Matrici 2D e 3D per studiare formazione e attività lineare invazienti

Riepilogo

Questo protocollo descrive come preparare una matrice misti 2D, composta da gelatina e collagene I, e un collega di collagene 3D per studiare gli invasomi lineari. Questi protocolli consentono lo studio della formazione invasiva lineare, l'attività di degradazione della matrice e le capacità di invasione delle cellule primarie e delle linee cellulari del cancro.

Abstract

L'adesione cellulare, la migrazione e l'invasione sono coinvolti in molti processi fisiologici e patologici. Ad esempio, durante la formazione di metastasi, le cellule tumorali devono attraversare barriere anatomiche per invadere e migrare attraverso il tessuto circostante per raggiungere i vasi sanguigni o linfatici. Ciò richiede l'interazione tra le cellule e la matrice extracellulare (ECM). A livello cellulare, molte cellule, tra cui la maggior parte delle cellule tumorali, sono in grado di formare invasomi, che sono strutture a base di F-actin in grado di degradare ECM. Invadosomi sono strutture protettivali di actina che reclutano e attivano matrici metalloproteinasi (MMPs). La composizione molecolare, la densità, l'organizzazione e la rigidità del ECM sono cruciali nella regolazione della formazione invasiva e dell'attivazione. In vitro , un test di gelatina è il saggio standard utilizzato per osservare e quantificare l'attività di degradazione invadente. Tuttavia, la gelatina, che è denaturato il collagene I, non è una matrice fisiologica element. È stato sviluppato un nuovo saggio con fibrille di collagene di tipo I e utilizzato per dimostrare che questa matrice fisiologica è un potente induttore degli invasomi. Gli invadosomi che formano lungo i fibrille del collagene sono conosciuti come invadosomi lineari a causa della loro organizzazione lineare sulle fibre. Inoltre, l'analisi molecolare degli invasomi lineari ha mostrato che il recettore del dominio di discoidina 1 (DDR1) è il recettore coinvolto nella loro formazione. Questi dati dimostrano chiaramente l'importanza di utilizzare una matrice fisiologicamente rilevante al fine di comprendere le complesse interazioni tra le cellule e l'ECM.

Introduzione

La rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) si verifica durante processi fisiologici e patologici, come l'angiogenesi e l'invasione delle cellule tumorali. In condizioni fisiologiche, molti tipi di cellule, soprattutto dalla linea ematopoietica, sono in grado di degradare gli elementi di ECM. Ad esempio, i macrofagi sono in grado di attraversare barriere anatomiche per raggiungere i tessuti e gli osteoclasti degradano la matrice ossea per garantire l'omeostasi del calcio. Più in tutto il mondo, tutte le matrici del corpo rinnovano per mantenere le proprie proprietà fisiche e chimiche. Nei tessuti del cancro, la composizione del microambiente del tumore è alterata. Ad esempio, nel cancro al seno e nel polmone, il collagene di tipo I è sovraespresso e si accumula intorno al tumore. Inoltre, questo accumulo è associato ad un aumento del rischio di sviluppare metastasi ^{1 , 2} . La metastasi del cancro dipende dalla capacità delle cellule tumorali di degradare l'ECM e di invadere i tessuti adiacenti.

