La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Riepilogo

fagocitosi microglia è fondamentale per il mantenimento della omeostasi tissutale e fagocitaria inadeguata è stato implicato nella patologia. Tuttavia, valutare la funzione microglia in vivo è tecnicamente impegnativo. Abbiamo sviluppato una tecnica semplice ma robusto per monitorare e quantificare il potenziale di fagocitosi microglia in un ambiente fisiologico preciso.

Abstract

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di valutare con precisione e quantificare in vivo fagocitosi microglia. Microglia sono i macrofagi tessuto residenti del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono una varietà di funzioni per assicurare il mantenimento dell'omeostasi tissutale. Questi includono sorveglianza immunitaria, la secrezione di fattori neurotrofici e, di fondamentale importanza, la fagocitosi ^1. Fagocitosi microglia è fondamentale in molti importanti eventi durante lo sviluppo del cervello e della retina, come la fagocitosi delle sinapsi irrilevanti (potatura sinaptica) e la rimozione dei neuroni apoptotici ^2-4. Inoltre, fagocitosi microglia dei neuroni danneggiati o apoptotici, detriti cellulari, e microbi ha dimostrato di essere essenziale per il mantenimento dell'omeostasi CNS attraverso adulta ^5. Infine, la fagocitosi microglia è stato implicato nella patogenesi di diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer e legata all'etàdegenerazione maculare, dove è stato suggerito che la capacità dei fagociti difettoso o insufficiente può contribuire alla formazione di amiloide beta-placche (Ap) e drusen, rispettivamente ^6,7.

la funzione della microglia è strettamente regolata dal loro microambiente, in particolare da fattori solubili come il fattore di crescita tumorale-β o interazioni cellula-cellula. I neuroni costitutivamente esprimono vari ligandi di superficie cellulare, come il CD200 e CX3CL1, mentre microglia esprimono esclusivamente i rispettivi recettori CD200R e CX3CR1. Questi recettori contengono immunoreceptor motivi di inibizione delle tirosin-based (ITIMs) nella loro porzione intracellulare. Questi inibitore recettori sono fondamentali per prevenire l'eccessiva stimolazione della microglia, che può contribuire alla neuroinfiammazione. Così, in condizioni fisiologiche normali, interazioni cellula-cellula tra i neuroni e microglia mantenere microglia in stato di quiescenza. Durante lesioni dei tessuti, tuttavia, i neuroni possono down-regolare expression di tali ligandi, rimuovendo il loro effetto inibitorio sull'attivazione microglia. La funzione della microglia (compresa la fagocitosi) è dunque strettamente legata alla loro microambiente ^8. Tuttavia, ad oggi, non esistono test standardizzati per studiare microglia fagocitosi in un contesto fisiologico o in un modo che replica pienamente la loro microambiente CNS.

Diversi test sono stati sviluppati per misurare l'attività fagocitaria dei microglia in vitro, dove microglia primarie o linee cellulari microgliali sono messi in coltura con cellule bersaglio (ad esempio, i neuroni apoptotici) o perline fluorescente. L'assorbimento di destinazione viene poi valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza per immagini o citometria a flusso ^9-12. Questi test permettono di prova di come la manipolazione farmacologica o genetica può influenzare la fagocitosi microglia e, mentre informativo, non riescono a replicare pienamente il complesso in un ambiente vivo. I metodi indiretti per l'esame fagocitosi microgliain vivo sono stati segnalati: questi sono realizzati mediante colorazione delle molecole si ritiene siano coinvolti nella fagocitosi (ad esempio, CD68), valutando la vicinanza fisica della microglia e obiettivi per la fagocitosi (ad esempio, i neuroni compromessi o elementi sinaptiche), o per la rilevazione immunoistochimica di fagociti obiettivi all'interno delle cellule microgliali (ad esempio, Ap) ^13-17. Due studi hanno utilizzato metodi più diretti per valutare microglia fagocitosi in vivo. Hughes e colleghi hanno utilizzato tecniche di imaging per misurare l'assorbimento microglia di perline consegnati per via intracranica ^18. Sierra et al. Ha sviluppato un metodo raffinato per valutare quantitativamente microglia fagocitosi delle cellule apoptotiche utilizzando tecniche di imaging complesse ^4. Tuttavia, questi metodi comportano protocolli complicati preparazione del tessuto, sezionamento, imaging e analisi. Abbiamo usato in precedenza l'analisi di citometria di flusso per valutare la fagocitosi di fotorecettori fuorisegmenti er di cellule epitelio pigmentato retinico (RPE) nella cultura ^19. Qui, descriviamo un protocollo per valutare rapidamente l'assorbimento di particelle fluorescente di microglia retina come una misura quantitativa della microglia in vivo fagocitosi.

