Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Résumé

phagocytose microgliale est essentiel pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et la fonction phagocytaire insuffisante a été impliquée dans la pathologie. Cependant, l' évaluation de la fonction microglies in vivo est techniquement difficile. Nous avons mis au point une technique simple mais robuste pour surveiller et quantifier le potentiel phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique précisément.

Résumé

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Introduction

L'objectif global de cette méthode est d'évaluer et de quantifier en phagocytose microgliale vivo avec précision. Les microglies sont les macrophages du système nerveux central (SNC) résidentes du tissu. Ils effectuent une variété de fonctions pour assurer le maintien de l'homéostasie tissulaire. Ceux - ci comprennent la surveillance immunitaire, la sécrétion de facteurs neurotrophiques et, d' une importance cruciale, la phagocytose ^1. Phagocytose microgliale est la clé de plusieurs événements importants au cours du développement du cerveau et de la rétine, comme la phagocytose des synapses non pertinentes (élagage synaptique) et l' élimination des neurones apoptotiques ^2-4. En outre, la phagocytose microgliale de neurones endommagés ou apoptotiques, des débris cellulaires et des microbes envahisseurs a été révélée indispensable au maintien de l' homéostasie du système nerveux central jusqu'à l' âge adulte ^5. Enfin, la phagocytose microgliale a été impliquée dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer et liée à l'âgela dégénérescence maculaire, où il a été suggéré que la capacité de phagocytose défectueuse ou insuffisante peut contribuer à l'accumulation de l' amyloïde ß (Aß) , des plaques et des druses, respectivement ^6,7.

fonction de la microglie est étroitement régulée par leur micro-environnement, notamment par des facteurs solubles tels que le facteur β de croissance tumorale ou les interactions cellule-cellule. Les neurones expriment constitutivement plusieurs ligands de surface cellulaire, tels que le CD200 et CX3CL1, tandis que les microglies expriment exclusivement les récepteurs respectifs CD200R et CX3CR1. Ces récepteurs contiennent immunorécepteur motifs d'inhibition à base de tyrosine (ITIM) dans leur partie intracellulaire. Ces récepteurs inhibiteurs sont essentiels pour empêcher la sur-stimulation de la microglie, ce qui peut contribuer à une neuroinflammation. Ainsi, dans des conditions physiologiques normales, les interactions cellule-cellule entre les neurones et les microglies garder microglie dans un état de repos. Pendant une lésion tissulaire, cependant, les neurones peuvent réguler vers le bas expression de ces ligands, en supprimant leur effet inhibiteur sur la microglie activation. Fonction microglial (y compris la phagocytose) est donc étroitement liée à leur microenvironnement ^8. Néanmoins, à ce jour, il n'y a pas des tests standardisés pour étudier la microglie phagocytose dans un contexte physiologique ou d'une manière qui reproduit pleinement leur microenvironnement CNS.

Plusieurs dosages ont été développés pour mesurer l' activité phagocytaire des microglies in vitro, où les cellules microgliales primaires ou de lignées de cellules microgliales sont cultivées avec des cellules cibles (par exemple, les neurones apoptotiques) ou des billes marquées par fluorescence. L' absorption de la cible est alors déterminée en utilisant la microscopie à imagerie de fluorescence ou cytométrie de flux ^12/09. Ces essais permettent de tester comment la manipulation pharmacologique ou génétique peut affecter la phagocytose microgliale et, tandis que d' information, ne parviennent pas à répliquer totalement le complexe dans un environnement in vivo. Les méthodes indirectes pour l'examen de la phagocytose microglialein vivo ont été rapportés: ceux - ci sont réalisés par coloration des molécules censées être impliquées dans la phagocytose (par exemple, CD68), l' évaluation de la proximité physique des microglies et des cibles pour la phagocytose (par exemple, des neurones compromis ou éléments synaptiques), soit par détection immunohistochimique de phagocytose cibles dans les cellules microgliales (par exemple, Aß) ^13-17. Deux études ont utilisé des approches plus directes pour évaluer la microglie phagocytose in vivo. Hughes et ses collègues ont utilisé des techniques d'imagerie pour mesurer l' absorption de la microglie de perles livrées par voie intracrânienne ^18. Sierra et al. A développé une méthode raffinée pour évaluer quantitativement la microglie phagocytose des cellules apoptotiques en utilisant des techniques d'imagerie complexes ^4. Cependant, ces procédés impliquent des protocoles compliqués pour la préparation des tissus, le sectionnement, l'imagerie et l'analyse. Nous avons déjà utilisé une analyse de cytométrie de flux pour évaluer la phagocytose du photorécepteur surer segments de cellules rétiniennes épithélium pigmentaire (RPE) dans la culture ^19. Ici, nous décrivons un protocole pour évaluer rapidement l' absorption de particules marquées par fluorescence par microglie rétiniennes comme une mesure quantitative de la microglie in vivo phagocytose.