IlL'attività invasiva delle cellule è attribuita a strutture specializzate ricche di actina note come invadosomi. Questo termine comprende i podosomi e l'invadopodia, presenti rispettivamente nelle cellule normali e cancerose ( ad es. Macrofagi, cellule endoteliali e cellule tumorali come la linea cellulare MDA-MB-231). In vitro , gli invasori possono organizzare in forme diverse: punti, aggregati o rosette ³ . Classicamente, gli invasomi sono costituiti da un nucleo di F actin contenente diverse proteine, come la proteina Tks5 e la corattina, circondate da molecole di placca adesiva, come integrine e vincolina ⁴ . Recentemente, è stato dimostrato che Tks5 e RhoGTPase Cdc42 possono essere utilizzati come una firma molecolare minima per gli invasomi funzionali ⁵ . Queste strutture sono in grado di degradare l'ECM attraverso il reclutamento e l'attivazione di proteine ​​metalloproteasiche specifiche, come MT1-MMP e MMP-2 ⁶. In uno studio precedente, abbiamo riportato che l'interazione tra i fibrille di collagene di tipo I e il recettore del dominio discoidico 1 (DDR1), un recettore specifico di fibrille di collagene di tipo I, porta alla formazione di una nuova classe di invasomi, chiamati invadosomi lineari. Gli invasomi lineari sono formati lungo fibrille di collagene di tipo ⁷ . Queste strutture sono in grado di degradare fibrille di collagene di tipo I attraverso il reclutamento e l'attivazione di MT1-MMP / MMP2. Inoltre, la loro formazione dipende da Tks5 e Cdc42 ⁵ . In vitro abbiamo dimostrato l'esistenza di invadosomi lineari e il coinvolgimento di DDR1 nella loro formazione e nell'attività ⁸ usando strategie diverse costituite da una combinazione di vari elementi di matrice, tra cui: i) copertine fluorescenti rivestite in gelatina, ii) fibrille collagene fluorescenti di tipo I E iii) spine 3D di tipo collageno. A causa dell'utilizzo di diverse matrici, siamo stati in grado di studiare e di carattereÈ una formazione lineare invadente e la loro attività di degradazione ^{7 , 8} .

Infine, per comprendere meglio la biologia delle cellule invasive, è stata utilizzata una combinazione di componenti ECM in entrambi i sistemi di coltura 2D e 3D, simulando la complessità della composizione del microambiente tumorale. Di seguito sono riportati i protocolli per rivestimenti di rivestimento con collagene di gelatina / tipo I nei sistemi di coltura 2D e 3D.

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Protocollo

NOTA: Prima della fissazione, tutti i passaggi sono completati in un cappuccio flusso laminare sterile.

1. Matrice 2D

NOTA: le matrici 2D vengono utilizzate per determinare la percentuale di cellule che formano gli invasomi e l'area di degradazione della matrice per cellula.