Il protocollo che descriviamo qui consente la misurazione affidabile e quantitativa del retinale fagocitosi microgliali in meno di sei ore in tre fasi fondamentali: (1) fornitura intravitreale di fluorescenza etichettati particelle, (2) raccolta e preparazione del tessuto retinico, e (3) Flusso analisi di citometria. Il metodo abbiamo sviluppato un metodo robusto per valutare fagocitosi microglia nella retina, e può essere utilizzato con successo per verificare come vari composti o manipolazione genetica alterano questo tasto funzione microgliali in contesti fisiologici. Come una zona specializzata del SNC, la retina è un sistema modello facilmente accessibile per studiare la funzione microglia ^20. Mentre questo metodo è stato sviluppato in tegli occhio, riteniamo possa essere utile per tutti i neuroscienziati che studiano la funzione microglia fagocitaria.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida etiche stabilite dalla Scripps Research Institute.

1. Preparazione dei Materiali per iniezione

1. Sterilizzare un ago 33 G e la siringa: smontare e autoclave a 115 ^ο C. Preparare aghi per l'iniezione da aumento in sterile tampone fosfato (PBS).
2. Scongelare particelle fluorescente a temperatura ambiente per 5 - 10 minuti. Preparare la soluzione di particelle per l'iniezione mediante ricostituzione di 50 mg / ml soluzione in PBS sterile con Ca2 ⁺ / Mg ^2+.
   NOTA: le particelle AF488-etichettate di origine fungina che sono stati convalidati per saggi fagocitosi sono utilizzati in questo protocollo ^21-23. Per assorbimento ottimale, preparare particelle fresco ed immediatamente prima dell'iniezione.
   Nota 2: particelle concentrazioni possono essere ottimizzati per ogni esperimento specifico.

2. intravitreale iniezione di soluzione Bead

NOTA: Due people sono necessari per effettuare l'iniezione, in modo tale che la persona che effettua l'iniezione può tenere il mouse e mantenere l'attenzione sul bulbo oculare, mentre l'altra persona passa la siringa caricata e spinge il pistone.

1. Anestetizzare il roditore mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / ml ketamina e 10 mg / ml xilazina alla dose di 20 ml / 10 g di peso corporeo. Prima dell'iniezione, usare punta pizzico per valutare il livello di anestesia.
   NOTA: Isoflurano ha un profondo effetto sulla funzione delle cellule mieloidi, in tal modo, il suo utilizzo nel corso di questo test deve essere evitato ^24,25.
2. Ago di carico con 0,5 soluzione delle particelle ml di fluorescente.
3. Disporre il mouse lateralmente sotto un microscopio chirurgico (Figura 1A-B). Utilizzare un materiale morbido, ad esempio, una confezione di gel, per un migliore posizionamento del mouse. Per i giovani topi in cui gli occhi non sono ancora aperte, aprire delicatamente le palpebre con l'aiuto di sottili 45 ^o pinze ad angolo con la creazione di un fissuri lungo la fessura da cui le palpebre finiranno aperta.
   1. Con l'aiuto di sottili 45 ^o angolata pinza applicare accuratamente la pressione intorno alla palpebra, in modo che il bulbo oculare si apre un po 'dalla presa di corrente. Tenere la testa con due dita appena sopra l'orecchio e la mascella e delicatamente allungare la pelle in parallelo alle palpebre per mantenere leggermente l'occhio dalla presa. Fare attenzione a non capire troppo vicino alla gola (Figura 1B).
4. Per forare il bulbo oculare, inserire l'ago della siringa in limbus corneale (dove la cornea e nella sclera Connect). Questo è visibile come un cerchio grigio in topi pigmentati. Ritrarre l'ago leggermente per espellere un piccolo volume di liquido vitreale e poi iniettare. La persona che esegue l'iniezione deve tenere delicatamente il mouse con una mano e l'ago con l'altra; la seconda persona dovrebbe spingere lentamente lo stantuffo.
5. Ritrarre la siringa lentamente. idratante Applicare collirio per mantenere l'occhio idratato.
6. Lasciate che il roditore recuperare in una gabbia su un tappetino di calore e continuare a monitorare l'animale. Se si lavora con i cuccioli, non rispedire l'animale in una gabbia con altri animali allarme fino a quando non è la respirazione e capaci di movimento spontaneo. Se si lavora con gli adulti, non restituiscono il roditore in una gabbia con altri animali allarme fino a quando riacquista prona sternale.

