Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em&gt; В Vivo</em&gt; С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Резюме

Микроглии фагоцитоза имеет решающее значение для поддержания гомеостаза тканей и недостаточной фагоцитарной функции были замешаны в патологии. Тем не менее, оценки функции микроглии в естественных условиях является технически сложной задачей. Мы разработали простой, но надежный метод для точного мониторинга и количественной оценки фагоцитарной потенциала микроглии в физиологической обстановке.

Аннотация

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Введение

Общая цель этого метода заключается в точной оценки и количественного определения в естественных условиях микроглии фагоцитоза. Микроглии являются резидентные макрофаги ткани центральной нервной системы (ЦНС). Они выполняют различные функции, чтобы обеспечить поддержание гомеостаза тканей. К ним относятся иммунного надзора, секрецию нейротрофических факторов и, ключевое значение, фагоцитоз ^1. Микроглии фагоцитоза играет ключевую роль в нескольких важных событий во время развития головного мозга и сетчатки глаза, такие как фагоцитоз несущественных синапсов (синаптических подрезке) и удаление апоптотических нейронов ^2-4. Кроме того, микроглии фагоцитоз поврежденных или апоптотических нейронов, клеточных остатков и нарушало микробов было показано, что необходимо для поддержания гомеостаза ЦНС до зрелого возраста ^5. Наконец, микроглии фагоцитоза участвует в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и связанных с возрастомдегенерация желтого пятна, где было высказано предположение , что неисправны или недостаточная пропускная способность фагоцитарной может способствовать накоплению амилоида-бета (A & beta ; ) бляшек и друз, соответственно ^6,7.

Микроглии функция жестко регулируется их микросреды, в частности растворимых факторов, таких как фактор роста опухоли-бета или межклеточных взаимодействий. Нейроны конститутивно экспрессируют несколько клеточной поверхности лиганды, такие как CD200 и CX3CL1, в то время как микроглии исключительно выражают соответствующие рецепторы CD200R и CX3CR1. Эти рецепторы содержат иммунорецептора ингибирования на основе тирозина мотивы (ITIMs) в их внутриклеточной части. Эти рецепторы ингибитора имеют решающее значение для предотвращения чрезмерной стимуляции микроглии, которая может способствовать нейровоспаления. Таким образом, при нормальных физиологических условиях, межклеточные взаимодействия между нейронами и микроглии держать микроглии в состоянии покоя. Во время повреждения ткани, однако, нейроны могут понижающей регуляции ехрression этих лигандов, удаление их ингибирующее действие на активацию микроглии. Микроглии функции ( в том числе фагоцитоза), таким образом , тесно связана с их микросреды ^8. Тем не менее, на сегодняшний день не существует стандартизированные тесты для изучения микроглии фагоцитоза в физиологическом контексте, или таким образом, чтобы полностью повторяющей их микросреду ЦНС.

Несколько анализы были разработаны для измерения фагоцитарную активность микроглии в пробирке, где первичные микроглии или линии микроглии клеточные культивировали с клетками - мишенями (например, апоптотических нейронов) или флуоресцентно меченных бусинок. Целевое поглощение затем оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии изображений или проточной цитометрии ^9-12. Эти анализы позволяют тестирование как фармакологические или генетические манипуляции могут повлиять на микроглии фагоцитоза и, в то время как информативный, не в полной мере повторить комплекс в естественных условиях окружающей среды. Косвенные методы изучения микроглии фагоцитозав естественных условиях сообщалось: они выполняются с помощью окрашивания молекул как полагают, участвуют в фагоцитозе (например, CD68), оценка физической близости микроглии и мишеней для фагоцитоза (например, скомпрометированных нейронов или синапсов элементов), или с помощью иммуногистохимического обнаружения фагоцитирующих целевые задачи в клетках микроглии (например, A & beta ; ) ^{13-17 лет.} Два исследования использовали более прямые подходы к оценке микроглии фагоцитоза в естественных условиях. Хьюз и его коллеги использовали методы визуализации для измерения микроглии поглощение гранул доставленных через внутричерепного маршруту ^18. Sierra и др. Разработали точный метод для количественной оценки микроглии фагоцитоз апоптотических клеток с использованием сложных методов визуализации ^4. Тем не менее, эти методы включают сложные протоколы для подготовки ткани, секционирование, визуализации и анализа данных. Ранее мы использовали анализ проточной цитометрии для оценки фагоцитоза фоторецептора изэр сегменты по пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) клеток в культуре ^19. Здесь мы опишем протокол для быстрой оценки поглощения флуоресцентно меченных частиц микроглии сетчатки глаза в качестве количественной меры в естественных условиях микроглии фагоцитоза.