Figura 1: Protocollo. Sintesi del protocollo utilizzato per preparare matrici di gelatina e collagene I. E 'possibile realizzare solo la matrice di gelatina o una matrice mista di collagene e gelatina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Matrice gelatina
   NOTA: Le matrici fluorescenti di gelatina sono utilizzate per quantificare la degradazione della matrice e la gelatina non fluorescente viene utilizzata per promuovere l'adesione delle fibre del collagene I. Stuoia di gelatina fluorescenteLe risaie sono utilizzate anche per gli studi di podosoma e di invadopodi (cfr. Figura 1 ).
   1. Sotto un cappuccio flusso laminare sterile, posizionare un pezzo di parafilm (20 cm x 15 cm) nell'area di lavoro e disinfettarlo con il 70% di etanolo.
   2. Aliquota 20 μL di gocce di 1 mg / ml di gelatina in una linea, distanziata di circa 1 cm di distanza; Fare riferimento alla Figura 1 per l'organizzazione di gocce.
   3. Coprire ogni gocce di gelatina da 20 μl con una copertura in vetro autoclavato (12 mm di diametro).
   4. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Se la gelatina è fluorescente, proteggerla dalla luce.
   5. Aliquota 40 μL di glicole di glutaraldeide di 0,5% in una soluzione salina a tampone fosfato (PBS) in una linea, ognuna distanziata di circa 1 cm sotto la linea di coperchio da punto 1.1.3.
      ATTENZIONE: La glutaraldeide è un agente fisico tossico. Usare guanti e non inalare.
   6. Utilizzando pinze jeweled, trasferire ogni coverlip rivestito di gelatina a una goccia di glutaraldeide.
      AnnotaloÈ normale che una piccola gocce di gelatina rimanga sul parafilm. Non riutilizzare questo per un altro esperimento.
   7. Incubare per 40 minuti a temperatura ambiente. Per i coperchi fluorescenti, proteggeli dalla luce.
   8. Prendere una piastra di coltura a 24 pozzetti e riempire ogni pozzetto con 500 μl di 1x PBS sterile. Posizionare i coperchi, con il lato di gelatina verso l'alto, in ciascun pozzetto.
   9. Lavare due volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuno.
      NOTA: A questo passo le copertine possono essere utilizzate per la sperimentazione o memorizzate in 1x PBS a 4 ° C. Le copertine non fluorescenti possono essere conservate per una settimana e le copertine fluorescenti possono essere memorizzate per 48 ore.
2. Fibra collagene tipo I matrice
   NOTA: La matrice di tipo I del collagene fibrillare è utilizzata per studiare la formazione invasiva lineare e la degradazione della matrice associata. Una combinazione di collagene fluorescenti e copertine di gelatina non fluorescenti viene utilizzata per colocalizzare marcatori invadenti con fibre collagene ( ad esempio, F-actin iN il canale lontano-rosso, il collagene I nel canale rosso, Tks5 nel canale verde e il colorante Hoechst per una macchia nucleare). D'altra parte, una combinazione di collagene I non fluorescente con copertine di gelatina non fluorescenti viene utilizzata per massimizzare il numero di marcatori invadenti macchiati ( ad esempio, F-actina nel canale lontano rosso, cortactina nel canale rosso, Tks5 in Il canale verde e il colorante Hoechst per una macchia nucleare). Infine, una combinazione di collagene I non fluorescente con coperchi fluorescenti di gelatina viene utilizzata per quantificare la degradazione associata alla gelatina ( ad es., F-actina nel canale lontano rosso, Tks5 nel canale rosso, nel canale verde, e Hoechst colorante Per una macchia nucleare) (vedi figura 1). Il colorante Hoechst è usato per macchiare il nucleo e controlla anche la contaminazione del miocoplasma, oltre ad una prova PCR eseguita regolarmente sulle linee cellulari utilizzate.
   1. Collagene fluorescente
      1. Utilizzare il collagene commerciale I estratto dal tendine del cervello in 0,02 N acetico aceticod. Togliere la quantità di collagene I necessaria per preparare 500 μL di soluzione per coperchio a una concentrazione finale di 0,4 mg / ml di collagene I.
      2. Aggiungere 5-carbossilato di rodamino succinimidil estere a una concentrazione finale di 10 μg / mL, calcolata per il volume finale della soluzione del collagene I (nx 500 μL).
      3. Mescolare la soluzione pipettando su e giù e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce.
      4. Diluire al volume finale con 1X Dosato di Fosfato-Buffered (DPBS) contenente calcio e magnesio e utilizzare direttamente.
   2. Copertina in fibra di collagene
      1. Utilizzare le copertine di gelatina non fluorescenti o fluorescenti precedentemente preparate nel punto 1.1.
      2. Preparare una soluzione di collagene I fluorescente o non fluorescente a una concentrazione finale di 0,4 mg / ml in 1 DPBS contenente calcio e magnesio.
      3. Aggiungere 500 μl di soluzione fluorescente o non fluorescente di collagene I perCopre in una piastra di coltura a 24 pozzetti.
      4. Incubare per 4 ore a 37 ° C per la polimerizzazione del collagene I.
      5. Dopo l'incubazione, rimuovere l'eccesso di collagene I inclinando la piastra e pipettando sul lato del pozzetto (non direttamente sulla copertura) per evitare di danneggiare la matrice.
         NOTA: Questa matrice non può essere memorizzata. Seed le cellule immediatamente dopo aver rimosso il collagene I in eccesso.