Le protocole que nous décrivons ici permet une mesure fiable et quantitative de la phagocytose microgliale rétinienne dans un peu moins de six heures en trois étapes essentielles: (1) la livraison de intravitréenne de particules marquées par fluorescence, (2) la récolte et la préparation du tissu rétinien, et (3) Flux l'analyse cytométrique. La méthode que nous avons mis au point une méthode robuste pour évaluer la phagocytose microgliale dans la rétine, et il peut être utilisé avec succès pour tester la façon dont divers composés ou manipulation génétique modifient cette fonction clé dans la microglie paramètres physiologiques. En tant que domaine spécialisé de la CNS, la rétine est un système modèle facilement accessible pour étudier la fonction de microglies ^20. Bien que cette méthode a été développée en til oeil, nous croyons qu'il peut être utile pour tous les neuroscientifiques enquête fonction microglie phagocytaire.

Protocole

Tous les animaux ont été traités en conformité avec les lignes directrices éthiques établies par l'Institut de recherche Scripps.

1. Préparation du matériel pour injection

1. Stériliser une aiguille de 33 G et la seringue: démonter et autoclave à 115 ^ο C. Préparer des aiguilles d'injection par l'augmentation dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
2. Décongeler les particules marquées par fluorescence à température ambiante pendant 5 - 10 min. Préparer une solution pour injection de particules en reconstituant une solution à 50 mg / ml dans du PBS stérile avec Ca ²⁺ / Mg ^2+.
   NOTE: Les particules AF488 marquées d'origine fongique qui ont été validées pour des essais de phagocytose sont utilisés dans ce protocole ^21-23. Pour l'absorption optimale, préparer des particules fraîches et immédiatement avant l'injection.
   Note 2: particules concentrations peuvent être optimisées pour chaque expérience spécifique.

2. intravitréenne Injection de solution Bead

NOTE: Deux people sont nécessaires pour effectuer l'injection, d'une manière telle que la personne qui effectue l'injection peut contenir la souris et maintenir la focalisation sur le globe oculaire, tandis que l'autre passe à la seringue chargée et pousse le piston.

1. Anesthésier le rongeur par une injection intrapéritonéale de 100 mg / ml de kétamine et 10 mg / ml de xylazine à une dose de 20 pl / 10 g de poids corporel. Avant injection, utiliser pincement de l'orteil pour évaluer le niveau de l'anesthésie.
   NOTE: L' isoflurane a un effet profond sur la fonction des cellules myéloïdes, par conséquent, son utilisation tout au long de cet essai doit être évité ^24,25.
2. l'aiguille de charge avec une solution de particules de 0,5 ul d'marqué par fluorescence.
3. Placez la souris sur le côté sous un microscope chirurgical (Figure 1A-B). Utiliser un matériau mou, par exemple un sachet de gel, pour un meilleur positionnement de la souris. Pour les jeunes souris dont les yeux ne sont pas encore ouvert, ouvrez doucement les paupières à l'aide de fines 45 ^o pince à angle en créant un fissure le long de la fente à partir de laquelle les paupières sera finalement ouvert.
   1. Avec l'aide d' une pince fine 45 ^o angle appliquer soigneusement la pression autour de la paupière, de sorte que le globe oculaire apparaît légèrement hors de la prise. Tenir la tête avec deux doigts juste au-dessus de l'oreille et par sa mâchoire et étirer doucement la peau en parallèle aux paupières pour garder l'œil légèrement hors de la prise. Veillez à ne pas saisir trop près de la gorge (figure 1B).
4. Pour percer le globe oculaire, insérer l'aiguille de la seringue dans le limbe cornéen (où la cornée et de la sclérotique se connecter). Ceci est visible comme un cercle gris souris pigmentées. Dégager l'aiguille légèrement pour expulser un petit volume de fluide vitré, puis injecter. La personne qui effectue l'injection doit tenir doucement la souris avec une main et l'aiguille avec l'autre; la deuxième personne devrait lentement pousser le piston.
5. Rentrez la seringue lentement. hydratante Appliquer des gouttes oculaires pour garder l'oeil hydraté.
6. Laissez le rongeur récupérer dans une cage sur un tampon de chaleur et de continuer à surveiller l'animal. Si vous travaillez avec des chiots, ne pas retourner l'animal dans une cage avec d'autres animaux d'alerte jusqu'à ce qu'il respire et capable de mouvement spontané. Si vous travaillez avec des adultes, ne pas retourner le rongeur dans une cage avec d'autres animaux d'alerte jusqu'à ce qu'il regagne décubitus sternale.

