2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין מטריצה ​​מעורבת 2D, המורכב של ג 'לטין קולגן אני, קולגן 3D אני תקע ללימוד invadosomes ליניארי. פרוטוקולים אלה מאפשרים את המחקר של היווצרות invadosome ליניארי, פעילות מטריקס השפלה, ויכולות הפלישה של תאים ראשוניים שורות תאים סרטניים.

Abstract

הדבקה תאית, הגירה ופלישה מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. לדוגמה, במהלך היווצרות גרורות, תאים סרטניים צריכים לחצות מחסומים אנטומיים כדי לפלוש ולהעביר דרך הרקמה הסובבת כדי להגיע דם או כלי הלימפה. זה דורש את האינטראקציה בין תאים מטריצה ​​תאיים (ECM). ברמה התאית, תאים רבים, כולל רוב תאי הסרטן, מסוגלים ליצור אינבאדוזומים, שהם מבנים המבוססים על F-actin המסוגלים להשפיל ECM. Invadosomes הם המבנים אקטין פולשנית כי לגייס ולהפעיל metalloproteinases מטריצה ​​(MMPs). ההרכב המולקולרי, הצפיפות, הארגון והקשיחות של ה- ECM הם קריטיים בוויסות של היווצרות ואינדואדום. במבחנה , assay ג'לטין הוא assay תקן המשמש להתבונן לכמת פעילות השפלה invadosome. עם זאת, ג'לטין, שהוא קולגן מפוגל, אני לא מטריצה ​​פיזיולוגית ה. Assay הרומן באמצעות סוג אני fibrils קולגן פותחה והשתמשו כדי להוכיח כי זה מטריצה ​​פיזיולוגית הוא inducer חזק של invadosomes. Invadosomes טופס לאורך fibrils קולגן ידועים כמו invadosomes ליניארי בשל הארגון ליניארי שלהם על הסיבים. יתר על כן, ניתוח מולקולרי של אינבדוזום ליניארי הראה כי קולטן תחום discoidin 1 (DDR1) הוא הקולטן המעורבים היווצרות שלהם. נתונים אלה ממחישים בבירור את החשיבות של שימוש במטריצה ​​רלוונטית מבחינה פיזיולוגית על מנת להבין את האינטראקציות המורכבות בין התאים לבין ה- ECM.

Introduction

מטריקס תאיים (ECM) שיפוץ מתרחשת במהלך תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כגון אנגיוגנזה ותאי הפלישה של תאים. בתנאים פיזיולוגיים, סוגי תאים רבים, בעיקר מן השושלת ההמטופויטית, מסוגלים להשפיל אלמנטים של ECM. לדוגמה, מקרופאגים מסוגלים לחצות מחסומים אנטומיים להגיע רקמות, ו osteoclasts לבזות מטריקס עצם כדי להבטיח הומיאוסטזיס סידן. יותר גלובלי, כל המטריצות בגוף מתחדשות כדי לשמור על התכונות הפיסיקליות והכימיות שלהן. ברקמות סרטן, הרכב microenvironment הגידול משתנה. לדוגמה, בסרטן השד והריאות, הקלד אני קולגן overexpressed ו מצטבר סביב הגידול. יתר על כן, הצטברות זו קשורה בסיכון מוגבר לפתח גרורות ^{1 , 2} . גרורות סרטן תלויה ביכולתם של תאים סרטניים להשפיל את ה- ECM ולפלוש לרקמות סמוכות.