2. Sementi di cellule, tempo di coltura e fissazione

1. A seconda del tipo di cellula, preparare le cellule nel mezzo di coltura appropriato e aggiungere cellule per un volume finale di 500 μL per pozzetto.
2. Per caratterizzare la capacità di una linea cellulare di formare invadosomi lineari e di degradare la matrice, piastra le cellule per 4 h, 12 h e 24 h sulla matrice del collagene I per determinare la cinetica della formazione di invasomi lineari e dell'attività associata di degradazione.
   NOTA: la Tabella 1 contiene esempi di linee cellulariTestato in laboratorio.

   Linea cellulare	Numero di celle per coverlip	Tempo di contatto con la matrice per la quantificazione invasiva lineare	Tempo di contatto con la matrice per la quantificazione dell'attività invasiva di degradazione lineare
   MDA MB 231	40.000	4 h	12 h
   Huh7	40.000	12 h	24 h
   HEP 3B	40.000	12 h	24 h
   SNU 398	40.000	12 h	24 h
   NIH 3T3 src	30.000	4 h	12 h
   A431	50.000	6 h	24 h
   A549	40.000	12 h	24 h &# 160;
   CRUDO	40.000	12 h	12 h
   PAE	40.000	12 h	12 h

   Tabella 1: riferimento di fusione cellulare e di tempo di incubazione. Questa tabella presenta un elenco non esaustivo delle linee cellulari utilizzate per studiare gli invasomi lineari. Indica il numero di cellule da seminare sulla matrice, il tempo necessario per osservare gli invasomi lineari e il tempo necessario per osservare la degradazione della matrice associata. Gli invasori lineari hanno una durata breve. Per essere in grado di osservare gli invasomi lineari nel numero massimo di cellule, le cellule devono essere a contatto con la matrice del collagene I per un breve periodo di tempo. D'altra parte, per poter visualizzare la degradazione della gelatina riportata, le cellule devono essere in contatto con la matrice del collagene I per un periodo di tempo più lungo di quelle elencate in precedenza.
3. Dopo la rimozione del mezzo di coltura cellulare,Fissare le copertine per 10 minuti in 500 μl di 4% di paraformaldeide in 1X PBS.
4. Lavare due volte con 1x PBS.
5. Conservare a 4 ° C, protetto dalla luce.

3. Immunofluorescenza

1. Permeabilizzare le cellule per 10 minuti con una soluzione preparata di recente Di 0,2% di Triton X-100 in 1x PBS. Non riutilizzare questa soluzione.
2. Lavare le copertine due volte con 1x PBS.
3. Mettere un pezzo di parafilm (20 cm x 15 cm) sul banco.
4. Diluire l'anticorpo primario nel 4% di albumina bovina serba (BSA) in 1x PBS, come descritto nella tabella dei materiali .
5. Aliquota 50 μL goccioline di soluzione anticorpale primaria in una linea, ognuna distanziata di circa 1 cm di distanza.
6. Posizionare ciascuna copertina su una gocciolina.
7. Incubare per 40 min a temperatura ambiente, protetto dalla luce.
8. Dopo il periodo di incubazione, lavare due volte con 1x PBS.
9. Diluire l'anticorpo secondario, il phalloidin e il colorante Hoechst nel 4% di BSA in 1xPBS.
10. Aliquot 50 μL gocce del mix, ognuna distanziata circa 1 cm sotto la prima linea di copertine, come fatto in precedenza.
11. Posizionare ciascuna copertina su una gocciolina.
12. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce.
13. Dopo l'incubazione, lavare due volte con 1x PBS.
14. Lavare una volta con acqua distillata per rimuovere i sali.
15. Montare le copertine su una lastra di vetro con supporto di montaggio polimerizzante.
16. Lasciate che le copertine si asciugano durante la notte a temperatura ambiente, protette dalla luce, prima della microscopia.