Протокол мы описываем здесь обеспечивает надежное и количественное измерение сетчатки микроглии фагоцитоза в чуть менее шести часов в трех важных этапов: (1) поставки интравитреального флуоресцентно меченый частиц, (2) сбора и подготовки ткани сетчатки, и (3) потока цитометрии анализ. Метод, который мы разработали это надежный метод для оценки микроглии фагоцитоза в сетчатке, и она может быть успешно использован для тестирования, как различные соединения или генетические манипуляции изменяют этот ключ микроглиальную функцию в физиологических условиях. В специализированной области ЦНС, сетчатка легко доступной модели системы для изучения функции микроглии ^20. В то время как этот метод был разработан в Tон глаз, мы считаем, что это может быть полезно для всех неврологов, расследующих функции микроглии фагоцитарную.

протокол

Все животные были обработаны в соответствии с этическими принципами, установленными научно-исследовательским институтом Скриппса.

1. Подготовка материалов для инъекций

1. Стерилизовать 33 G иглы и шприца: разобрать и автоклаве при 115 ° С ^ο Подготовка иглы для инъекций ростом в стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS).
2. Растаяйте флуоресцентно меченных частиц при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин. Приготовьте раствор для инъекций частиц путем восстановления до 50 мг мл раствора / в стерильной PBS с Ca ²⁺ / Mg ^2+.
   Примечание: AF488-меченые частицы грибного происхождения , которые были проверены для фагоцитоза анализов используются в данном протоколе ^21-23. Для оптимального поглощения, подготовить частицы свежей и непосредственно перед инъекцией.
   Примечание 2: Particle концентрации могут быть оптимизированы для каждого конкретного эксперимента.

2. Интравитреальная Инъекция Бусина Solution

Примечание: Два рюди необходимы для выполнения инъекции, таким образом, таким образом, что человек, выполняющий инъекции может держать мышь и сохранить фокус на глазное яблоко, в то время как другой человек проходит загруженный шприц и толкает поршень.

1. Анестезировать грызуна путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг / мл кетамина и 10 мг / мл ксилазина в дозе 20 мкл / 10 г веса тела. Перед инъекцией, использовать носок щепотку для оценки уровня анестезии.
   Примечание: Isoflurane оказывает глубокое воздействие на функции клеток миелоидного, таким образом, его использование на протяжении всего этого анализа следует избегать ^24,25.
2. Нагрузка игла с 0,5 мкл раствора флуоресцентно меченых частиц.
3. Положите мышь в сторону под операционным микроскопом (рис 1A-B). Используйте мягкий материал, например, пакет геля, для лучшего позиционирования мыши. Для молодых мышей , у которых глаза еще не открыты, аккуратно открыть веки при помощи тонких 45 ^O под углом щипцов путем создания fissuповторно вдоль щели, из которых в конечном итоге веки открытыми.
   1. С помощью тонких 45 ^O под углом пинцетом осторожно применять давление вокруг веко, так что глазное яблоко выскакивает слегка из гнезда. Держите голову двумя пальцами чуть выше уха и его челюсти и осторожно растягивать кожу параллельно веки слегка держать глаз из розетки. Будьте осторожны , чтобы не понять слишком близко к горлу (рис 1В).
4. Для того, чтобы проколоть глазного яблока, вставить иглу шприца в роговичного лимба (где роговица и склеры подключиться). Это видно, как серый круг в пигментированных мышей. слегка Отвести иглу, чтобы изгнать небольшой объем стекловидного жидкости, а затем вводят. Лицо, осуществляющее инъекцию следует осторожно держать мышь с одной стороны, и иглы с другой стороны; второй человек должен медленно толкать поршень.
5. Отвести шприц медленно. Нанесите увлажняющий глаз капли, чтобы держать глаза увлажненной.
6. Пусть грызун восстанавливаться в клетке над тепловым площадку и продолжать следить за развитием животного. При работе с мышат, не возвращают животное в клетку с другими животными оповещения, пока он не дышит и способные к самопроизвольному движению. При работе со взрослыми, не возвращают грызуна в клетку с другими животными оповещения, пока он не восстановит грудины отдохновение.