הפעילות פולשנית של תאים מיוחסת מבנים עשירים אקטין מיוחדים הידועים בשם invadosomes. מונח זה כולל podosomes ו invadopodia, אשר נמצאים, בהתאמה, בתאי סרטן נורמלי ( למשל, מקרופאגים, תאי האנדותל, תאים סרטניים כגון MDA-MB-231 תאי סרטן השד). במבחנה , invadosomes יכול להתארגן לצורות שונות: נקודות, אגרגטים, או שושנות ³ . באופן קלאסי, אינבדוזומים מורכבים מליבה F- אקטין המכילה מספר חלבונים, כגון חלבון הפיגום Tks5 וקורטקטין, המקיפים מולקולות פלאק של הדבקה, כגון אינטגרינים ווינקולין ⁴ . לאחרונה, הוכח כי Tks5 ואת RhoGTPase Cdc42 יכול לשמש כחתימה מולקולרית מינימלית עבור invadosomes תפקודית ⁵ . מבנים אלה מסוגלים להשפיל את ECM באמצעות גיוס והפעלה של חלבונים metalloprotease ספציפיים, כגון MT1-MMP ו MMP-2 ⁶. במחקר קודם, דיווחנו כי האינטראקציה בין סיבי קולגן מסוג 1 לבין קולטן דסקוידין 1 (DDR1), קולטן ספציפי מסוגי סיבי קולגן מסוג 1, מוביל להיווצרותו של סוג חדש של אינבדוזומים, הנקראים אינבאדומים ליניאריים. Infadosomes ליניארי נוצרות לאורך סוג אני fibrils קולגן ⁷ . מבנים אלה מסוגלים לבזות סוג אני קולגן fibrils באמצעות גיוס והפעלה של MT1-MMP / MMP2. יתר על כן, היווצרות שלהם תלויה Tks5 ו Cdc42 ⁵ . במבחנה , הפגינו את קיומם של אינבדוזומים ליניאריים ומעורבות DDR1 בהיווצרותם ובפעילותם ⁸ באמצעות אסטרטגיות שונות המורכבות משילוב של אלמנטים מטריקס שונים, ביניהם: i) פלורסנט מצופה ג 'לטין coverslips, II) סוג פלואורסצנטי אני קולגן fibril מצופה coverslips, ו iii) סוג 3D אני קולגן plugs. בשל השימוש במטריצות שונות, הצלחנו ללמוד ולאפייןIze היווצרות invadosome לינארי ואת פעילות השפלה שלהם ^{7 , 8} .

לבסוף, כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של תאים פולשניים, שילוב של רכיבי ECM בשתי מערכות 2D ו 3D תרבות שימשו, מחקה את המורכבות של הרכב microenvironment הגידול. להלן פרוטוקולים coverslips ציפוי עם ג'לטין / סוג קולגן אני במערכות התרבות 2D ו 3D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: לפני קיבוע, כל השלבים הושלמו על מכסה המנוע זרימה סטרילית למינרית.

1. מטריצה ​​דו מימדית

הערה: מטריצות דו-ממדיות משמשות לקביעת אחוז התאים המרכיבים את הפלאדוזומים ואת אזור ההידרדרות של המטריצה ​​לכל תא.

