert zu messen. Sierra et al. Entwickelten eine verfeinerte Methode zur quantitativen Mikroglia Phagozytose von apoptotischen Zellen unter Verwendung komplexer Bildgebungstechniken ⁴ bewerten. Jedoch umfassen diese Verfahren komplizierter Protokolle zur Gewebevorbereitung, Sektionieren, Bildgebung und Analyse. Wir haben zuvor die durchflusszytometrische Analyse verwendet Phagozytose von Photorezeptor zur Bewertung auser Segmente von retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen in Kultur ^19. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Beurteilung Aufnahme von fluoreszent markierten Partikel durch retinalen Mikroglia als quantitatives Maß für die in vivo Mikroglia Phagozytose.

Das Protokoll, die wir hier beschreiben, ermöglicht eine zuverlässige und quantitative Messung der retinalen Mikroglia Phagozytose in knapp 6 Stunden in drei kritischen Schritten: (1) intravitreal Lieferung von fluoreszenzmarkierten Teilchen, (2) Ernte und Aufbereitung von Netzhautgewebe, und (3) Strömungs Zytometrie Analyse. Die Methode, die wir entwickelt haben, ist eine robuste Methode Mikroglia Phagozytose in der Retina zu bewerten, und es kann erfolgreich getestet werden, wie verschiedene Verbindungen oder genetische Manipulation dieser Taste Mikroglia-Funktion in physiologischen Einstellungen ändern. Als spezialisierter Bereich des ZNS, ist die Netzhaut ein leicht zugängliches Modellsystem Mikroglia - Funktion ²⁰ zu studieren. Während diese Methode wurde in t entwickeltener Auge, glauben wir, es kann für alle Neurowissenschaftler untersuchen Mikroglia phagozytischen Funktion nützlich sein.

Protokoll

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Leitlinien, die vom Scripps Research Institute behandelt.

1. Herstellung von Materialien für die Injektion

1. Sterilisieren eine 33 G - Nadel und Spritze: zerlegen und Autoklaven bei 115 ^ο C Bereiten Nadeln zur Injektion von in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung steigt (PBS).
2. 10 min - fluoreszierend markierten Teilchen bei Raumtemperatur für 5 aufzutauen. Bereiten Partikelinjektionslösung durch zu einer 50 mg / ml Lösung in sterilem PBS mit Ca ²⁺ Rekonstituieren / Mg ^2+.
   HINWEIS: AF488 markierte Partikel pilzlicher Herkunft , die ^21-23 in diesem Protokoll verwendet werden für die Phagozytose - Assays validiert wurden. Für eine optimale Aufnahme bereiten Partikel frisch und unmittelbar vor der Injektion.
   Anmerkung 2: Partikelkonzentrationen können für jeden spezifischen Experiment optimiert werden.

2. intravitreale Injektion von Bead-Lösung

HINWEIS: Zwei penschen sind erforderlich, um die Injektion durchzuführen, in einer Art und Weise, so dass die Person, die die Injektion durchführen können mit der Maus festhalten und den Fokus auf den Augapfel halten, während die andere Person die geladene Spritze geht und schiebt den Kolben.

1. Anästhesieren das Nagetier durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / ml Ketamin und 10 mg / ml Xylazin in einer Dosis von 20 & mgr; l / 10 g Körpergewicht. Vor der Injektion verwenden Zehe Prise Niveau der Anästhesie zu beurteilen.
   HINWEIS: Isofluran hat einen profunden Effekt auf myeloischen Zellfunktion, damit seine Verwendung in diesem Test sollte ^24,25 vermieden werden.
2. Last Nadel mit 0,5 ul fluoreszenzmarkierten Partikellösung.
3. Legen Sie die Maus seitlich unter einem Operationsmikroskop (1A-B). Verwenden Sie ein weiches Material, zum Beispiel ein Gel Packung, für eine bessere Positionierung der Maus. Für junge Mäuse , in denen die Augen sind noch nicht geöffnet ist , öffnen Sie vorsichtig die Augenlider mit Hilfe von feinen 45 ^o abgewinkelte Zange durch eine fissu Schaffungentlang des Schlitzes wieder aus dem die Augenlider wird schließlich geöffnet.
   1. Mit Hilfe von feinen 45 ^o abgewinkelte Zange gelten vorsichtig Druck um das Augenlid, so dass der Augapfel leicht aus dem Sockel löst. Halten Sie den Kopf mit zwei Fingern direkt über dem Ohr und durch seine Kiefer und sanft dehnen die Haut parallel zu den Lidern das Auge zu halten etwas aus der Steckdose. Seien Sie vorsichtig , nicht zu nahe zu erfassen , um den Hals (1B).
4. Um den Augapfel durchstechen, legen Sie die Nadel der Spritze in den Hornhautrand (wo die Hornhaut und Lederhaut verbinden). Dies ist sichtbar als grauer Kreis in pigmentierten Mäusen. Ziehen Sie die Nadel leicht ein kleines Volumen von Glaskörperflüssigkeit zu vertreiben und dann zu injizieren. Die Person, die die Injektion durchführen, sollten Sie vorsichtig die Maus mit einer Hand und die Nadel mit dem anderen halten; die zweite Person sollte den Kolben langsam schieben.
5. Ziehen Sie die Spritze langsam. Bewerben Auge Feuchtigkeitstropfen das Auge mit Feuchtigkeit versorgt.
6. Lassen Sie das Nagetier in einem Käfig über ein Heizkissen erholen und weiterhin das Tier zu überwachen. Wenn mit Welpen arbeiten, nicht zurück, das Tier zu einem Käfig mit anderen Alarm Tiere, bis sie atmet und in der Lage spontane Bewegung. Wenn die Arbeit mit Erwachsenen, nicht zurück das Nagetier auf einen Käfig mit anderen Alarm Tiere, bis sie sternal recumbence gewinnt.