4. Quantificazioni

Figura 2: Quantificazione lineare invasiva. La macro richiede immagini confocali di colorazione F-actina e Tks5 (formato: 1.024 x 1.024). ( A ) Innanzitutto apri l'immagine F-actin e fai una maschera. ( B ) Allora, apriL'immagine Tks5 e la soglia. Applica la macro. ( C ) I risultati analizzati compariranno in due tabelle. Il numero di invadosomi lineari per cella e altre informazioni, come l'area percentuale utilizzata dagli invasomi lineari nella cella, si trovano nella tabella Riepilogo. La dimensione di ogni invasore lineare si trova nella tabella Risultati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Percentuale di cellule che formano invadosomi lineari
   1. Contare le cellule che formano invadosomi lineari, circa 100 celle per copertina (usa triplicati tecnici). Quantificare almeno 300 cellule per n, con n = 3.
   2. Calcolare la percentuale di cellule che formano invadosomi lineari prendendo la media di tre esperimenti indipendenti, con conseguente 900 cellule quantificate.
2. Dimensione e numero invariato lineare per cella
   NOTA: utilizzare un microscopio confocale per eseguire immagini sequenziali delle macchie F-actin e Tks5. La macro è adattata a un formato di immagine di 1.024 x 1.024.
   1. Utilizza ImageJ con la macro supplementare.
3. Degradazione per cellula
   1. Utilizzare tre coverlips per condizione.
   2. Prendi 30 immagini per coperchio di gelatina fluorescente e nuclei colorati con Hoechst.
   3. Utilizzare il software ImageJ come descritto in Martin KH et al. ⁹ .

5. Saggio di invasione 3D del collagene

Figura 3: schema di analisi dell'invasione. Riepilogo del protocollo di dosaggio dell'invasione. Il collagene I è reticolato con colorante di estere succinimidile e polimerizzato per 1 ora a 37 ° C. Le cellule vengono aggiunte in un mezzo senza siero sulla spina del collagene I. L'inserto è collocato in mezzo wiIl 10% di FBS. I tappi del collagene I sono fissati 1 h dopo la semina di coltura nel controllo e 3 giorni dopo la semina delle cellule nella condizione sperimentale per determinare la capacità di invasione delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione del collageno I
   1. Fai un corso di tempo di 4 h, 12 h, 24 h, 48 h e 72 h per il primo esperimento per determinare la cinetica dell'invasione nel gel secondo il tipo di cellula. Per ogni esperimento, aggiungi un punto temporale di 1 ora come punto di riferimento quando non si verifica alcuna invasione.
   2. Preparare la soluzione del collagene I sul ghiaccio sotto un cappuccio flusso laminare sterile. Preparare 500 μL di soluzione per 3 inserti della camera Boyden.
   3. Aspirare 1 mg di collagene I di ratto-coda commerciale per preparare una soluzione con una concentrazione finale di 2 mg / ml collagene I.
   4. Aggiungere l'estere 5-carbossilico di rodamina succinimidilico aUna concentrazione finale di 1 μg / mL, calcolata per il volume finale della soluzione del collagene I (in questo caso, 500 μL).
   5. Mescolare bene e incubare per 5 minuti su ghiaccio sotto il cappuccio flusso laminare sterile, protetto dalla luce.
   6. Aggiungere 50 μl di ghiaccio freddo, filtrato 10 volte PBS e 6,25 μl di ghiaccio freddo 1 M di idrossido di sodio (NaOH).
   7. Aggiungere acqua sterile secondo la formula 443,75 - x μL del collagene I.
   8. Aggiungere 100 μL di soluzione per l'inserto della camera Boyden.
   9. Incubare per 1 ora a 37 ° C per consentire la polimerizzazione.
   10. Aggiungere un mezzo di coltura cellulare arricchito con siero fetale fetale (FBS) in nuovi pozzetti; Inserire gli inserti in questi pozzetti.
   11. Seed 30.000 cellule in cima al collagene I plug in mezzo libero FBS.
   12. Dopo aver coltivato le cellule a 37 ° C, fissare il collageno I per 30 minuti in 4% di paraformaldeide in 1x PBS.
   13. Completa immunofluorescenza come al punto 3, ad eccezione delle seguenti fasi: permeabiliZe con 0,2% Triton X-100 in 1x PBS per 30 minuti, non 10 min; Incubare con soluzioni anticorpali primarie e secondarie per 1,5 ore ciascuna, anziché 40 min e 30 min, rispettivamente. Macchiare F-actina o nuclei per localizzare le cellule.
   14. Dopo l'immunofluorescenza, utilizzare un bisturi per tagliare la membrana dell'inserto e trasferire accuratamente la spina del collagene I verso un piatto in vetro. Assicurarsi che la parte superiore del collageno I sia in contatto con il vetro. Mantenere la membrana dell'inserto attaccata al fondo della spina del collagene I per mantenere l'integrità della spina.
       NOTA: La spina del collageno I rimane intatta nel piatto di vetro. La profondità tra il fondo del vetro e la plastica che circonda il fondo di vetro è equivalente allo spessore della spina.
   15. Inserire un coperchio sul collageno I e montare con il supporto di polimerizzazione per evitare che la spina si asciughi.
   16. Utilizzare un microscopio confocale invertito per l'immagine del collageno I; La cima diLa spina è in contatto con il fondo del vetro del piatto.
       1. Acquisisci una z-stack dall'alto verso il basso del plug del collagene per visualizzare l'invasione cellulare. Determinare lo spessore dello z-stack esaminando come profondamente le cellule invadono il campo di imaging. Esegui le acquisizioni con un obiettivo olio 40X in un formato 512 x 512 con una dimensione z-step di 0,25 μm.
          NOTA: Per riferimento, lo z-stack medio per le cellule MDA-MB-231 3 giorni dopo la semina è di 30 μm.