איור 1: פרוטוקול. סיכום הפרוטוקול המשמש להכנת ג'לטין קולגן אני מטריצות. ניתן להפוך את מטריקס ג'לטין בלבד או ג'לטין קולגן אני מטריצה ​​מעורבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. מטריקס ג 'לטין
   הערה: מטריצות ג 'לטין פלואורסצנט משמשים לכמת השפלה מטריקס, ופלואורסצנטי ג' לטין משמש לקידום הידבקות קולגן אני סיבים. מחצלת ג'לטין פלואורסצנטיRices משמשים גם podosome ו invadopodia מחקרים (ראה איור 1 ).
   1. מתחת למכסה המנוע זרימה סטרילית למינרית, במקום חתיכת parafilm (20 ס"מ x 15 ס"מ) על אזור העבודה לחטא אותו עם אתנול 70%.
   2. Aliquot 20 טיפות μL של 1 מ"ג / מ"ל ​​ג'לטין בשורה, ברווחב כ 1 ס"מ זה מזה; עיין בתרשים 1 עבור ארגון טיפות.
   3. כיסוי כל 20 טיפה μL ג'לטין עם coverslip זכוכית autoclaved (12 מ"מ קוטר).
   4. לדגור על 20 דקות בטמפרטורת החדר. אם הג'לטין הוא פלואורסצנטי, הגן עליו מפני האור.
   5. Aliquot 40 טיפות μL של 0.5% glutaraldehyde ב 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בשורה, כל המרווח כ 1 ס"מ מתחת לקו coverslips מ שלב 1.1.3.
      זהירות: Glutaraldehyde הוא סוכן מקבע רעילים. השתמש כפפות ולא שואפים.
   6. באמצעות מלקחיים jeweled, להעביר כל ג 'לטין מצופה coverslip כדי טיפה glutaraldehyde.
      הערה: זההוא נורמלי כי טיפת ג 'לטין קטן נשאר על parafilm. אל תעשה שימוש חוזר בניסוי זה.
   7. דגירה של 40 דקות בטמפרטורת החדר. עבור coverslips ניאון, להגן עליהם מפני האור.
   8. קח 24 גם צלחת תרבות התא ולמלא כל טוב עם 500 μL של 1x סטרילי PBS. מניחים את coverslips, בצד ג'לטין למעלה, לתוך כל טוב.
   9. לשטוף פעמיים 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
      הערה: בשלב זה, coverslips ניתן להשתמש עבור ניסויים או מאוחסן 1x PBS ב 4 ° C. Non- פלורסנט coverslips ניתן לאחסן במשך שבוע אחד, coverslips ניאון ניתן לאחסן במשך 48 שעות.
2. סוג קולגן Fibrillar אני מטריקס
   הערה: סוג קולגן Fibrillar אני מטריצה ​​משמש ללימוד היווצרות לינארי ליניארי ואת השפלה מטריקס הקשורים. שילוב של קולגן ניאון אני ולא fluororescent coverslips ג 'לטין משמש colocalize סמנים invadosome עם סיבי קולגן ( למשל, F-actin אניN ערוץ אדום רחוק, קולגן אני בערוץ האדום, Tks5 בערוץ ירוק, צבע Hoechst כתם גרעיני). מצד שני, שילוב של קולגן שאינם פלואורסצנטי אני עם coverslips לא פלואורסצנטי ג 'לטין משמש כדי למקסם את מספר סמנים invadosome מוכתמים ( למשל, F- אקטין בערוץ אדום רחוק, קורטקטין בערוץ האדום, Tks5 ב את הערוץ הירוק, ואת צבע Hoechst כתם גרעיני). לבסוף, שילוב של קולגן שאינם פלורסנט אני עם coverslips ג 'לטין ניאון משמש לכמת את השפלה הקשורים ג' לטין ( למשל, F- אקטין בערוץ אדום רחוק, Tks5 בערוץ האדום, בערוץ הירוק, ואת צבע Hoechst עבור כתם גרעיני) (ראה איור 1). צבע Hoechst משמש הכתם הגרעין, וזה גם בודק זיהום mycoplasma, בנוסף בדיקה PCR נעשה באופן קבוע על שורות תאים בשימוש.
   1. קולגן פלואורסצנטי אני
      1. השתמש קולגן מסחרי אני חילוץ מן הזנב חולדה גיד ב 0.02 N Acetic aceticד. לשבור את כמות הקולגן אני הכרחי כדי להכין 500 μL של פתרון לכל coverslip בריכוז סופי של 0.4 מ"ג / מ"ל ​​של קולגן I.
      2. הוסף 5-carboxy x rhodamine succinimidyl אסתר בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל, מחושב עבור נפח סופי של קולגן אני הפתרון (500 ננומטר μL).
      3. מערבבים את הפתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה ו דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור.
      4. לדלל את נפח הסופי עם DXBCco של פוספט 1X שנאגרו מלוחים (DPBS) המכיל סידן ומגנזיום, ולהשתמש ישירות.
   2. קולגן Fibrillar אני coverslip
      1. השתמש הלא fluorescent או פלואורסצנטי ג 'לטין coverslips שהוכן בעבר בשלב 1.1.
      2. הכן פתרון של קולגן פלואורסצנטי או שאינם פלואורסצנטי אני בריכוז סופי של 0.4 מ"ג / מ"ל ​​1X DPBS המכיל סידן ומגנזיום.
      3. הוסף 500 μL של קולגן פלורסנט או שאינם פלואורסצנטי אני פתרון לכלCoverslip ב 24 גם צלחת תרבות התא.
      4. לדגור על 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עבור קולגן אני פילמור.
      5. לאחר הדגירה, להסיר את קולגן עודף אני על ידי הטיה צלחת pipetting בצד הבאר (לא ישירות על coverslip) כדי למנוע פגיעה במטריצה.
         הערה: לא ניתן לאחסן מטריצה ​​זו. זרע את התאים מיד לאחר הסרת עודף קולגן I.