3. Ernten von Netzhautgewebe

HINWEIS: Retinal Gewebe von Augen nicht mit fluoreszenzmarkierten Partikel injiziert sollte als Kontrolle für die durchflusszytometrische Analyse gesammelt werden. Obwohl der Test eine einzige Netzhaut unter Verwendung durchgeführt werden kann, für die beste Leistung, zwei Netzhäuten sollten zusammengeführt werden.

1. Sammeln Netzhautgewebe 3 h nach der intravitrealen Injektion von fluoreszent markierten Partikel.
   HINWEIS: Während der Zeit nach dem Einspritzen der Partikellösung kann für jeden spezifischen Experiment optimiert werden, haben wir festgestellt, daß 3 Stunden nach der Injektion Partikelaufnahme in den meisten Schichten gesehen werden konnte of der Retina (1C-D).
2. Opfern Mäuse durch zervikale Dislokation.
3. Sammeln Sie die Augäpfel durch leichtes Drücken gegen das Augenlid mit Hilfe von feinen 45 ^o abgewinkelte Zange den Augapfel zu proptose. Positionieren Sie die Zange hinter dem Augapfel und ziehen.
4. Präparieren Sie die Netzhaut unter einem Binokular. Übertragung der Augapfel in eine Petrischale eine kleine Menge an PBS mit Ca ²⁺ / Mg ²⁺ enthält. In einem trockenen Bereich der Petrischale, perforieren den Augapfel in der Hornhautrand mit der Spitze des superfeinen Zange.
5. Halten Sie den Augapfel mit Hilfe von feinen 45 ^o abgewinkelt Pinzette und verwenden Feder Schere um den Hornhautrand zu schneiden, bis etwa die Hälfte der Hornhautrand Umfang geschnitten wird.
6. Halten Sie den Augapfel mit den feinen 45 ^o abgewinkelte Pinzette und bringen den Augapfel in PBS. Mit einem zweiten Paar von feinen 45 ^o abgewinkelte Zange reißen die Hornhaut und Lederhaut auseinander. Die Linse und der Netzhaut kommt heraus iNTACT.
7. Trennen Sie die Linse und Netzhaut. Sammeln Sie die Netzhaut und in ein 5,4 ml Polystyrol - Teströhrchen mit 2 ml PBS mit Ca ²⁺ / Mg ^2+.

4. Vorbereiten einer Einzelzellsuspension

1. Bereiten Einzelzellsuspensionen ein neuronales Gewebe Dissoziation Kit mit geringfügigen Modifikationen an den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Kurz gesagt, triturate Retinae durch Auf- und Abpipettieren mit einer P1000 Pipette und eine enzymatische Verdauung bei 37 ^° C durchzuführen , ohne Schütteln.

5. Die Färbung Einzelzellsuspensionen für Analyse über Durchflusszytometrie

1. Die Zellen in 200 & mgr; l Färbepuffer (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,09% Natriumazid) und in einen U-Boden-Platte mit 96 Vertiefungen. Zentrifuge für 5 Minuten bei 130 x g.
   HINWEIS: Natriumazid ist schädlich für den Menschen und die Umwelt. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung einnd entsorgen Abfall entsprechend den örtlichen Vorschriften.
2. Kehren Sie die Platte über ein Waschbecken Überstand zu verwerfen. So blockieren Fc-Rezeptoren, resuspendieren Zellen in 25 ul Fleck-Puffer mit 5 ug / ml anti-Maus-CD16 / CD32 Antikörper pro Vertiefung. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Zugeben von 25 & mgr; l Färbepuffer mit 0,5 ug / ml Anti-Maus Ly6C-APC-Cy7, 0,5 ug / ml Anti-Maus Ly6G-Pe-Cy7 und 2,5 ug / ml Anti-Maus-CD11b-AF650. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
4. Zentrifuge für 5 Minuten bei 130 x g. Die Platte umdrehen Überstand zu verwerfen. Waschen von Zellen in 200 & mgr; l Färbepuffer resuspendiert.
5. Zentrifuge für 5 Minuten bei 130 x g. Resuspendieren in 200 ul Puffer, enthaltend 0,5 stain & mgr; g / ml Propidiumiodid (PI). Übertragen auf 1,2 ml Mikrotiter Röhren.
6. Waschen Vertiefungen mit weiteren 100 & mgr; l Färbepuffer mit 0,5 & mgr; g / ml PI und Pool mit den vorhergehenden 200 & mgr; l in der1,2 ml Mikrotiterplatte Röhren. Ein Gesamtvolumen von 300 & mgr; l von gefärbten Zellen erhalten wird.