3. La récolte de tissu rétinien

REMARQUE: le tissu rétinien des yeux injectés non avec des particules marquées par fluorescence doivent être collectées en tant que témoin pour l'analyse cytométrique de flux. Bien que le test peut être réalisé en utilisant une seule rétine, pour une meilleure performance, deux rétines devraient être regroupées.

1. Collecter rétinienne tissu 3 heures après l'injection intravitréenne de particules marquées par fluorescence.
   REMARQUE: Pendant le temps après l'injection de la solution de particules peut être optimisée pour chaque expérience spécifique, on a trouvé que 3 heures après l'injection, l'absorption des particules pourrait être considérée dans la plupart des couches of la rétine (figure 1C-D).
2. Sacrifiez les souris par dislocation cervicale.
3. Collecter les globes oculaires en appuyant doucement contre la paupière à l'aide de fines 45 ^o pince à angle pour proptose le globe oculaire. Placez la pince derrière le globe oculaire et pull.
4. Disséquer la rétine sous un microscope à dissection. Transférez le globe oculaire à une boîte de Pétri contenant une petite quantité de PBS avec Ca ²⁺ / Mg ^2+. Dans une zone sèche de la boîte de Pétri, perforer le globe oculaire dans le limbe cornéen avec la pointe d'une pince ultrafines.
5. Tenez le globe oculaire avec l'aide de fines 45 ^o pince à angle et utiliser des ciseaux à ressort pour couper autour du limbe cornéen, jusqu'à environ la moitié de la circonférence limbe cornéen est coupé.
6. Tenez le globe oculaire avec les fines 45 ^o pince à angle et porter le globe oculaire dans du PBS. Avec une deuxième paire de fines 45 ^o pince à angle déchirer la cornée et de la sclérotique à part. Le cristallin et la rétine sortiront intact.
7. Séparez le cristallin et la rétine. Recueillir la rétine et transférer dans un tube à essai 5,4 ml de polystyrène contenant 2 ml de PBS avec ^{Ca2 +} / Mg2 ^+.

4. Préparation d'une suspension cellulaire unique

1. Préparer des suspensions de cellules uniques en utilisant un kit de dissociation de tissu neuronal avec des modifications mineures aux instructions du fabricant. En bref, rétines Broyez par pipetage de haut en bas avec une pipette P1000 et en effectuant une digestion enzymatique à 37 ^° C sans agitation.

5. Coloration Suspensions cellulaires simples pour l'analyse par cytométrie en flux

1. Resuspendre les cellules dans 200 pi de tampon de coloration (la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec de l'albumine de sérum bovin à 0,2% (BSA) et de l'azoture de sodium à 0,09%) et transfert dans une plaque à fond en U à 96 puits. Centrifugeuse pendant 5 min à 130 x g.
   NOTE: L'azoture de sodium est nocif pour les humains et l'environnement. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié unnd jeter les déchets conformément à la réglementation locale.
2. Inversez la plaque sur un évier pour éliminer le surnageant. Pour bloquer les récepteurs Fc, des cellules de remettre en suspension dans 25 pi de tampon de coloration contenant 5 pg / ml d'anticorps anti-souris CD16 / CD32 par puits. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
3. Ajouter 25 pi de tampon de coloration contenant 0,5 pg / ml d'anti-souris Ly6C-APC-Cy7, 0,5 pg / ml d'anti-souris Ly6G-Pe-Cy7 et 2,5 ug / ml d'anti-souris CD11b AF650. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
4. Centrifugeuse pendant 5 min à 130 x g. Inversez la plaque pour éliminer le surnageant. Laver en remettant en suspension les cellules dans 200 pi de tampon de coloration.
5. Centrifugeuse pendant 5 min à 130 x g. Remettre en suspension dans 200 pi de tampon de coloration contenant 0,5 pg / ml d'iodure de propidium (PI). Transfert à tubes de microtitrage 1,2 ml.
6. Laver les puits avec 100 ul un supplémentaires de tampon de coloration contenant 0,5 pg / ml de PI et une piscine avec 200 ul précédentes dans la1,2 ml des tubes de microtitrage. Un volume total de 300 ul de cellules colorées est obtenue.