2. זריעת תאים, זמן של תרבות, וקיבוע

1. בהתאם לסוג התא, להכין את התאים במדיום התרבות המתאימה ולהוסיף תאים עבור נפח סופי של μL 500 לכל טוב.
2. כדי לאפיין את היכולת של קו התא כדי ליצור invadosomes ליניארי כדי להשפיל את המטריצה, צלחת התאים במשך 4 שעות, 12 שעות ו 24 שעות על קולגן אני מטריצה ​​כדי לקבוע את הקינטיקה של היווצרות invadosome ליניארית ואת פעילות השפלה הקשורים.
   הערה: טבלה 1 מכילה דוגמאות של שורות תאיםנבדק במעבדה.

   קו טלפון	מספר תאים לכל coverslip	זמן המגע עם מטריצה ​​לכימות אינבאדוסית ליניארית	זמן מגע עם מטריצה ​​לכימות של פעילות ליניארית של השפלה ליניארית
   מד"א 231	40,000	4 שעות	12 שעות
   HUH7	40,000	12 שעות	24 h
   HEP 3B	40,000	12 שעות	24 h
   398	40,000	12 שעות	24 h
   NIH 3T3 src	30,000	4 שעות	12 שעות
   A431	50,000	6 שעות	24 h
   A549	40,000	12 שעות	24 h &# 160;
   גלם	40,000	12 שעות	12 שעות
   PAE	40,000	12 שעות	12 שעות

   טבלה 1: זריעת תאים וזמני הדגירה. טבלה זו מציגה רשימה לא ממצה של שורות תאים המשמשים לחקר אינבדוזום ליניארי. זה מציין את מספר התאים לזרוע על המטריצה, הזמן הדרוש כדי לצפות invadosomes ליניארי, ואת הזמן הדרוש כדי לבחון את השפלה מטריקס הקשורים. לינאדוסים לינאריים יש חיים קצרים. כדי להיות מסוגל לצפות invadosomes ליניארי במספר המרבי של תאים, התאים צריך להיות במגע עם המטריצה ​​קולגן אני לתקופה קצרה של זמן. מצד שני, כדי להיות מסוגלים לדמיין את השפלת הג'לטין שדווחו, התאים חייבים להיות בקשר עם המטריצה ​​אני קולגן במשך תקופה ארוכה יותר של אלה המפורטים לעיל.
3. לאחר הסרת המדיום תרבית תאים,לתקן את coverslips במשך 10 דקות μL 500 של paraformaldehyde 4% 1X PBS.
4. לשטוף פעמיים עם 1x PBS.
5. חנות ב 4 ° C, מוגן מפני האור.

3. Immunofluorescence

1. Permeabilize התאים במשך 10 דקות עם פתרון מוכן טרי של 0.2% Triton X-100 ב 1x PBS. אל תשתמש מחדש בפתרון זה.
2. לשטוף את coverslips פעמיים עם 1x PBS.
3. מניחים חתיכת parafilm (20 ס"מ על 15 ס"מ) על הספסל.
4. לדלל את הנוגדן העיקרי 4% אלבומין בסרום שור (BSA) ב 1x PBS, כמתואר בטבלה חומרים .
5. Aliquot 50 טיפות μL של הפתרון נוגדן ראשוני בשורה, כל המרווח כ 1 ס"מ זה מזה.
6. מניחים כל coverslip על טיפה.
7. דגירה של 40 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור.
8. לאחר תקופת הדגירה, לשטוף פעמיים עם 1x PBS.
9. לדלל את נוגדנים משני, phalloidin, וצבע Hoechst ב 4% BSA ב 1xPBS.
10. Aliquot 50 טיפות μL של התערובת, כל המרווח כ 1 ס"מ מתחת לקו הראשון של coverslips, כפי שנעשה בעבר.
11. מניחים כל coverslip על טיפה.
12. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור.
13. לאחר הדגירה, לשטוף פעמיים עם 1x PBS.
14. לשטוף פעם אחת עם מים מזוקקים כדי להסיר את המלחים.
15. הר coverslips על שקופית זכוכית עם פולימר הרכבה גובר.
16. בואו coverslips יבש לילה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור, לפני מיקרוסקופ.