3. La raccolta di tessuto retinico

NOTA: tessuto retinico da occhi non iniettati con fluorescenza etichettati particelle devono essere raccolti come controllo per l'analisi di citometria di flusso. Anche se il test può essere eseguito utilizzando un unico retina, per le migliori prestazioni, due retine devono essere raggruppate.

1. Raccogliere retinico tessuto 3 ore dopo l'iniezione intravitreale di particelle fluorescente.
   NOTA: Mentre il tempo dopo l'iniezione della soluzione di particelle può essere ottimizzato per ogni esperimento specifico, abbiamo riscontrato che 3 ore dopo l'iniezione, l'assorbimento delle particelle potrebbe essere visto in tutta la maggior parte degli strati of retina (Figura 1C-D).
2. Sacrificio topi da dislocazione cervicale.
3. Raccogliere i bulbi oculari premendo delicatamente contro la palpebra con l'aiuto di sottili 45 ^o pinze ad angolo per proptose il bulbo oculare. Posizionare la pinza dietro il bulbo oculare e tirare.
4. Sezionare la retina sotto un microscopio da dissezione. Trasferire il bulbo oculare per una piastra di Petri contenente una piccola quantità di PBS con Ca ²⁺ / Mg ^2+. In una zona asciutta della scatola di Petri, forare il bulbo oculare nel limbus corneale con la punta di una pinza superfine.
5. Tenere il bulbo oculare con l'aiuto di sottili 45 ^o pinza angolata e usare le forbici per tagliare molla intorno al limbus corneale, fino viene tagliato circa la metà della circonferenza limbus corneale.
6. Tenere il bulbo oculare con le belle 45 ^o pinze ad angolo e portare il bulbo oculare in PBS. Con una seconda coppia di sottili 45 ^o pinza angolata strappare la cornea e sclera parte. La lente e la retina usciranno intact.
7. Separare la lente e la retina. Raccogliere la retina e trasferire in una provetta 5,4 ml di polistirolo contenente 2 ml di PBS con Ca ²⁺ / Mg ^2+.

4. Preparare una sospensione cellulare singolo

1. Preparare sospensioni singola cella utilizzando un kit di tessuti di dissociazione neuronale con piccole modifiche alle istruzioni del produttore. In breve, retine Triturare pipettando su e giù con una pipetta P1000 ed eseguendo una digestione enzimatica a 37 ^° C senza agitazione.

5. colorazione sospensioni singola cella per analisi di flusso citometrica

1. Risospendere le cellule in 200 ml di buffer di colorazione (PBS Dulbecco con albumina 0,2% di siero bovino (BSA) e 0,09% di sodio azide) e trasferimento in un piatto di U-bottom 96 pozzetti. Centrifugare per 5 min a 130 x g.
   NOTA: sodiazide è dannosa per l'uomo e per l'ambiente. Utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale di unND smaltire rifiuti in conformità alla normativa vigente.
2. Capovolgere la piastra su un lavandino di scartare il surnatante. Per bloccare i recettori Fc, risospendere le cellule in 25 ml di tampone macchia contenente 5 mg / ml di anticorpi anti-topo CD16 / CD32 per pozzetto. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Aggiungere 25 ml di tampone colorazione contenente 0,5 mg / ml di anti-topo Ly6C-APC-Cy7, 0,5 mg / ml di anti-topo Ly6G-Pe-Cy7 e 2,5 mg / ml di anti-topo CD11b-AF650. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
4. Centrifugare per 5 min a 130 x g. Capovolgere la piastra di scartare il surnatante. Lavare risospensione delle cellule in 200 ml di buffer di colorazione.
5. Centrifugare per 5 min a 130 x g. Risospendere in 200 ml di tampone macchia contenente 0,5 mg / ml di ioduro di propidio (PI). Trasferimento a tubi microtitolazione 1.2 ml.
6. Lavare i pozzetti con altri 100 ml di buffer di colorazione contenente 0,5 mg / ml di PI e la piscina con le precedenti 200 microlitri nel1,2 ml tubi microtitolazione. Un volume totale di 300 microlitri di cellule colorate si ottiene.