6. Analyse par cytométrie en flux

1. L'utilisation d'un trois laser classique (violet, bleu, et le laser rouge), évitez PE, PerCP-Cy5.5, BV510, et des colorants de PI en raison de retombées significatives des AF488-particules fluorescentes extrêmement lumineux. Utiliser une quatrième (jaune) laser afin d' optimiser cet essai, car elle permet un anticorps et PI marqué PE (mCherry dans le canal au lieu du canal PerCP-Cy5.5) à être utilisé (figure 2).
   NOTE: Si un laser jaune ne sont pas disponibles, utilisez un colorant mort d'exclusion de cellules dans un autre canal.
2. Gate PI cellules négatives (PI) pour exclure les cellules mortes (figure 2B).
3. Après exclusion des cellules mortes, porte sur des cellules positives CD11b (CD11b ^+), cela comprendra toutes les cellules myéloïdes (figure 2C).
4. Au sein de la population CD11b ^+, porte sur Ly6C ^- / Ly6G ^- à exclureneutrophiles (CD11b ⁺ / Ly6G ⁺⁾ et les monocytes (CD11b ⁺ / Ly6C ^+; Figure 2D). Après gating sur la microglie (définie ici comme CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^- pour simplifier), deux populations claires doivent être visibles; un négatif et un positif pour les particules marquées par fluorescence. Les cellules phagocytaires auront pris des particules et sont donc AF488 ⁺ (figure 2E).
   NOTE: les populations positives Ly6C positive ou Ly6G peut également être analysé pour mesurer l'absorption de particules en utilisant cette approche de coloration. Le pourcentage de cellules phagocytaires CD11b ⁺ est en bonne corrélation avec le pourcentage de phagocytose microglie (figure 2F). Pour les chercheurs sans expérience de cytométrie en flux, une analyse plus simple avec une coloration CD11b seule peut être effectuée, bien que cela comprendra des neutrophiles et des monocytes phagocytose, ainsi que des microglies. Dans ce CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^{- <}/ Sup> population, ces cellules sont> 99% à en juger par la microglie coloration avec les marqueurs F4 / 80 et CX3CR1; ces marqueurs peuvent être ajoutés, mais ne sont pas nécessaires dans nos mains.

Résultats

Ici , nous décrivons une méthode pour quantifier rapidement et de façon fiable le nombre de microglie de la rétine phagocytaires dans un milieu physiologique , en utilisant une analyse par cytométrie de flux (Figure 2). Cette méthode peut être adaptée pour tester l'effet des composés et / ou la manipulation génétique de la capacité phagocytaire microglie (figures 3A, 3B). Il peut également être utilisé chez les jeunes (10 - 20...

Discussion

Il y a trois étapes critiques dans cette méthode: (1) l'injection intravitréenne de particules marquées par fluorescence; (2) la récolte et la préparation du tissu rétinien; et (3) l'écoulement analyse cytométrique. Nous recommandons que les chercheurs pratiquent des injections intravitréennes avant d'effectuer la méthode que nous présentons ici. Souris albinos (par exemple, BALB / c) et une solution de couleur (par exemple, des particules marquées par fluorescence) peuvent êt...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Nikon	Discontinued
Hamilton syringe, 600 series	Sigma	26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Prepare immediately before injection
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Need two
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-10	Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube	Falcon	352054
96 well U-bottom plate	Falcon	353077
Stain Buffer (BSA)	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 Antibody	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend	128025
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidium Iodide	BD Biosciences	556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101301