4. כימות

איור 2: כימות Invadosome לינארי. המאקרו דורש תמונות confocal של F- אקטין ו Tks5 מכתים (פורמט: 1,024 x 1,024). ( א ) ראשית, לפתוח את התמונה F- אקטין ולעשות מסכה. ( ב ) ואז, פתוחתמונה Tks5 וסף זה. החל את המאקרו. ( C ) תוצאות ניתוח תופיע בשני טבלאות. מספר הפלאדוזומים הליניאריים לכל תא ומידע אחר, כגון אחוז האחוזים הנמצאים בשימוש על ידי אינבדוזום ליניארי בתא, יהיה בטבלה סיכום. הגודל של כל invadosome ליניארי יהיה בטבלה תוצאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. אחוז התאים המייצרים אינבדוזום ליניארי
   1. לספור את התאים יצירת invadosomes ליניארי, כ 100 תאים לכל coverslip (שימוש טכנית triplicates). לכמת לפחות 300 תאים לכל n, עם n = 3.
   2. חישוב אחוז התאים יצירת invadosomes ליניארי על ידי לקיחת הממוצע של שלושה ניסויים עצמאיים, וכתוצאה מכך 900 תאים לכמת.
2. גודל invadosome לינארי ומספר לכל תא
   הערה: השתמש מיקרוסקופ confocal לקחת תמונות רציף של F- אקטין כתמי Tks5. המאקרו מותאם לפורמט תמונות 1,024 x 1,024.
   1. השתמש ImageJ עם מאקרו משלים.
3. השפלה לכל תא
   1. השתמש שלושה coverslips לכל תנאי.
   2. קח 30 תמונות לכל coverslip של ג 'לטין פלואורסצנטי גרעינים מוכתמים Hoechst.
   3. השתמש בתוכנת ImageJ כמתואר ב- Martin KH et al. ⁹ .