6. analisi di citometria di flusso

1. Utilizzando un convenzionale a tre laser (viola, blu, e laser rosso), evitare di PE, PerCP-Cy5.5, BV510 e coloranti PI a causa della ricaduta significativa dai estremamente luminose fluorescenti AF488-particelle. Utilizzare una quarta laser (giallo) per ottimizzare questo saggio, in quanto consente per anticorpi PE-marcato e PI (nel canale mCherry posto del canale PerCP-Cy5.5) da utilizzare (figura 2).
   NOTA: se un laser di colore giallo non è disponibile, utilizzare un colorante esclusione cellula morta in un altro canale.
2. Porta il PI cellule negative (PI-) di escludere le cellule morte (Figura 2b).
3. Dopo aver escluso le cellule morte, porta sulle cellule positive CD11b (CD11b ^+), questo includerà tutte le cellule mieloidi (Figura 2C).
4. All'interno della popolazione CD11b ^+, cancello sulla Ly6C ^- / Ly6G ^- di escludereneutrofili (CD11b ⁺ / Ly6G ⁺⁾ e monociti (CD11b ⁺ / ⁺ Ly6C; Figura 2D). Dopo gating su microglia (qui definito come CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^- per semplicità), due popolazioni chiare dovrebbero essere visibili; uno negativo e positivo per le particelle fluorescente. Fagociti avranno ripreso particelle e sono pertanto AF488 ⁺ (Figura 2E).
   NOTA: Ly6C positivo o Ly6G popolazioni positivi può anche essere analizzato per misurare l'assorbimento di particelle utilizzando questo approccio colorazione. La percentuale di fagociti CD11b ⁺ correla bene con la percentuale di microglia fagociti (Figura 2F). Per i ricercatori senza esperienza citometria di flusso, un'analisi semplice con solo CD11b colorazione può essere eseguita, anche se questo includerà neutrofili e monociti fagocitosi, così come microglia. All'interno di questo CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^{- <}/ Sup> popolazione, queste cellule sono> 99% microglia come giudicato dalla colorazione con marcatori F4 / 80 e CX3CR1; questi marcatori possono essere aggiunti, ma non sono necessari nelle nostre mani.

Risultati

Qui si descrive un metodo per rapido e affidabile quantificare il numero di microglia retiniche fagocitiche in un ambiente fisiologico mediante analisi citofluorimetrica (Figura 2). Questo metodo può essere adattato per testare l'effetto di composti e / o manipolazione genetica sulla capacità fagocitica di microglia (figure 3A, 3B). Può essere utilizzato anche in giovane (10 - 20 giorno dopo la nascita) o topi adulti (Figura 3C).<...

Discussione

Ci sono tre passaggi critici in questo metodo: (1) l'iniezione intravitreale di fluorescenza etichettati particelle; (2) la raccolta e preparazione del tessuto retinico; e (3) il flusso citometria. Si raccomanda che i ricercatori praticano iniezioni intravitreali prima di eseguire il metodo che presentiamo qui. Topi albini (ad esempio, BALB / c), e una soluzione colorata (ad esempio, particelle fluorescente) possono essere utilizzati per facilitare la visualizzazione dell'ago e soluzione iniett...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Nikon	Discontinued
Hamilton syringe, 600 series	Sigma	26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Prepare immediately before injection
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Need two
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-10	Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube	Falcon	352054
96 well U-bottom plate	Falcon	353077
Stain Buffer (BSA)	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 Antibody	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend	128025
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidium Iodide	BD Biosciences	556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101301