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Risultati

Utilizzando una combinazione di due tipi di matrici, gelatina e collagene di tipo I ( figure 1 e 4 ), abbiamo evidenziato un nuovo tipo di invasione, conosciuto come invadosomi lineari. L'etichettatura di queste matrici permette l'osservazione della formazione invasima lineare lungo le fibre del collagene I e delle loro capacità di degradazione ( Figura 5 ). Il numero di strutture invasive può quindi essere quantificato dalla m...

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Discussione

Classicamente, gli invasomi sono studiati in vitro senza riguardo al microambiente e alla matrice su cui sono plasmate le cellule. Attualmente vengono utilizzati diversi tipi di matrici, tra cui gelatina, fibronectina, vitronetina o collagene fibrillare ad alta densità (HDFC) ^{7 , 11} ; Tuttavia, queste non sono spesso rappresentative del microambiente in cui le cellule risiedono e non sono fisiologicamente rilevanti. Qui è stato utilizzato un nuovo tip...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin solution	Sigma	G1393	Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate	Molecular probe life technologies	G13186	5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
Microscope cover glasses	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø12mm No.1
2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4	Electron microscopy science	15960	Dilute at 0.5 % in sterile water
1x PBS pH 7.4	Gibco by life technologies	10010-015	Use this PBS in all steps before fixation
Collagen I Rat tail	Corning	354236
5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester	Life technologies	C-6125
DPBS 1x + calcium + magnesium	Gibco by life technologies	14040-091
Paraformaldehyde 16% solution	Electron microscopy science	15710	Dilute at 4% in 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x PBS buffer pH 7.4	Ambion	AM9625	Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
Tks5 antibody	Santa Cruz	sc-30122	Invadosome markers Dilution : 1/100
Cortactin 4F11 antibody	Millipore	5180	Invadosome markers Dilution :1/100
DDR1 antibody	Cell signaling	5583	Linear invadosome receptor
Dilution :1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Fibrillary actin marker Dilution :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Nucleus marker Dilution :1/200
Secondary antibodies FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H or FP-647H
Albumin from bovine serum	Sigma	A2153	Dilute at 4% in 1X PBS
Fluoromount G mounting medium	Interchim	FP 483331
ImageJ software	Public domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Cell culture insert	Corning	353097	8.0µm pore size / 24 wells
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	221465