3. Заготовка ткани сетчатки

Примечание: ретинальной ткани из глаз не инъецировали флуоресцентно меченый частицами должны быть собраны в качестве контроля для анализа методом проточной цитометрии. Хотя анализ может быть выполнен с использованием одного сетчатку, для обеспечения наилучшей производительности двух сетчаток должны быть объединены вместе.

1. Собирают ткани сетчатки 3 ч после инъекции в стекловидное флуоресцентно меченых частиц.
   Примечание: В то время как время после введения раствора частиц могут быть оптимизированы для каждого конкретного эксперимента, мы обнаружили, что 3 ч после инъекции, поглощение частиц можно было видеть на протяжении многих слоев OF сетчатки (рис 1C-D).
2. Жертвоприношение мышей путем смещени шейных позвонков.
3. Соберите глазные яблоки, слегка нажав на веко с помощью тонких 45 ^O угловыми щипцов proptose глазного яблока. Расположите щипцов позади глазного яблока и тянуть.
4. Проанализируйте сетчатки глаза под микроскопом рассекает. Перенести глазное яблоко в чашку Петри , содержащую небольшое количество PBS с Ca ²⁺ / Mg ^2+. В сухом месте чашки Петри, перфорировать глазное яблоко в роговице лимба с кончика высокодисперсных щипцов.
5. Держите глазное яблоко с помощью тонких 45 ^O под углом пинцетом и использовать пружинные ножницы , чтобы вырезать вокруг роговицы лимба, пока примерно половина окружности лимба роговицы не вырезается.
6. Держите глазное яблоко с изобразительным 45 ^о наклоненными пинцетом и довести глазного яблока в PBS. С второй парой тонких 45 ^O под углом щипцов рвать роговицы и склеры друг от друга. Хрусталик и сетчатка выйдет яntact.
7. Отделите объектив и сетчатки глаза. Соберите сетчатку и передать пробирку 5,4 мл полистирола , содержащую 2 мл PBS с Ca ²⁺ / Mg ^2+.

4. Подготовка суспензии отдельных клеток

1. Подготовка суспензии отдельных клеток с использованием набора для нервной ткани диссоциации с незначительными модификациями инструкциями изготовителя. Вкратце, растирают сетчатка пипетированием вверх и вниз с P1000 пипетки и выполняя ферментативного расщепления при температуре 37 ^° С без встряхивания.