6. Analyse über Durchflusszytometrie

1. Unter Verwendung eines herkömmlichen Drei-Laser (violett, blau und rot-Laser), vermeiden PE, PerCP-Cy5.5, BV510 und PI Farbstoffe aufgrund signifikanter Spill-over von den extrem hell fluoreszierende AF488-Teilchen. Verwenden eines vierten (gelb) Laser dieses Assays zu optimieren, wie es für ein PE-markierter Antikörper und PI (in dem Kanal mCherry anstelle des PerCP-Cy5.5 - Kanal) können verwendet werden (Abbildung 2).
   HINWEIS: Wenn ein gelber Laser nicht verfügbar ist, verwenden Sie einen toten Zellausschlussfarbstoff in einem anderen Kanal.
2. Tor auf PI - negativen Zellen (PI-) auszuschließen toten Zellen (2B).
3. Tote Zellen, Tor auf CD11b - positiven Zellen (CD11b ⁺⁾ Nach dem Ausschluss sind darunter alle myeloischen Zellen (2C).
4. Innerhalb der CD11b ⁺ Bevölkerung, Tor auf Ly6C ^- / Ly6G ^- auszuschließenNeutrophile (CD11b ⁺ / Ly6G ⁺⁾ und Monozyten (CD11b ⁺ / Ly6C ^+; 2D). Nach Gating auf Mikroglia (hier definiert als CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^- der Einfachheit halber), zwei klare Populationen sollte sichtbar sein; eine negative und eine positive für die fluoreszenzmarkierten Partikel. Phagozyten haben Partikel aufgenommen und sind daher AF488 ⁺ (2E).
   HINWEIS: Ly6C positive oder Ly6G positive Populationen können auch Partikelaufnahme zu messen, mit dieser Färbung Ansatz analysiert werden. Der Anteil der phagozytischen CD11b ⁺ Zellen korreliert gut mit dem Prozentsatz der phagozytischen Mikroglia (2F). Für die Forscher ohne Durchflusszytometrie Erfahrung, eine einfachere Analyse mit CD11b-Färbung kann allein durchgeführt, wenn auch diese phagozytischen Neutrophilen und Monozyten umfassen wird, sowie Mikroglia. Innerhalb dieser CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^{- <}/ Sup> Bevölkerung, diese Zellen sind> 99% Mikroglia durch Anfärben mit den Markern F4 / 80 und CX3CR1 wie beurteilt; Diese Marker können hinzugefügt werden, sind aber nicht notwendig in unseren Händen.

Ergebnisse

Hier wir ein Verfahren , um schnell und zuverlässig zu quantifizieren , um die Anzahl der phagozytischen retinalen Mikroglia in einer physiologischen Umgebung unter Verwendung von Durchflußzytometrie - Analyse (Figur 2) beschrieben. Dieses Verfahren kann angepasst werden , um die Wirkung von Verbindungen zu testen , und / oder genetische Manipulation auf der phagozytischen Kapazität von Mikroglia (3A, 3B). (- 20 Tage postnatalen 10) oder erwa...

Diskussion

Es gibt drei kritische Schritte in diesem Verfahren: (1) intravitreale Injektion von Teilchen fluoreszierend markiert; (2) Die Gewinnung und Herstellung von Netzhautgewebe; und (3) durchflusszytometrische Analyse. Wir empfehlen, dass die Forscher intravitrealen Injektionen vor der Durchführung des Verfahrens üben wir hier vorstellen. Albino - Mäuse (zB BALB / c) und eine farbige Lösung kann (beispielsweise fluoreszenzmarkierte Partikel) für die einfache Visualisierung der Nadel und injizierten Lö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Nikon	Discontinued
Hamilton syringe, 600 series	Sigma	26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Prepare immediately before injection
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Need two
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-10	Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube	Falcon	352054
96 well U-bottom plate	Falcon	353077
Stain Buffer (BSA)	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 Antibody	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend	128025
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidium Iodide	BD Biosciences	556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101301