5. 3D קולגן הפלישה Assay

איור 3: סכימה assay פלישה. סיכום של פרוטוקול assay הפלישה. קולגן אני חוצה מקושר עם צבע succinimidyl אסתר ו polymerized עבור 1 שעה ב 37 ° C. תאים מתווספים בינוני ללא סרום על גבי קולגן אני תקע. הכנס ממוקם בינוני wi10% FBS. קולגן אני תקעים קבועים 1 שעות לאחר זריעת התא בשליטה ו 3 ימים לאחר זריעת תאים במצב ניסיוני כדי לקבוע את יכולת הפלישה של התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. קולגן אני מכין הכנה
   1. לעשות קורס זמן של 4 שעות, 12 שעות, 24 שעות, 48 שעות, ו 72 שעות עבור הניסוי הראשון כדי לקבוע את הקינטיקה של הפלישה לתוך ג'ל על פי סוג התא. עבור כל ניסוי, הוסף נקודת זמן של שעה אחת כנקודת זמן התייחסות כאשר לא מתרחשת פלישה.
   2. הכן את הפתרון קולגן אני על הקרח מתחת למכסה המנוע סטרילי זרימה למינרית. הכן 500 μL של פתרון עבור 3 מוסיף החדר Boyden.
   3. לשאוב 1 מ"ג של חולדה מסחרי זנב קולגן אני להכין פתרון עם ריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל ​​קולגן I.
   4. הוסף 5-carboxy x Rhodamine succinimidyl אסתר בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל, מחושב עבור נפח סופי של קולגן אני הפתרון (במקרה זה, 500 μL).
   5. מערבבים היטב דגירה 5 דקות על הקרח מתחת למכסה המנוע זרימה סטרילית למינרית, מוגן מפני האור.
   6. הוסף 50 μL של קר, מסונן 10X PBS ו 6.25 μL של קר כקרח 1 הידרוקסיד נתרן M (NaOH).
   7. הוסף מים סטריליים על פי הנוסחה 443.75 - x μL של קולגן I.
   8. הוסף 100 μL של פתרון לכל להכניס לחדר Boyden.
   9. לדגור על 1 שעה ב 37 ° C כדי לאפשר פילמור.
   10. הוסף בינוני תרבות התא מועשר עם בסרום שור עוברית (FBS) לתוך בארות חדשות; מקום לתוך הבארות האלה.
   11. זרע 30,000 תאים על גבי קולגן אני תקע בינוני FBS ללא.
   12. לאחר culturing התאים ב 37 ° C, לתקן את קולגן אני תקע במשך 30 דקות ב paraformaldehyde 4% 1x PBS.
   13. השלם immunofluorescence כמו בשלב 3, למעט השלבים הבאים: permeabiliZe עם 0.2% Triton X-100 ב 1x PBS במשך 30 דקות, לא 10 דקות; דגירה עם פתרונות נוגדן ראשוניים ומשניים עבור 1.5 שעות כל אחד, במקום 40 דקות ו 30 דקות, בהתאמה. כתם עבור F- אקטין או גרעינים כדי למקם את התאים.
   14. לאחר immunofluorescence, להשתמש אזמל לחתוך סביב הממברנה של הכנס בזהירות להעביר את קולגן אני תקע לתחתית זכוכית התחתונה. ודא כי החלק העליון של קולגן אני תקע הוא במגע עם הזכוכית. שמור את הממברנה להוסיף המצורפת לתחתית קולגן אני תקע כדי לשמור על שלמות התקע.
       הערה: התקע קולגן אני נשאר שלם בתחתית זכוכית. העומק בין תחתית הזכוכית לבין הפלסטיק המקיף את תחתית הזכוכית שווה לעובי התקע.
   15. מניחים coverslip על קולגן אני תקע הר עם המדיום גובר polymerizing כדי למנוע את התקע מ ייבוש החוצה.
   16. השתמש מיקרוסקופ confocal הפוך לתמונה קולגן אני תקע; החלק העליון שלהתקע נמצא במגע עם משטח הזכוכית של המנה.
       1. לרכוש z- מחסנית מלמעלה למטה לתחתית קולגן אני תקע לדמיין הפלישה התא. לקבוע את עובי z- מחסנית ידי בחינת עד כמה עמוק לתאים לפלוש לשדה הדמיה. לבצע רכישות עם המטרה 40X שמן בפורמט 512 x 512 עם גודל צעד z של 0.25 מיקרומטר.
          הערה: עבור התייחסות, הממוצע z- מחסנית עבור MDA-MB-231 תאים 3 ימים לאחר זריעת הוא 30 מיקרומטר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות שילוב של שני סוגים של מטריצות, ג'לטין וסוג קולגן I ( איורים 1 ו -4 ), יש לנו הדגישו סוג חדש של invadosome, המכונה invadosomes ליניארי. תיוג של מטריצות אלה מאפשר תצפית של היווצרות invadosome ליניארית לאורך קולגן אני סיבים של יכולות השפלה של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

באופן קלאסי, invadosomes נלמדים במבחנה ללא קשר microenvironment ואת המטריצה ​​שבה התאים מצופים. כמה סוגים של מטריצות משמשים כיום, כולל ג'לטין, פיברונקטין, vitronectin, או בצפיפות גבוהה פיברילר קולגן (HDFC) ^{7 , 11} ; עם זאת, אלה הם לעתים קרובות לא נציג של mi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin solution	Sigma	G1393	Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate	Molecular probe life technologies	G13186	5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
Microscope cover glasses	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø12mm No.1
2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4	Electron microscopy science	15960	Dilute at 0.5 % in sterile water
1x PBS pH 7.4	Gibco by life technologies	10010-015	Use this PBS in all steps before fixation
Collagen I Rat tail	Corning	354236
5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester	Life technologies	C-6125
DPBS 1x + calcium + magnesium	Gibco by life technologies	14040-091
Paraformaldehyde 16% solution	Electron microscopy science	15710	Dilute at 4% in 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x PBS buffer pH 7.4	Ambion	AM9625	Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
Tks5 antibody	Santa Cruz	sc-30122	Invadosome markers Dilution : 1/100
Cortactin 4F11 antibody	Millipore	5180	Invadosome markers Dilution :1/100
DDR1 antibody	Cell signaling	5583	Linear invadosome receptor
Dilution :1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Fibrillary actin marker Dilution :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Nucleus marker Dilution :1/200
Secondary antibodies FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H or FP-647H
Albumin from bovine serum	Sigma	A2153	Dilute at 4% in 1X PBS
Fluoromount G mounting medium	Interchim	FP 483331
ImageJ software	Public domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Cell culture insert	Corning	353097	8.0µm pore size / 24 wells
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	221465