5. Окрашивание Суспензии отдельных клеток для анализа потока Cytometric

1. Ресуспендируют клеток в 200 мкл окрашивающего буфера (фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко, с 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,09% азида натрия) и переноса в U-дно 96-луночного планшета. Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г.
   Примечание: азид натрия вреден для человека и окружающей среды. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты оборудования аго отказаться от отходов в соответствии с местными правилами.
2. Переверните планшет над раковиной, чтобы отбросить супернатант. Для того, чтобы блокировать Fc рецепторы, ресуспендирования клеток в 25 мкл буфера, содержащего краситель 5 мкг / мл анти-мышиного CD16 / CD32 антитела на каждую лунку. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Добавьте 25 мкл окрашивающего буфера, содержащего 0,5 мкг / мл анти-мыши Ly6C-Арс-Cy7, 0,5 мкг / мл анти-мыши Ly6G-Пе-Cy7 и 2,5 мкг / мл анти-мышиной CD11b-AF650. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
4. Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г. Переверните планшет, чтобы отбросить супернатант. Промыть ресуспендирования клеток в 200 мкл буфера для окрашивания.
5. Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г. Ресуспендируют в 200 мкл буфера, содержащего краситель 0,5 мкг / мл йодистого пропиди (PI). Переезд в микротитровальных пробирки 1,2 мл.
6. Промыть лунки с дополнительными 100 мкл окрашивания буфера, содержащего 0,5 мкг / мл PI и бассейн с предыдущими 200 мкл в1,2 мл микротитровальные трубки. Общий объем 300 мкл окрашенных клеток получается.

6. Анализ проточной цитометрии

1. При использовании обычного три лазера (фиолетовый, синий и красный лазер), во избежание PE, PerCP-Cy5.5, BV510 и PI красители из-за значительного перелива из очень ярких флуоресцентных AF488-частиц. Используйте четвертый (желтый) лазер для оптимизации этого анализа, так как она позволяет PE-меченых антител и PI (в канале mCherry вместо канала PerCP-Cy5.5) , которые будут использоваться (рисунок 2).
   Примечание: Если желтый лазер не доступен, использовать мертвые клетки исключения красителя в другом канале.
2. Ворота на PI отрицательные клетки (PI-) , чтобы исключить мертвые клетки (рис 2б).
3. После исключения мертвые клетки, ворота на CD11b - положительных клеток (CD11b ^+), это будет включать в себя все миелоидных клеток (рис 2С).
4. В популяции CD11b ^+, ворота на Ly6C ^- / Ly6G ^- исключитьнейтрофилы (CD11b ⁺ / Ly6G ⁺⁾ и моноциты (CD11b ⁺ / ⁺ Ly6C; Рисунок 2D). После того, как стробирования на микроглии (здесь определяется как CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^- для простоты), две четкие группы населения должны быть видны; один отрицательный и один положительный для флуоресцентно меченых частиц. Фагоциты будут рассмотрены частицы и, следовательно , AF488 ⁺ (рис 2E).
   Примечание: Ly6C положительный или Ly6G положительные популяции также могут быть проанализированы для измерения поглощения частиц с помощью этого окрашивания подход. Процент фагоцитарных ^CD11b - клеток хорошо коррелирует с процентом фагоцитарной микроглии (рис 2F). Для исследователей без опыта проточной цитометрии, более простой анализ с одним только CD11b окрашивания может быть выполнена, хотя и это будет включать в себя фагоцитарную нейтрофилы и моноциты, а также микроглии. В рамках этого CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^{- <}/ SUP> популяции, эти клетки> 99% микроглии, о чем судили с помощью окрашивания маркеров F4 / 80 и CX3CR1; Эти маркеры могут быть добавлены, но не нужны в наших руках.

Результаты

Здесь мы опишем метод , чтобы быстро и надежно определить число фагоцитирующих микроглии ретинальных в физиологическом условиях с использованием анализа методом проточной цитометрии (рисунок 2). Этот метод может быть адаптирован для тестирования эффек?...

Обсуждение

Существуют три важных шагов в этом способе: (1) инъекции в стекловидное флуоресцентно меченый частиц; (2) сбор и подготовка ткани сетчатки; и (3) Цитометрический анализ. Мы рекомендуем, чтобы исследователи практике Интравитреальная инъекции перед выполнением метода мы представляем здесь....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Nikon	Discontinued
Hamilton syringe, 600 series	Sigma	26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Prepare immediately before injection
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Need two
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-10	Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube	Falcon	352054
96 well U-bottom plate	Falcon	353077
Stain Buffer (BSA)	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 Antibody	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend	128025
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidium Iodide	BD Biosciences	556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101301